尹志娜，趙雯瑋，王珊珊，朱肖翔，朱紅波，曹葉偉，譚宇凡，范雪瑩，羅小菊，龍?zhí)┤A

（1.廣東藥科大學公共衛(wèi)生學院，廣東廣州 510006）（2.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院，西藏拉薩 850000）

牦牛（yak）因其能夠適應極端惡劣的條件，如寒冷和缺氧，長期以來一直是高原山區(qū)畜牧業(yè)的主要畜類資源之一。我國的牦牛資源非常豐富，占全世界牦牛總數(shù)的95%以上，主要分布于甘肅青海、四川阿壩、西藏自治區(qū)等擁有高山地貌的地區(qū)[1]。牦牛肉蛋白質(zhì)和微量元素含量豐富[2]，必需氨基酸的得分與聯(lián)合國糧農(nóng)組織和WHO推薦的氨基酸模式接近[3]。同時牦牛生長于綠色無污染的天然放牧環(huán)境，幾乎不含有害成分，具有極好的營養(yǎng)價值，又因特殊地理環(huán)境產(chǎn)量極低，故被譽為牛肉之冠，價格昂貴[4]。大量的投機者以甘肅集中舍飼牦牛或普通牛肉甚至是其他肉源冒充牦牛肉或者牦牛制品獲利，導致牦牛肉及其產(chǎn)品成為廉價物品。假冒偽劣牦牛肉及其制品營養(yǎng)與真實牦牛肉相差甚遠（圖1）。西藏牦牛肉形象驟降，直接或間接對西藏特色產(chǎn)品對外輸出產(chǎn)生的經(jīng)濟價值造成巨大影響。目前已經(jīng)有相應的熒光定量PCR的方法能夠精確識別真假牦牛肉以及是否摻入其他源性成分。但西藏特殊地域環(huán)境導致本地大多為小規(guī)模的散養(yǎng)企業(yè)，高成本的熒光定量PCR方法無法有效落地和推廣。同時，此法只能判定樣品是否為牦牛肉，無法判定其是否屬于西藏無污染散牧牦牛肉及其制品。

圖1 牦牛肉與普通牛肉營養(yǎng)價值對比Fig.1 Comparison of nutritional value between yak beef and common beef

飼料中含有大量的農(nóng)作物剩余材料，如谷殼，麩皮或秸稈等。農(nóng)耕過程中所使用農(nóng)藥會隨著飼料進入動物體內(nèi)[5]。同時，為了提高出欄率，縮短飼養(yǎng)周期，集約養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用和亂用，直接導致我國市場上獸藥殘留超標產(chǎn)品層出不窮。而大量的研究表明農(nóng)藥和獸藥殘留與各種疾病的發(fā)生具有顯著相關性。指引中國居民正確選擇健康優(yōu)質(zhì)的食品，是提高國民健康水平的重要舉措。本課題選擇了幾種典型的農(nóng)藥和獸藥作為檢測對象，根據(jù)現(xiàn)有國家標準方法，對采集的西藏和廣州地區(qū)的牦牛肉樣品進行檢測和分析[6,7]，并討論其是否可以輔助熒光定量PCR鑒定真假藏區(qū)散養(yǎng)牦牛肉及制品，或具有同等營養(yǎng)價值產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 樣品采集信息

樣品采集信息見表1所示。

表1 樣品編號與采集地信息表Table 1 Sample number and collection site information table

1.2 原料與試劑

丙酮、木酒精、乙腈、正己烷、1-丙醇，液相色譜級；乙酸銨溶液、乙酸乙酯、三氟乙酸，分析純；EDTA-Mcllvainc緩沖液；甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素標準物質(zhì)；土霉素、四環(huán)素、金霉素以及強力霉素標準品，購自阿拉丁試劑有限公司。動物組織核酸提取試劑盒（批號：70089），廣東深圳澳東檢驗檢測科技有限公司。

1.3 主要儀器設備

SCIEX 4000 Q TRAP液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，愛博才思；3K15離心機，北京博勵；ME204E/02電子天平，廣州東南科創(chuàng)；N50超微量紫外分光光度計，德國Implen Nano Photometer；7900實時熒光PCR儀，ABI公司；高速臺式冷凍離心機，奧豪斯；LC20ADXR凝膠滲透色譜儀，島津；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、均質(zhì)器、氮氣吹干儀、帶有柱后衍生反應裝置和熒光檢測器（FLD）的液相色譜儀、高速勻漿機、渦旋振蕩器、氮吹儀。

1.4 試驗方法

毒死蜱，多菌靈和樂果含量測定：根據(jù)GB/T 20772-2008方法進行檢驗。

克百威含量測定：根據(jù)GB/T 23200.112-2018方法進行檢驗。

雙甲脒含量測定：根據(jù)農(nóng)業(yè)部781號公告-8-2006方法進行檢驗。

四環(huán)素類含量測定：根據(jù)GB/T 21317-2007方法進行檢驗。

氯霉素類含量測定：根據(jù)GB/T 22338-2008方法進行檢驗。

1.5 牦牛源性成分檢測

用核酸試劑盒提取核酸后以三重定量PCR試劑盒對牦牛肉源性成分進行檢測。反應體系：檢測管中核酸擴增反應液v2，20 μL；牛源性反應液，2 μL；HS-Taq酶，1 μL；樣品DNA，2 μL。陽性對照管中核酸擴增反應液v2，20 μL；牛源性反應液，2 μL；HS-Taq酶，1 μL；牛源性陽性對照，2 μL。陰性對照管中核酸擴增反應液v2，20 μL；牛源性反應液，2 μL；HS-Taq酶，1 μL；陰性對照液，2 μL。

擴增步驟參數(shù)：預變性溫度95 ℃，3 min；變性溫度95 ℃，5 s；退火/延伸60 ℃，40 s；40個循環(huán)。熒熒光信號采集設置于退火/延伸時。對于多通道熒光PCR檢測儀，黃牛源性選擇熒光素FAM作為信號采集通道，而牦牛源性則選擇熒光素ROX為信號采集通道，淬滅基團選None，染料校正選None。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗至少重復3次，實驗結(jié)果用平均值±標準差表示。采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS 19.0進行one-way ANOVA單因素分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 五種農(nóng)藥檢測

實驗結(jié)果顯示（表2），12份隨機樣本均為檢出克百威和雙甲脒。克百威是廣譜、高效、低殘留、高毒性的氨基甲酸酯類殺蟲、殺螨、殺線蟲劑，在土壤中半衰期為30～60 d，常用于谷類和豆類農(nóng)作物[8,9]。因谷豆加工過程中的副產(chǎn)物，如麩皮，稻糠，豆粕及秸稈等是動物飼料的主要成分[10-12]，故其可通過飼料喂養(yǎng)進入養(yǎng)殖動物體內(nèi)，而動物屠宰前農(nóng)藥殘留未降解或未被代謝出體外，就會導致肉制品中農(nóng)藥殘留超標[13]。通過表2可知，本地普通飼養(yǎng)牛肉和西藏自然放牧牦牛肉中無克百威檢出。分析原因主要有：（1）現(xiàn)代化飼料制作多應用發(fā)酵技術[14]，發(fā)酵過程中克百威可能被生物降解[15]；（2）噴灑在植物中的農(nóng)藥自然環(huán)境中被微生物降解[16-18]；（3）進入動物體內(nèi)后隨著新陳代謝排出體外[19]；（4）可能積蓄于肌肉以外部位[19]。雙甲脒廣譜性殺螨劑，主要用于果樹、棉花、蔬菜等作物防治螨類，還可用于牛、羊等牲畜防治蜱螨。本實驗并未檢測到雙甲脒成分，分析原因可能為國家對此類毒性較強的農(nóng)藥監(jiān)管力度增大，其使用越來越規(guī)范。如嚴格按照休藥期時間停止用藥。能不用此類農(nóng)藥盡量不用，采用毒性較弱，環(huán)境友好性更好的農(nóng)藥種類替代。

表2 不同牛肉樣本中毒死蜱、多菌靈和樂果含量結(jié)果Table 2 Results of pyrifos, carbendazim and dimethoate content in different beef samples

經(jīng)檢測，樂果、多菌靈和毒死蜱三種農(nóng)藥檢測結(jié)果均未超過國家標準。藏區(qū)樣本1～6號和廣州樣本8號均未檢出。廣州采集的7號和9～12號樣本有不同程度的檢出量。分別為：9號樣品毒死蜱含量為50.44 μg/kg；多菌靈含量為0.68 μg/kg；樂果含量為7.64 μg/kg。10號樣品毒死蜱含量為38.87 μg/kg；多菌靈含量為0.59 μg/kg；樂果含量為4.94 μg/kg。11號樣品毒死蜱含量為41.10 μg/kg；多菌靈含量為0.58 μg/kg；樂果含量為7.29 μg/kg。12號樣品經(jīng)毒死蜱含量為60.91 μg/kg；多菌靈含量為0.76 μg/kg；樂果含量為6.23 μg/kg。目前中外研究報道，尚未發(fā)現(xiàn)有關西藏牦牛肉與內(nèi)地飼養(yǎng)牛肉的獸藥殘對比分析探討，只有少量關于不同在肉制品中農(nóng)藥殘留的對比分析，如李華等[20]用多壁碳納米管-氣相色譜檢測了市售的豬、牛、羊肉肉制品的11種有機磷農(nóng)藥。其中敵敵畏、乙酰甲胺磷、氧化樂果、治螟磷、樂果、馬拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、殺撲磷、三唑磷、亞胺硫磷含量分別為0.10、0.19、0.06、0.10、0.05、0.08、0.05、0.12、0.02、0.01、0.04 mg/kg。與本實驗結(jié)果對比可知，毒死蜱結(jié)果吻合，但樂果含量相差10倍。毒死蜱是檢測出的殘留含量最大的農(nóng)藥，推測有以下幾點原因：首先，毒死蜱在中國推廣和使用是當時的市場急需取代諸如甲胺磷、甲基對硫磷等高度禁用農(nóng)藥。由于禁用通告的出現(xiàn)，大量低毒的農(nóng)藥紛紛在市場上占據(jù)份額。毒死蜱的登記品種就從2006年的215個，到2010年的1100個，以每年約10%的速度遞增[10]。其次，毒死蜱的化學結(jié)構決定了它的強疏水性，當使用毒死蜱后，可能通過徑流等途徑污染水環(huán)境，還可迅速從水中析出從而富集在土壤中，影響生態(tài)環(huán)境。由于毒死蜱高效低毒的特性，它已經(jīng)成為全球使用最廣泛的殺蟲劑之一，全球都有它的蹤跡。這些因素導致了毒死蜱的檢出率居高不下。毒死蜱作為高效農(nóng)藥，常作為農(nóng)作物的農(nóng)藥使用，而副產(chǎn)物如麩皮、秸稈等殘留會以飼料進入動物體內(nèi)。

2.2 抗生素檢測

抗生素是畜禽養(yǎng)殖過程中常用的獸藥。本實驗對牛肉樣本中幾種四環(huán)素類和氯霉素類抗生素的殘留量做了檢測。結(jié)果如表3所示：12份樣本氯霉素均無檢出，說明我國對抗生素濫用亂用的治理收到顯著效果。1～6號樣本均無甲砜霉素、氟苯尼考、金霉素和強力霉素殘留，7～12號樣本均有上述抗生素殘留。土霉素除了1、5、6號樣本沒有殘留，其余均有不同程度的殘留。而四環(huán)素除了2、3、5、10、11號樣本，其余均有少量殘留。從整體上看，除土霉素和四環(huán)素外，其余幾種抗生素的1至6號樣本和7至12號樣本有明顯差異性。1至5號樣本是來自西藏拉薩市、那曲市、日喀市的放牧牛肉。而6至12號樣本是舍飼飼養(yǎng)的牛肉，說明舍飼方法的牛肉抗生素含量比西藏牦牛肉含量高。

西藏位于我國的西北部，地域遼闊，毗鄰高原，平均海拔高，早晚溫差大，陽光充足，其中拉薩市更是有“日光城”的美名。西藏牦牛肉的食用高不僅體現(xiàn)在優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和微量元素豐富，同時，幾乎不含有農(nóng)藥殘留和獸藥殘留，也是其促進人體健康的主要原因。而集中飼養(yǎng)的牛肉為了提高出欄率，往往人為添加到飼料或者直接注射各種化學成分，如抗生素?？股貧埩舻脑蛞话闳缦拢阂皇侵行⌒宛B(yǎng)殖場的養(yǎng)殖戶的防疫意識不夠，防疫設備不齊全，消毒沒有做到位，環(huán)境條件簡陋惡劣等因素，增加肉牛患病的風險。如冬季時，氣溫低、牛舍衛(wèi)生臟亂、肉牛的保暖措施不到位，免疫力下降，大腸桿菌、沙門菌等入侵胃腸道，就會引起胃腸道疾病，常用到抗生素給予治療。二是部分中小型養(yǎng)殖場沒有配備獸醫(yī)、有經(jīng)驗的養(yǎng)殖人員或者獸醫(yī)的資質(zhì)不夠、專業(yè)知識不牢固，在牛群發(fā)生疾病或者出現(xiàn)嚴重傳染病時盲目使用抗生素，類似藥物劑量使用不準確、給藥的途徑錯誤或者搭配藥物不當?shù)?，進而促進、加重畜禽的感染程度和引起藥物代謝不徹底，在牛體內(nèi)的各個臟器慢慢蓄積。三是四環(huán)素類獸用抗生素作用明顯、價格低廉、來源易得，有時為了不減慢初生牛犢的成長速度，很多的養(yǎng)殖戶會在飼料中添加土霉素、金霉素等抗生素促進牛成長。但對比7和8號樣本，來自同一市場的一種普通黃牛，一種品牌優(yōu)質(zhì)黃牛，兩者的抗生素均有明顯的差異性。品牌黃牛中的抗生素多于普通黃牛。原因可能是該品牌的黃牛養(yǎng)殖過程中使用添加了抗生素的飼料，來預防醫(yī)治疾病和促進黃牛成長，保障黃牛的健康，提高產(chǎn)量。

2.3 牦牛源性成分檢測結(jié)

已知1～6號采自西藏地區(qū)，7～12號采自廣州地區(qū)。通過三重熒光定量PCR檢測方法得到（如表4和圖2所示）：1～6號為牦牛肉，7～12號為黃牛肉。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8號樣品雖然為黃牛源的偽牦牛肉，但是三種農(nóng)藥參留量同樣未檢出，且為同等營養(yǎng)價值的綠色無污染養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)黃牛肉。經(jīng)來源追溯，其為潮汕某牧場散養(yǎng)黃牛肉。其生長環(huán)境也屬于綠色無污染放牧環(huán)境，價格為160～180元/kg，與牦牛肉的市價相近。其余的肉制品三種農(nóng)藥參留量基本與牦牛肉真?zhèn)涡越Y(jié)果一致。以三種農(nóng)藥參留作為預判斷牛肉是否為西藏自然放牧牦牛肉的吻合率達到91.67%，對于評估優(yōu)質(zhì)牛肉，吻合率達到100%，因此此方法不會對綠色產(chǎn)品的等級造成影響。以上結(jié)果說明農(nóng)藥殘留的檢測對牛肉的品級和種類分類具有一定的參考價值。即達到農(nóng)藥殘留未檢出標準的產(chǎn)品，一般被認為其為質(zhì)量較好的產(chǎn)品。人工飼養(yǎng)的黃牛中由于飼養(yǎng)方式和飼料來源的不同，牛肉中檢出的農(nóng)藥含量也各不相同。8號樣品為品牌優(yōu)質(zhì)黃牛肉，其中所有農(nóng)藥的殘留含量均為超出檢出限，說明科學使用農(nóng)藥，給肉牛提供清潔的飼養(yǎng)環(huán)境，這些都可以使牛肉中的農(nóng)藥殘留降到很低的標準?，F(xiàn)今肉牛養(yǎng)殖場的大小不一，分布不均，管理起來也難以面面俱到。品牌的肉牛飼養(yǎng)通常在大規(guī)模的養(yǎng)殖場進行。養(yǎng)殖場的批準需要當?shù)丨h(huán)境部門的批準，要進行非常嚴格的生態(tài)環(huán)境審核。對空氣、水質(zhì)和土壤等都需要進行理化檢驗，才能確定是否適宜作為養(yǎng)殖場。除了環(huán)境部門的參與，當?shù)氐男竽敛块T也會參與養(yǎng)殖場的設立。依據(jù)實際情況和肉牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀，因地制宜制定肉牛不同生長發(fā)育階段的養(yǎng)殖管理方案，下發(fā)給養(yǎng)殖戶要求嚴格執(zhí)行。

表4 實時熒光PCR檢測鑒定表Table 4 Real-time PCR detection and identification table

圖2 牛肉鑒別實時熒光PCR熒光曲線Fig.2 Fluorescence curve of real-time PCR for beef identification

通過實驗可知目前市售的牛肉制品的農(nóng)藥殘留量和獸藥殘留量基本屬于安全級別，即符合國家標準的殘留標準。但是跟其他國家比較我國標準對于劑量的要求是比較低的。以毒死蜱為例，我國與CAC要求的MRL值一致，為1 mg/kg，日本的MRL值為中國的一半0.5 mg/kg，歐盟的限量標準最低為0.05 mg/kg。隨著我國農(nóng)藥殘留和獸藥殘留檢測方法的更新和管理制度與手段的提升，農(nóng)藥和獸藥的殘留標準線可以向發(fā)達國家發(fā)展。

本實驗中毒死蜱的檢出率為41.7%，檢出范圍為32.11～61.38 μg/kg。1～6號藏區(qū)牦牛樣品和8號優(yōu)質(zhì)黃牛的毒死蜱殘留含量低于檢出限。含量最高的是12號偽牦牛制品（實為水牛），60.91 μg/kg。本實驗的幾種農(nóng)藥和獸藥殘留國家標準限量[21,22]：毒死蜱、多菌靈、樂果、克百威、雙甲脒、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素含量分別為：1、0.05、0.05、0.05、0.05、0、0.05、0.2、0.2、0.2、0.2、0.1 mg/kg。CAC標準對氟苯尼考、土霉素、四環(huán)素、金霉素限量要求均為是0.4 mg/kg。7、9、10、11、12號樣品的檢出含量均符合國家標準MRL和CAC標準MRL所規(guī)定的1.00 mg/kg，但高于日本的最大殘留限量0.5×10-6。9號樣品和12號樣品高于歐盟MRL規(guī)定的0.05 mg/kg。5種超過檢出限的樣品的國家標準的人體每日容許攝入量（ADI），長期攝入會對人體造成損害。本實驗中多菌靈檢出率為41.7%，檢出范圍為0.53～0.79 μg/kg。1～6號藏區(qū)牦牛樣品和8號優(yōu)質(zhì)黃牛的多菌靈殘留含量低于檢出限。含量最高的是12號偽牦牛制品（實為水牛）0.76 μg/kg。7、9、10、11、12號樣品的檢出含量均符合國家標準MRL和CAC標準所規(guī)定的0.05 mg/kg以及歐盟標準MRL所規(guī)定的0.1 mg/kg，但高于日本的最大殘留限量0.1 mg/kg。本實驗中樂果檢出率為41.7%，檢出范圍為4.18～8.12 μg/kg。1～6號藏區(qū)牦牛樣品和8號優(yōu)質(zhì)黃牛的樂果殘留含量低于檢出限。含量最高的是11號普通黃牛7.29 μg/kg，7、9、10、11、12號樣品的檢出含量均符合國家標準MRL和CAC標準所規(guī)定的0.05 mg/kg。歐盟標準MRL為禁止檢出，5種樣品高于國家標準的人體每日容許攝入量和日本的最大殘留限量0.05 mg/kg。不同地區(qū)或者國家的農(nóng)藥殘留限量標準可以在一定程度上反映出法律水平或者當?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)制度與條件。其中CAC標準是被各國普遍認可的標準?？税偻碗p甲脒在我國與歐盟的MRLs中都為0.05 mg/kg，其中雙甲脒含量仍高于日本的MRL為0.09 mg/kg[23,24]。由于熒光定量PCR法對于儀器、實驗條件和操作人員的要求比較高，成本比較大，西藏牦天然牦牛肉和飼料牦牛肉以及其他偽牦牛的區(qū)分存在很大難度。本實驗測定的幾種農(nóng)藥殘留和獸藥殘留或許可作為輔助鑒別西藏自然放牧牦牛真?zhèn)蔚膮⒖家罁?jù)。

3 結(jié)論

牦牛于自然無污染高原環(huán)境放牧，其肉制品營養(yǎng)價值極高，且基本無農(nóng)藥和獸藥殘留檢出，對人體健康具有非常好的促進作用。以熒光定量PCR方法顯示1～6號為西藏牦牛樣本，其農(nóng)藥殘留結(jié)果與樣本是否屬于西藏牦牛樣本吻合。本實驗所測幾種農(nóng)藥殘留和獸藥殘留可以對牦牛肉摻假的監(jiān)管提供現(xiàn)實參考依據(jù)。