黃健祥，謝書越，唐雪妹，黃聰靈，萬凱

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室（廣州），國家農(nóng)業(yè)檢測基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室（農(nóng)藥殘留），廣東廣州 510640）

豇豆俗稱豆角、長豆角，是一類涉及千家萬戶、量大面廣的食用農(nóng)產(chǎn)品，在豐富人們菜籃子方面起著重要的作用[1,2]。豇豆在廣東省多個地區(qū)均有廣泛種植[3,4]，屬于連續(xù)采摘的蔬菜且病蟲害頻發(fā)，在華南地區(qū)濕熱氣候下尤其嚴(yán)重[5]。日常管理耗費(fèi)的人力成本高，依賴農(nóng)藥防控比較普遍，其質(zhì)量安全情況長期備受關(guān)注[6,7]。但化學(xué)防治目前仍然是最方便、最穩(wěn)定、最有效、最可靠、最經(jīng)濟(jì)的防治方法[8,9]。濫用、亂用、不遵守安全間隔期、使用高毒禁用農(nóng)藥等不科學(xué)不規(guī)范的使用行為，可能會導(dǎo)致豇豆中農(nóng)藥殘留超標(biāo)、食用風(fēng)險過高等問題[10]，如2010年海南的豇豆質(zhì)量安全事件就一度引發(fā)了消費(fèi)者恐慌[11]。近年來，豇豆中農(nóng)藥殘留仍是頻頻出現(xiàn)問題的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全軟肋之一[12]。滅蠅胺（用作獸藥時稱為環(huán)丙氨嗪）化學(xué)名N-環(huán)丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一種新型的三嗪類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑[13]，能干擾雙翅目幼蟲和蛹在發(fā)育過程中的正常生長從而防治蟲害[14,15]；也可用在養(yǎng)殖業(yè)上用以控制蒼蠅[16,17]。滅蠅胺常用來防治豇豆生長過程中的蟲害美洲斑潛蠅（俗名“鬼畫符”，圖1）。它具有內(nèi)吸性，在植物體內(nèi)有較強(qiáng)的傳導(dǎo)性；施到土壤中由根系吸收、向頂傳導(dǎo)[18]。滅蠅胺在豇豆生產(chǎn)中大量被使用，有時會造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題[19]。與此同時，滅蠅胺在豇豆上未登記，缺乏科學(xué)的用藥指引，需要重點(diǎn)關(guān)注。因此，有必要開發(fā)一種簡便、快速、準(zhǔn)確的分析方法，為豇豆的質(zhì)量安全監(jiān)測提供高效的技術(shù)支撐。

圖1 美洲斑潛蠅危害的豇豆葉片F(xiàn)ig.1 Cowpea leaves damaged by Liriomyza sativae Blanchard

滅蠅胺極性比較強(qiáng)，可溶于水，多農(nóng)殘的前處理方法往往不能很好地將其提取，影響回收率[20]。目前，滅蠅胺分析中常見的前處理技術(shù)有固相萃?。⊿olid Phase Extraction，SPE）[21-23]、分散固相微萃?。―ispersive Micro Solid Phase Extraction，DMSPE）[24]、QuEChERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）[25]等，檢測以液相法[26]、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[27,28]為主。液相法靈敏度較低且容易受到干擾，所需的前處理過程往往比較繁瑣費(fèi)時[29]；液相色譜-質(zhì)譜法抗干擾性強(qiáng)、靈敏度高、通量高，常見挑戰(zhàn)是滅蠅胺的回收率低和樣品的基質(zhì)效應(yīng)。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究者嘗試了同位素內(nèi)標(biāo)法、加水提取后定容[30]、加酸提取[31,32]等方法。本研究建立了一種基于QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）的豇豆中滅蠅胺高效分析方法。優(yōu)化了提取溶劑等條件，在乙腈中加入φ=15%的乙酸提升滅蠅胺的提取率；使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量，降低豇豆樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響；對方法進(jìn)行了確認(rèn)并應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析；進(jìn)行膳食暴露風(fēng)險評估，探明豇豆中滅蠅胺的食用風(fēng)險；研究滅蠅胺殘留在豇豆中的降解動態(tài)，為風(fēng)險評估和預(yù)警提供技術(shù)支撐和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8060液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；SiO-6512 QuEChERS自動樣品制備系統(tǒng)，浙江本立科技股份有限公司；Multi Reax高速渦旋儀，德國Heidolph公司；高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水儀，Merk Millipore公司。

1000 mg/L滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度≥99.5%），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；乙腈、甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸（純度99%），冰乙酸（純度99%），甲酸銨（純度≥99.0%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaCl、無水MgSO4，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；PSA吸附劑（40～60 μm），GCB吸附劑（40～120 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司；尼龍66濾膜（0.22 μm），天津津滕公司。

112份豇豆鮮樣來源于本地流通市場，覆蓋農(nóng)貿(mào)市場、超市、連鎖生鮮店、流動小攤檔等各類場所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取10.00 g樣品于50 mL塑料離心管中，加入10.00 mL乙腈（含體積分?jǐn)?shù)15%的乙酸）、1.0 g NaCl、4.0 g無水MgSO4和5顆陶瓷均質(zhì)子，使用振蕩離心一體化裝置在1000 r/min下振蕩2 min后以4500 r/min離心5 min；吸取上清液5.00 mL于15 mL塑料離心管中，管中加入15 mg GCB、150 mg PSA和835 mg無水MgSO4，渦旋振蕩1 min后以4500 r/min離心5 min；取1 mL上清液過0.22 μm尼龍濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與基質(zhì)效應(yīng)

準(zhǔn)確量取適量滅蠅胺的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，以空白樣品提取液稀釋成0.005、0.010、0.050、0.10、0.50和1.00 mg/L基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時以乙腈（含體積分?jǐn)?shù)15%的乙酸）稀釋配置溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME），計(jì)算公式如下：

式中：

E——基質(zhì)效應(yīng)（ME）；

Sm——基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

Ss——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

當(dāng)ME為-20%～20%時，可以忽略。

1.2.3 LC-MS/MS檢測條件

1.2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：島津Shim-pack XR-ODS III（50 mm×2.0 mm，1.6 μm）；流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；柱溫：40 ℃。色譜梯度洗脫程序：0～2.5 min，5%～30% B；2.5～2.6 min，30%～5% B；2.6～4 min，5% B。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

霧化氣：3.0 L/min，干燥氣：10 L/min，加熱氣：10 L/min；離子源接口溫度：300 ℃，加熱塊溫度：400 ℃，脫溶劑溫度：250 ℃；采用ESI離子源，正源掃描多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式。滅蠅胺的質(zhì)譜檢測參數(shù)如表1所示。

表1 滅蠅胺的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters for the detection of cyromazine

1.2.4 添加回收試驗(yàn)

稱取10.00 g樣品于50 mL塑料離心管中，加入適量滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩、渦旋混勻后在4 ℃下靜置15 h。添加濃度為0.010、0.10、0.50和1.00 mg/kg。

1.2.5 膳食暴露風(fēng)險評估

我國規(guī)定豇豆中滅蠅胺的最大殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）為0.5 mg/kg[33]。同時使用膳食攝入風(fēng)險評估方法進(jìn)行評價，豇豆中滅蠅胺殘留的長期攝入風(fēng)險以風(fēng)險熵（Risk Quotient，RQ）表示。風(fēng)險熵RQ（%）采用下列公式計(jì)算[34,35]：

式中：

E——估算每日攝入量（National Estimated Daily Intake，NEDI），mg/(kg·d)；

Q——風(fēng)險熵（Risk Quotient，RQ），%；

Ci——豇豆樣品中滅蠅胺的陽性樣品檢出平均值或滅蠅胺在我國已登記作物上的MRL，mg/kg；

Fi——一般人群對該種食物的攝入量[35]，kg·person-1·d-1；

bw——取值63 kg·person-1[36]；

A——每日允許攝入量[33]，（Acceptable Daily Intake，ADI），mg/(kg·d)。

當(dāng)國家估算每日攝入量（National Estimated Daily Intake，NEDI）低于每日允許攝入量時，可認(rèn)為滅蠅胺殘留產(chǎn)生的健康風(fēng)險可以接受。即RQ越小，風(fēng)險越低。

1.2.6 滅蠅胺在豇豆中的消解動態(tài)試驗(yàn)

選取檢出殘留值高于滅蠅胺MRL 0.5 mg/kg的市場豇豆勻漿樣品，分別在室溫（約20 ℃）和4 ℃下保存（模擬家庭儲藏溫度條件），按0、1、2、3、5、7 d時間點(diǎn)進(jìn)行取樣檢測，分析儲存溫度、儲存時間對滅蠅胺殘留量的影響及其動態(tài)變化規(guī)律。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過Origin 8.6和Excel 2007進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

前處理?xiàng)l件的優(yōu)化以添加滅蠅胺濃度為0.10 mg/kg的豇豆樣品為考察對象（n=3）。初始條件為：加入10.00 mL乙腈、1.0 g NaCl、4.0 g無水MgSO4和5顆陶瓷均質(zhì)子；使用振蕩離心一體化裝置在1000 r/min下振蕩2 min后以4500 r/min離心5 min；吸取上清液5.00 mL于15 mL試管中，試管中加入15 mg GCB、150 mg PSA和835 mg無水MgSO4，渦旋振蕩1 min后以4500 r/min離心5 min；取1 mL上清液過0.22 μm尼龍濾膜，LC-MS/MS檢測，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液定量。測得回收率為48.1%，未滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.1.1 提取時間

使用振蕩離心一體化裝置，將提取時間由2 min分別增加為3、4和5 min，考察滅蠅胺回收率的變化。結(jié)果顯示，回收率分別為46.7%、47.6%和46.0%，提取時間的增加未能改善方法準(zhǔn)確度低的問題。

2.1.2 渦旋和離心裝置

固定其它條件，將前處理初始條件里的提取裝置改為高速渦旋儀器，提取和凈化渦旋時均使用10000 r/min，滅蠅胺回收率為52.2%；固定其它條件，將前處理初始條件里的離心裝置改為高速離心裝置，提取和凈化離心時均使用10000 r/min，回收率為42.3%。結(jié)果表明，提高前處理過程中渦旋或者離心凈化的強(qiáng)度均未能改善方法準(zhǔn)確度低的問題。

2.1.3 提取溶劑

滅蠅胺為強(qiáng)極性物質(zhì)，水溶性較好，在有機(jī)提取溶劑里加入酸有利于從樣品中提取滅蠅胺。在乙腈中添加乙酸，體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、5%、10%、15%、20%和25%，考察了不同體積分?jǐn)?shù)乙酸對提取滅蠅胺效果的影響。結(jié)果如圖2所示，隨著提取溶劑乙腈中乙酸的增加，滅蠅胺回收率逐漸增高；當(dāng)乙酸體分?jǐn)?shù)增加到15%以上時，回收率無明顯的變化。最終選擇含φ=15%乙酸的乙腈為提取溶劑。

圖2 乙酸體積分?jǐn)?shù)對滅蠅胺回收率的影響Fig.2 Effect of volume fraction of acetic acid on recovery of cyromazine

2.2 方法確認(rèn)

根據(jù)1.2.2節(jié)的方法計(jì)算得到ME值＜-20%，基質(zhì)抑制效應(yīng)較強(qiáng)，不能忽略。推測是因?yàn)樘崛∪軇┲泻休^大比例的乙酸，在提升對滅蠅胺提取效果的同時也增加了雜質(zhì)。為進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

稱取空白豇豆樣品，經(jīng)過儀器分析確定其滅蠅胺殘留量低于檢出限后，以空白樣品提取液配制0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.00 mg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以基質(zhì)標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸得到工作曲線。以0.005 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子色譜峰考察信噪比，按3倍信噪比計(jì)算檢出限（Limit of Detection，LOD）；定量限（Limit of Quantitation，LOQ）為最低添加濃度0.010 mg/kg，靈敏度高于韓永濤等[23]、田培等[32]的報道；與張鋒鋒等[13]的菜豆中滅蠅胺檢測方法相當(dāng)。在空白樣品中添加不同濃度的標(biāo)樣，每個添加量重復(fù)5次，結(jié)果顯示豇豆中滅蠅胺的回收率為76.2%～82.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviations，RSDs）為1.0%～5.7%，符合農(nóng)藥殘留分析的要求[37]。豇豆中滅蠅胺的工作曲線、檢出限、定量限和回收率詳見表2，色譜圖如圖3所示。

表2 豇豆中滅蠅胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及回收率Table 2 Linear equation, correlation coefficient, LOD and recoveries of cyromazine in cowpea

圖3 豇豆樣品中滅蠅胺的提取離子流色譜圖.Fig.3 Extraction ion chromatogram of cyromazine in cowpea sample

2.3 市場樣品分析與膳食暴露風(fēng)險評估

應(yīng)用本方法對市場流通樣品進(jìn)行滅蠅胺的殘留分析，結(jié)果顯示，滅蠅胺檢出25次，檢出比例22.3%；檢出值范圍為0.042～0.89 mg/kg，25個陽性樣品的檢出平均值為0.32 mg/kg；超標(biāo)5次，超標(biāo)比例4.5%，其中超市、農(nóng)貿(mào)市場（含連鎖生鮮店）和流動小攤檔分別超標(biāo)1、1和3次。

我國已登記滅蠅胺的食用性作物有菜豆、大蔥、黃瓜、姜、韭菜和平菇[38]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部的膳食風(fēng)險評估模板[35]，韭菜的風(fēng)險評估食物歸類深色蔬菜；豇豆、菜豆、黃瓜歸類為淺色蔬菜；平菇歸類為水果（參考“蘑菇”）；大蔥、姜?dú)w類為醬油。參考限量優(yōu)先選擇我國的MRL，其次是國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）。如果我國和CAC均沒有適合參考的MRL，依次從美國、澳大利亞、韓國、歐盟、日本、新西蘭等國家或國際組織發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)中選擇適合的限量作為評估依據(jù)。所查詢的國家、組織均未制定韭菜上滅蠅胺MRL，采用我國國標(biāo)中同為綠葉蔥類作物的蔥的MRL 3 mg/kg為參考限量。根據(jù)1.2.5節(jié)中的公式計(jì)算得到普通人群滅蠅胺的NEDI為0.406 mg，占ADI的10.74%，表明通常不會對一般人群健康發(fā)生不可接受的風(fēng)險[39]，如表3所示。

表3 滅蠅胺的膳食風(fēng)險評估Table 3 Dietary risk assessment of cyromazine

2.4 豇豆中滅蠅胺殘留的動態(tài)變化

農(nóng)藥半衰期差異性的影響因素包括溫度、濕度、光照、食品種類等。不同儲存溫度下豇豆中滅蠅胺殘留的消解動態(tài)結(jié)果如圖4所示。初始濃度為0.74 mg/kg，隨著存放時間的增加，滅蠅胺殘留值逐漸降低。室溫樣品、冷藏樣品分別在第2、3天時，滅蠅胺殘留值低于MRL 0.5 mg/kg，說明較高的溫度有利于滅蠅胺殘留的降解。滅蠅胺在豇豆樣品中的殘留消解動態(tài)規(guī)律符合一級動力學(xué)方程，室溫和冷藏條件下的消解半衰期分別為5.0和7.2 d。Fu等[14]的研究顯示田間條件下滅蠅胺在豇豆中的半衰期分別為4.65 d（單劑）和3.87 d（混劑）；張鋒鋒等[13]分析了滅蠅胺在菜豆上的消解動態(tài)與最終殘留，半衰期為3.2～6.1 d。本研究與文獻(xiàn)報道的滅蠅胺半衰期結(jié)果相近。

圖4 滅蠅胺在豇豆中的殘留消解動態(tài)Fig.4 Dissipation dynamics of cyromazine residue in cowpea

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析豇豆中的滅蠅胺，通過增加提取溶劑里乙酸的含量提升對滅蠅胺的提取效率，改善了水溶性農(nóng)藥滅蠅胺在分析中回收率偏低的問題。方法簡便、快速、準(zhǔn)確，LOD為0.001 mg/kg，LOQ為0.010 mg/kg，4個添加水平的回收率為76.2%～82.8%，RSD為1.0%～5.7%。

應(yīng)用所建立的滅蠅胺分析方法，評估了本地市場112個豇豆樣品中滅蠅胺的殘留情況。結(jié)果表明，滅蠅胺的檢出值為0.042～0.89 mg/kg，檢出比例為22.3%，超標(biāo)比例為4.5%?；跍缦壈吩谖覈r(nóng)作物上的登記使用情況、市場樣品分析結(jié)果和我國居民的膳食數(shù)據(jù)，對滅蠅胺進(jìn)行長期膳食攝入風(fēng)險評估。結(jié)果表明，滅蠅胺的膳食攝入RQ為10.74%，不會對一般人群健康造成不可接受的風(fēng)險。但部分樣品存在超標(biāo)問題，應(yīng)給予重視。存放溫度、存放時間均對豇豆中滅蠅胺的殘留變化有影響，較高的溫度有利于殘留值降低。從產(chǎn)地調(diào)研和市場樣品分析的結(jié)果來看，滅蠅胺在豇豆生產(chǎn)中有比較強(qiáng)的必要性和實(shí)用性，應(yīng)鼓勵滅蠅胺在豇豆上進(jìn)行登記，解決其使用的合法性問題，為種植者提供科學(xué)安全使用規(guī)范。同時宣傳普及使用已登記的農(nóng)藥乙基多殺菌素或溴氰蟲酰胺防治豇豆上的美洲斑潛蠅。