徐詠菁，陳文宇初，田方，蔡路昀2，倪贊，張崇生，陳祜福

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022）（2.浙江大學(xué)寧波科創(chuàng)中心，生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江寧波 315100）（3.溫州市食品藥品檢驗(yàn)科學(xué)研究院，浙江溫州 325028）（4.浙江香海食品股份有限公司，浙江溫州 325200）

小黃魚（Larimichthys polyactis）為我國(guó)海洋四大經(jīng)濟(jì)魚類之一，年產(chǎn)量約為28.92萬t，其加工過程中往往會(huì)產(chǎn)生50%左右的下腳料（包括魚頭、內(nèi)臟等），數(shù)量也十分可觀[1,2]。小黃魚下腳料中富含多種n-3系多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），具有預(yù)防癌癥和心腦血管疾病、緩解炎癥、降低代謝綜合癥患者患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)等作用[3]。因此，對(duì)小黃魚下腳料進(jìn)行綜合開發(fā)利用，充分開發(fā)其應(yīng)用潛力，將會(huì)對(duì)我國(guó)魚下腳料研發(fā)有一定的促進(jìn)作用。目前，我國(guó)小黃魚下腳料主要用于飼料、調(diào)味品、微生物肥料加工等領(lǐng)域，附加值較低，有關(guān)小黃魚下腳料的高值化利用和研究，如提取魚油、制備多糖和多肽等方面比較薄弱[4]?，F(xiàn)有研究多為小黃魚下腳料的腥味脫除，其酶解液水產(chǎn)調(diào)味料的開發(fā)，以及酶解液中多肽的研究[2,5,6]。而有關(guān)魚油的研究多集中于小黃魚內(nèi)臟的利用，如許韜等[7]以小黃魚內(nèi)臟為原料，采用三種不同的方法（稀堿水解法、酶解法和微波輔助法）提取魚油，發(fā)現(xiàn)稀堿水解法小黃魚內(nèi)臟油的提取率最高；徐鑫等[8]、劉國(guó)艷[9]用小黃魚內(nèi)臟酶法制備小黃魚內(nèi)臟魚油，發(fā)現(xiàn)其所提取的魚油理化指標(biāo)符合食品安全要求，且富含多不飽和脂肪酸，其中二十二碳五烯酸（DPA）1.28%，EPA 4.95%，DHA 9.57%。此外，在魚油提取過程中，原料前處理多為絞碎處理后冷凍，解凍后再用于魚油提取，但將原料直接冷凍干燥粉碎后再提取魚油的研究較少[7-12]。然而在實(shí)際生產(chǎn)過程中，小黃魚預(yù)處理后的下腳料主要包括魚頭及內(nèi)臟，這兩個(gè)部分通常緊密相連，不易分離，更適合將其作為整體資源加以利用，但有關(guān)其整體利用的研究報(bào)道較少。本研究探討分析了小黃魚下腳料絞碎以及冷凍干燥兩種前處理結(jié)合不同的提取方法（索氏抽提法、酶解法）對(duì)粗魚油理化性質(zhì)、脂肪酸組成以及揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響，意在研究不同提取方式對(duì)小黃魚下腳料粗魚油品質(zhì)的影響，以期提高小黃魚下腳料整體的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并為其用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黃魚下腳料（魚頭，內(nèi)臟等），由浙江香海食品股份有限公司提供；堿性蛋白酶（酶活力200000 U/g）、中性蛋白酶（酶活力50000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力100000 U/g）均由北京索萊寶科技有限公司提供；三氟化硼-甲醇溶液（14%）由上海麥克林生化科技有限公司提供；石油醚、正己烷、苯、百里香酚酞、碘化鉀、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、環(huán)乙烷、可溶性淀粉等，均為分析純，均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Alpha 1-4 LSC basic冷凍干燥機(jī)，3K15冷凍離心機(jī)，北京博勱行儀器有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RV 101-HB 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA集團(tuán)；8890/5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小黃魚下腳料前處理

取小黃魚下腳料若干進(jìn)行前處理，分別制成濕樣（Wet Sample，W）和干樣（Dry Sample，D）。濕樣為將小黃魚下腳料用粉碎機(jī)絞碎后，真空封裝于保鮮袋中，-80 ℃冰箱內(nèi)貯藏待用，在使用前18 h取出于4 ℃冰箱中解凍[9]；干樣為將小黃魚下腳料用粉碎機(jī)絞碎后，-56 ℃下冷凍干燥48 h后再次粉碎，過20目篩，于-80 ℃冰箱內(nèi)貯藏待用[7]。

1.3.2 小黃魚下腳料粗魚油提取方式

1.3.2.1 索氏提取法提取粗魚油

參考趙騰飛等[13]的方法，準(zhǔn)確稱取濕樣和干樣各5 g，采用索氏提取法提取粗魚油，分別命名為WS、DS。

1.3.2.2 酶解法提取粗魚油

參照徐鑫等[8]和王丹等[14]的方法，略微修改，分別稱取100 g的濕樣和干樣，均依次加入小黃魚下腳料質(zhì)量2%的3種酶（堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶），并分別在各種酶的最適pH值、溫度以及液固比條件下（見表1），酶解時(shí)間2.5 h，酶解結(jié)束以后，在10000 r/min離心20 min，離心液上層即為粗魚油。濕樣和干樣均采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，并分別命名為W1、W2、W3、D1、D2、D3，同時(shí)測(cè)定各理化指標(biāo)。

表1 不同前處理及其最佳酶解工藝條件Table 1 Enzymatic hydrolysis process under different pretreatment conditions

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

參照GB/T 5532-2008[15]測(cè)定碘值；參照GB 5009.239-2016[16]中冷溶劑法測(cè)定酸價(jià)；參照GB 5009.227-2016[17]測(cè)定過氧化值。

1.3.4 脂肪酸組成分析

取上述不同提取方式所得粗魚油200 μL，加入2 mLφ=14%三氟化硼-甲醇溶液，水浴加熱（60 ℃，30 min）后冷卻至室溫，并與1 mL正己烷和1 mL蒸餾水混合。靜置分層后，上清液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)上清液進(jìn)行分析[18]。

色譜條件：色譜柱型號(hào)為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣溫度設(shè)定為250 ℃；分流比設(shè)定為30:1進(jìn)樣體積設(shè)定為1 μL，流速設(shè)定為1.52 mL/min，載氣為高純氦；加熱程序?yàn)?10 ℃加熱4 min，10 ℃/min加熱1 min，然后以4 ℃/min的速度加熱1 min；并加熱至210 ℃持續(xù)3 min，最后以4 ℃/min的速度加熱至240 ℃，并持續(xù)8 min[18]。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，溶劑延遲時(shí)間3 min[18]。

脂肪酸的定性與定量測(cè)定：借助質(zhì)譜庫化合物檢索定性，并借助面積歸一化法對(duì)脂肪酸的相對(duì)含量予以計(jì)算。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

準(zhǔn)確稱量5 g粗魚油樣品放在15 mL頂空進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，將提前老化完成的萃取頭DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）插入進(jìn)樣瓶的頂空部分，在60 ℃的溫度下吸附30 min，將萃取頭取出后，插入GC進(jìn)樣口，在250 ℃溫度下解吸10 min[19]。

色譜條件：色譜柱型號(hào)為DB-WAX；載氣流速設(shè)定為1.5 mL/min，分流比設(shè)定為5:1，氣質(zhì)傳輸線溫度260 ℃；升溫程序：初始溫度設(shè)定為50 ℃，在此溫度條件下保持2 min，以5 ℃/min的速度升至100 ℃并保持2 min；4 ℃/min的速度升至140 ℃并保持2 min；3 ℃/min的速度升至190 ℃并保持1 min；10 ℃/min的速度升至250 ℃并保持5 min[19]。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，EI電離70 eV，全掃描35～550 u[19]。

揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性與定量：借助質(zhì)譜庫化合物檢索定性，并借助面積歸一化法對(duì)各揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對(duì)含量予以計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行處理與分析、利用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方式對(duì)粗魚油理化指標(biāo)的影響

油脂是否變質(zhì)（酸敗、腐?。┩ǔ？梢岳盟醿r(jià)、過氧化值、碘價(jià)3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[8]。酸價(jià)可用于判斷魚油中的游離脂肪酸含量，是衡量油脂氧化酸敗的重要指標(biāo)，且與不良風(fēng)味物質(zhì)的存在有關(guān)[20]。過氧化值可以衡量氫過氧化物的含量，氫過氧化物又可分解為醛酮類和氧化物等，從而導(dǎo)致魚油酸敗變質(zhì)[21]。碘價(jià)可以體現(xiàn)魚油的不飽和程度，碘價(jià)越高，說明魚油的不飽和程度越高[20,22]。由表2可知，不同提取方式制備的粗魚油其理化指標(biāo)值均滿足水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 3502-2016）三級(jí)的規(guī)定。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WS處理所提樣品得率低，時(shí)間周期長(zhǎng)，成本高，品質(zhì)較差，不適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，故后續(xù)試驗(yàn)中不采用該處理提取魚油并進(jìn)行分析。由表2可知，索氏提取法提取的粗魚油酸價(jià)較高，與酶解法所提粗魚油差異顯著（P＜0.05），這可能與索氏提取溫度較高，羧基類酸性物質(zhì)較高有關(guān)。D2、D3、W2、W3處理組樣品的過氧化值含量與D1、W1處理組樣品呈顯著差異（P＜0.05），可見不同蛋白酶作用下，魚油氧化的程度有所不同。其中采用木瓜蛋白酶酶解工藝對(duì)粗魚油予以有效提取，其過氧化值較低?？偟膩碚f，相較于索氏提取法，采用酶解工藝提取的粗魚油，其理化指標(biāo)較優(yōu)。

表2 粗魚油理化指標(biāo)及其測(cè)定值Table 2 Physical and chemical indexes and its determined values of crude fish oil

2.2 不同提取方式對(duì)粗魚油脂肪酸組成的影響

面積歸一法求得的粗魚油脂肪酸組成及相對(duì)含量如表3所示。從中可以看出小黃魚下腳料粗魚油共檢出19種脂肪酸，主要由肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、十六碳一烯酸、油酸、EPA、DHA等組成。飽和脂肪酸相對(duì)含量為31.68%～51.66%，其中棕櫚酸（C16:0）相對(duì)含量最高；單不飽和脂肪酸相對(duì)含量為29.21%～40.06%，其中油酸（C18:1n9）相對(duì)含量最高，十六碳一烯酸（C16:1n7）次之；多不飽和脂肪酸相對(duì)含量為7.90%～30.02%，主要為EPA和DHA。

表3 粗魚油中脂肪酸組成成分及相對(duì)含量Table 3 Composition and relative content of fatty acids in crude fish oil

DS和D2處理組樣品的脂肪酸組成最為豐富，均檢出19種脂肪酸。其中D2中不飽和脂肪酸相對(duì)含量較DS高，其不確定成分相對(duì)含量?jī)H為3.61%，棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、十六碳一烯酸（C16:1n7）和油酸（C18:1n9）相對(duì)含量較高，分別為23.04%、8.34%、12.70%、24.80%，EPA和DHA相對(duì)含量為13.61%。而D1、D3、W2處理組樣品的不飽和脂肪酸相對(duì)含量較高，為64.71%、62.21%、55.98%，因此其碘價(jià)也相對(duì)較高。多不飽和脂肪酸含量是評(píng)價(jià)魚油價(jià)值的重要指標(biāo)，對(duì)降低血脂、抗炎、健智益腦、預(yù)防癌癥有積極作用[7]。D1、D2、D3處理組樣品中多不飽和脂肪酸相對(duì)含量均高于DS。其中D1處理組樣品的多不飽和脂肪酸相對(duì)含量最高，為30.02%，其EPA和DHA相對(duì)含量更是達(dá)到了25.59%。D1、D3處理組樣品中多不飽和脂肪酸相對(duì)含量高于W1、W3。劉國(guó)艷等[1]通過堿性蛋白酶酶解小黃魚內(nèi)臟糜，所得魚油采用GC法分析其脂肪酸組成，其中多不飽和脂肪酸相對(duì)含量為18.40%，而許韜等[7]采用堿性蛋白酶酶解工藝提取冷凍干燥后的小黃魚內(nèi)臟油，利用GC檢測(cè)脂肪酸組成，其多不飽和脂肪酸總量為19.27%。由此可知，對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥前處理，有助于提取品質(zhì)更佳、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的魚油。酶解法中，相較于其他蛋白酶，采用堿性蛋白酶提取，有更好的效果。

2.3 不同提取方式對(duì)粗魚油揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

不同樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及相對(duì)含量分別如圖2、表4所示。不同樣品中共鑒定出99種化合物，其中醇類16種，醛類16種，酮類15種，酯類3種，酸類8種，碳?xì)浠衔?6種，酰胺類化合物3種，雜環(huán)化合物及其他化合物22種。

表4 粗魚油中揮發(fā)性風(fēng)味成分組成成分及相對(duì)含量Table 4 Composition and relative content of volatile flavor components in crude fish oil

醇類物質(zhì)一般是借助羰氨化合物發(fā)生的還原反應(yīng)抑或是脂肪酸酶發(fā)生促氧化反應(yīng)得到的，其中蘑菇醇（1-辛烯-3-醇）具有蘑菇味，由于其感覺閾值并不高，能夠?qū)︳~油整體風(fēng)味造成顯著的影響[23]。但是其他醇類化合物感覺閾值相對(duì)較高，所以魚油的風(fēng)味無法做出顯著的貢獻(xiàn)[23]。醛類化合物是通過不飽和脂肪酸發(fā)生氧化降解得到的，因其感覺閾值較低，故對(duì)魚油整體的風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)[24]。其中(E,E)-2,4-庚二烯醛是亞麻酸氧化的特征氧化產(chǎn)物，是水產(chǎn)品中常見的腥味物質(zhì)[25]。辛醛具有很強(qiáng)的水果味，而壬醛、己醛、(E)-2-辛烯醛具有青草味，也構(gòu)成了魚腥味的一部分[26,27]。酮類化合物是通過脂質(zhì)不飽和脂肪酸的熱氧化和美拉德發(fā)生化學(xué)反應(yīng)得到的，可以有效的改善魚油的整體風(fēng)味[28]。2-庚酮具有類似梨的水果香味，3,5-辛二烯-2-酮具有奶油味和清鮮魚味，通常是新鮮水產(chǎn)品不可或缺的風(fēng)味物質(zhì)[29]。而2-壬酮的感覺閾值并不高，能夠散發(fā)出花香氣味，對(duì)魚油整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[30]。酯類物質(zhì)呈清淡的水果香氣，但是一般除了內(nèi)酯和硫酯的閾值比較低，其他酯類的閾值都較高，對(duì)魚油總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)不大[23]。酸類化合物會(huì)對(duì)魚油的整體風(fēng)味產(chǎn)生不好的負(fù)面影響，如2-甲基己酸具有豬油、雞脂肪的油膩氣息，己酸具有汗臭味[23]。碳?xì)浠衔锏母杏X閾值較高，不具備明顯的魚類風(fēng)味特征，對(duì)魚油總體風(fēng)味幾乎沒有貢獻(xiàn)[23]。雜環(huán)化合物還有其他化合物內(nèi)含有的呋喃類（例如2-戊基呋喃）與吡嗪類成分（譬如2,5-二甲基吡嗪等），為熱反應(yīng)產(chǎn)物帶來的特有香味成分，并且由于它們閾值往往較低，可以使粗魚油的風(fēng)味更加濃郁[6,31]。

圖1 總揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及各提取方式下?lián)]發(fā)性風(fēng)味成分的種類Fig.1 The types of total volatile flavor components and volatile flavor components under different extraction methods

結(jié)果表明，小黃魚下腳料粗魚油揮發(fā)性風(fēng)味的主要成分是醇類、醛類、酮類、碳?xì)浠衔镆约耙恍╇s環(huán)氧化物，其中醛類、酮類、酸類是粗魚油揮發(fā)性風(fēng)味的主要成分。提取方式的差異性會(huì)造成粗魚油內(nèi)的揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類與相對(duì)含量存在或多或少的差異?？傮w來看，苯乙醇、己醛、辛醛、2-庚酮、2-壬酮、5-甲基-3-庚烯-2-酮、己酸、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪是粗魚油中關(guān)鍵性的揮發(fā)性風(fēng)味成分。其中DS處理組樣品共檢出14種揮發(fā)性風(fēng)味成分，明顯少于其他處理組，其中醛類、酸類檢出最多，共4種，且酸類的相對(duì)含量最高，為63.10%，魚油的風(fēng)味較差。利用酶解法提取粗魚油，不同前處理使其揮發(fā)性風(fēng)味成分發(fā)生變化，其中W1處理組樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分檢出最多，共檢出42種，醇類共檢出9種，醛類共檢出5種，酮類共檢出5種，酯類共檢出1種，酸類共檢出2種，碳?xì)浠衔锕矙z出11種，雜環(huán)化合物及其他化合物共檢出9種，其中主要形成魚油風(fēng)味的成分1-辛烯-3-醇、己醛、辛醛、2-庚酮、2-壬酮、2-甲基己酸、己酸、2,5-二甲基吡嗪的相對(duì)含量分別為1.43%、0.81%、0.78%、1.79%、0.73%、6.73%、0.72%、4.38%，而苯甲醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、3,5-辛二烯-2-酮未檢出。D1處理組樣品共檢出33種揮發(fā)性風(fēng)味成分，己醛、辛醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、2-庚酮、2-壬酮、2-甲基己酸、己酸、2,5-二甲基吡嗪的相對(duì)含量分別為1.11%、0.63%、0.57%、17.89%、2.30%、4.96%、7.31%、0.85%，1-辛烯-3-醇、苯甲醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、3,5-辛二烯-2-酮未檢出，與W1處理組樣品相比，酮類相對(duì)含量較高，對(duì)魚油的風(fēng)味有一定的修飾作用。W2、W3處理組樣品中醛類相對(duì)含量分別為31.05%和8.70%，酮類相對(duì)含量分別為20.19%和24.88%，而D2、D3處理組樣品中醛類的相對(duì)含量?jī)H為3.43%、2.13%，酮類相對(duì)含量為16.74%、20.50%。由此可知，與索氏提取法相比，酶解法對(duì)小黃魚下腳料粗魚油的風(fēng)味影響較小，且冷凍干燥前處理也能夠在一定程度上改善粗魚油的風(fēng)味。因此，冷凍干燥前處理結(jié)合酶解法提取，可以得到風(fēng)味較好的小黃魚下腳料粗魚油。

3 結(jié)論

本研究對(duì)不同前處理結(jié)合不同提取方式獲得的小黃魚下腳料粗魚油，進(jìn)行理化指標(biāo)、脂肪酸組成、揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定及分析比較。結(jié)果表明，不同提取方式所得的7種粗魚油酸價(jià)、過氧化值、碘價(jià)均達(dá)到SC/T 3502-2016規(guī)定的粗魚油三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。且所提粗魚油，其脂肪酸均主要由肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、十六碳一烯酸、油酸、EPA、DHA組成，但在脂肪酸的相對(duì)含量上有所差異，其中冷凍干燥前處理結(jié)合堿性蛋白酶酶解所得粗魚油的EPA和DHA相對(duì)含量最高，高達(dá)25.59%。從不同提取方式制備的粗魚油中共檢測(cè)出99種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中冷凍干燥前處理結(jié)合索氏提取法提取的粗魚油揮發(fā)性風(fēng)味成分種類最少，其中醛類和酸類檢出數(shù)量最多，且相對(duì)含量較高，風(fēng)味較差。而經(jīng)冷凍干燥前處理結(jié)合酶解工藝提取粗魚油后，其揮發(fā)性風(fēng)味可得到一定程度的改善。綜上，提取方式的不同可對(duì)粗魚油的理化性質(zhì)、脂肪酸組成及揮發(fā)性風(fēng)味成分造成一定的影響，其中采用冷凍干燥前處理結(jié)合酶解工藝，從小黃魚下腳料中提取粗魚油，成品品質(zhì)較優(yōu)。本研究可為小黃魚下腳料的進(jìn)一步高值化利用提供了一定的理論依據(jù)與參考。