郭永昊，李倞霆，孫珍，唐文竹

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

啤酒主要是由麥芽為主要原料添加大米、玉米等輔料釀造的一種富含二氧化碳的低酒精飲料。與啤酒產(chǎn)品風(fēng)味相關(guān)聯(lián)的風(fēng)味物質(zhì)有千種之多，包括醇類、酯類、羰基類、有機酸類、硫化物等，它們之間微妙的平衡關(guān)系，構(gòu)成了啤酒特有的風(fēng)味。而啤酒品質(zhì)在生產(chǎn)過程中受到諸多因素影響，制麥、糖化、發(fā)酵、后熟等階段都對啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)的形成產(chǎn)生深遠影響[1,2]。麥汁的糖化是啤酒發(fā)酵過程中的關(guān)鍵一步，是將麥芽及其添加的輔料中的不溶性高分子物質(zhì)或大分子物質(zhì)（淀粉、蛋白質(zhì)、半纖維素等大分子物質(zhì)）通過利用糖化過程中浸出的各種水解酶在適宜的溫度、pH值、時間等條件下，逐步分解為可溶性的低分子物質(zhì)的分解過程，這個過程稱為麥汁的糖化。在這個過程中糖化液的物質(zhì)成分發(fā)生了復(fù)雜多樣的變化，主要包括：淀粉的分解、蛋白質(zhì)的分解、β-葡聚糖的分解、酸的形成、脂肪的分解和多酚物質(zhì)的變化[3-5]。

糖化后麥汁的品質(zhì)將會直接影響麥汁發(fā)酵后啤酒品質(zhì)，迄今為止，已知對啤酒品質(zhì)產(chǎn)生影響的物質(zhì)主要有醇類、醛類、酸類、酯類和酮類等，這些物質(zhì)是評價啤酒品質(zhì)的一個重要指標(biāo)[6,7]，它們共同影響著啤酒的質(zhì)量。因此，糖化后得到的麥汁成分對酵母的發(fā)酵和啤酒的口感、非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性均有深遠的影響。除此之外，啤酒的風(fēng)味與酵母的發(fā)酵也有著密切相關(guān)，其中，據(jù)文獻報道，影響啤酒風(fēng)味的高級醇主要來自酵母代謝的兩個途徑，一種是通過氨基酸的異化經(jīng)Ehrlich機制形成，另一種是先經(jīng)過糖代謝途徑，經(jīng)氨基酸的合成途徑后形成高級醇[13]。

本文通過應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多遠分析以及通路分析的方法對不同糖化條件下得到的麥汁和發(fā)酵后酒的代謝譜進行了分析，從代謝水平上研究糖化條件對酵母代謝的影響，從而確定不同糖化條件對啤酒風(fēng)味的影響。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與裝置

Agilent UPLC 1290液相色譜儀、G6545B四級桿-飛行時間質(zhì)譜、G2630A Agilent氣相色譜，美國安捷倫。

1.2 主要材料與試劑

國產(chǎn)大麥，產(chǎn)自中國河南；西楚酒花，hBC公司產(chǎn)品；艾爾啤酒酵母S-04，本實驗室冷凍管；乙腈、甲酸，均為色譜級，產(chǎn)自默克公司產(chǎn)品。

1.3 分析方法

1.3.1 液相方法色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min；正/負離子模式A相：1‰甲酸水/1 mmol/L氟化銨溶液，B相1‰甲酸乙腈/乙腈；梯度洗脫：初始流動相為95% A，0～2 min，95% A；2～20 min，95%～0% A；20～25 min，0% A。

1.3.2 質(zhì)譜條件正/負離子模式；離子源：AJS；干燥氣流速：(11 L/min)/(7 L/min)；干燥氣體：350 ℃/325 ℃；霧化器：35 psi/32 psi；鞘氣：10 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；毛細管電壓：3.5 kV；參比離子（m/z）：121.0509、922.0098；1112.9855、1033.9881

1.3.3 氣相色譜條件

檢測器和進樣口溫度均為260 ℃；柱箱升溫：初始溫度50 ℃（2 min），以5 /℃min升至70 ℃（2 min），以5 ℃/min升至110 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃（2 min）；氮氣、氫氣、空氣流量為4.2 mL/min、45 mL/min、450 mL/min；氣相色譜柱：HP-FFAP（50 mm×0.32 mm×1.00 μm）。

1.3.4 制麥方法

將大麥在16 ℃濕浸6 h；干浸16 h；濕浸5 h；發(fā)芽2～3 d；焙焦50 ℃干燥16 h；60 ℃干燥1 h；70 ℃干燥1 h；80 ℃干燥5.5 h。

1.3.5 糖化方法

方法1：35 ℃（25 min），50 ℃（50 min），62 ℃（40 min），72 ℃（20 min），78 ℃（20 min）；方法2：45 ℃（25 min），55 ℃（30 min），65 ℃（30 min），70 ℃（30 min），78 ℃（20 min）；方法3：45 ℃（30 min），63 ℃（60 min），72 ℃（30 min），78 ℃（15 min）。

1.3.6 發(fā)酵條件

焙焦完成后按上述三種方法糖化，糖化后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的西楚酒花煮沸1 h，調(diào)制糖度為9°，加入艾爾S-04酵母至濃度為每毫升106個，20 ℃發(fā)酵7 d。每種糖化方法糖化后的麥汁命名為麥汁1、麥汁2和麥汁3；發(fā)酵后的酒命名為酒1、酒2和酒3。每種酒分別有12個生物重復(fù)，發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液經(jīng)醇沉后稀釋進行液質(zhì)分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

本實驗通過氣相色譜結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的方法對酒中的乙醇、正丙醇、乙醛、乙酸乙酯和異丁醇等揮發(fā)性物質(zhì)進行了測定；通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對麥汁和酒的其他代謝物質(zhì)進行了檢測。將質(zhì)譜所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)過峰對齊，降噪，峰過濾，提取特征值，在提取的數(shù)據(jù)中選取含有CAS Number或KEGG ID的物質(zhì)進行缺失值補充等處理；缺失的值用同組數(shù)據(jù)的平均值進行補充，且當(dāng)一物質(zhì)在同組中占比超過80%認為該物質(zhì)存在。酒和麥汁篩選和補缺后的數(shù)據(jù)經(jīng)過無監(jiān)督的主成分分析（PCA）用來分析樣本差異，判斷樣品是否有分類現(xiàn)象。通過有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）選取VIP值＞1的物質(zhì)進行通路富集，確定影響較大的代謝通路，以此來確定不同的糖化方法對釀酒酵母代謝產(chǎn)生的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥汁成分分析

將糖化獲取的麥汁經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS分析后，所獲取的物質(zhì)按ChBI（Chemical Entities of Biological Interest）分類原則將代謝物分成35類包括羧酸酯、脂質(zhì)、醇類、萜類、酮類、氨基酸、醛類、烴類、核苷、低聚糖、糖苷、多糖、單糖、多元醇、醚類、氨基醇、膽堿、肽類、呋喃類、脂肪酸、有機芳香化合物、生物堿、有機酸、吡啶類、酚類、嘧啶、吡喃、有機羥基化合物、內(nèi)酯、嘌呤、胍類、多胺、苯類芳香化合物和其他類。所分類結(jié)果如圖1所示。

圖1 麥汁中物質(zhì)種類數(shù)量分類柱狀圖Fig.1 Histogram of classification of substance types and quantities in wort

糖化方法1中有機酸和萜類物質(zhì)種類最多；糖化方法2中羧酸酯、脂質(zhì)、酮類、氨基酸、嘌呤和生物堿的種類最多；糖化方法3中內(nèi)酯、低聚糖、肽類和有機芳香化合物的種類最多。

2.2 主成分分析

主成分分析（PCA）是利用矩陣的線性轉(zhuǎn)換從原始多個變量中選出較少個數(shù)的能解釋大部分?jǐn)?shù)據(jù)的重要變量，即通過數(shù)據(jù)降維的方法，用幾個主成分來體現(xiàn)代謝組學(xué)多維數(shù)據(jù)下的特征[8-10]。PCA得分圖（Score Plot）表示樣本數(shù)據(jù)的分類信息，數(shù)據(jù)越相似的樣本在得分圖上距離越近。

從圖2 PCA分析的結(jié)果中可以看出，正負電荷模式下不同糖化方法制備的麥汁之間有明顯的分離，而同種方法的麥汁和發(fā)酵后的酒之間有明顯的聚集。因此可以判定不同方法酒之間的分離主要是由于使用了不同糖化方法麥汁發(fā)酵造成的。所以不同的糖化方法會對發(fā)酵后的酒的品質(zhì)有一定影響。

圖2 正電模式下不同糖化方法糖化麥汁和發(fā)酵后酒的PCA得分圖Fig.2 PCA score diagram of saccharified wort and fermented wine in different saccharification methods under positive mode

2.3 物質(zhì)篩選

為了準(zhǔn)確研究代謝物與酒之間的相關(guān)性，進一步進行了Biplot分析。Biplot圖是由PCA經(jīng)過坐標(biāo)變換能夠得到樣品和物質(zhì)之間關(guān)系的一種可視化方法，在對應(yīng)樣品點周圍的代謝物在該樣品中的含量最高，反之，與該樣品點相反方向的代謝物在該樣品中的含量最低。圖3是發(fā)酵后酒可視化的Biplot圖。

圖3 正負電模式下PCA的biplot圖Fig.3 Biplot diagram of PCA in positive and negative mode

選取圖3中黃色樣品點周圍以及外側(cè)的綠色物質(zhì)點進行分析，正電選取407種代謝物，負電選取了311種代謝物。將選取得到的716種差異代謝物按ChBI（https://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do）分類后結(jié)果如圖4所示。

圖4 Biplot分析后選取物質(zhì)分類結(jié)果Fig.4 Select material classification results after Biplot analysis

結(jié)果表明不同糖化條件得到的麥汁經(jīng)過釀酒酵母發(fā)酵后羧酸酯、醇類、氨基酸、有機酸、內(nèi)酯以及酮類等物質(zhì)在啤酒中的含量變化較大。其中酯類醇類和有機酸等物質(zhì)能夠直接影響啤酒的風(fēng)味，尤其是酯類物質(zhì)對啤酒風(fēng)味特別是果香味的形成起到關(guān)鍵作用。氨基酸和脂肪酸等物質(zhì)是風(fēng)味物質(zhì)形成的中間體或前體物質(zhì)；亮氨酸是異戊醇的前體物，異亮氨酸是活性戊醇的前體物，酪氨酸可轉(zhuǎn)化成對氨基苯乙醇（酪醇），色氨酸轉(zhuǎn)化為色醇等[11,12]。

2.4 偏最小二乘判別分析

為了進一步分析不同糖化方法得到的麥汁對釀酒酵母的代謝產(chǎn)生的影響。將選取的差異代謝物進行PLS-DA分析，不同糖化條件得到的麥汁進一步進行發(fā)酵后的酒樣本在評分圖（圖5a）上也能有效分離，為了確保模型的準(zhǔn)確性對模型進行了100次置換檢驗（圖5b）其中R2=0.0363，Q2=-0.302，符合R2＜0.4，Q2＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，確保了模型的準(zhǔn)確性。而要尋找糖化條件對酵母發(fā)酵影響較大的關(guān)鍵代謝節(jié)點就必須量化每個變量(代謝物)，本文采用VIP值（Variable Importance Plot，變量投影重要性值）來實現(xiàn)量化。VIP值反應(yīng)了每個變量對模型的貢獻率，其值越大表明對應(yīng)變量對模型的貢獻度越大，即在樣本組之間所表現(xiàn)的差異越明顯，一般選取VIP值＞1的代謝物作為標(biāo)志性代謝物[13,14]。

圖5 （a）差異代謝物PLS-DA評分圖，（b）PLS-DA模型驗證圖Fig.5 (a) PLS-DA score chart for differential metabolism, (b) PLS-DA model validation chart

根據(jù)模型的結(jié)果，選取VIP＞1的代謝物在釀酒酵母代謝通路上進行通路富集，共富集到了51條代謝通路，選取排名靠前的20條代謝通路如圖6所示。從富集的通路結(jié)果上發(fā)現(xiàn)改變糖化條件之后主要影響釀酒酵母的氨基酸代謝、有機酸代謝以及脂質(zhì)和脂肪酸代謝等代謝途徑；主要涉及到一些基本氨基酸和脂肪酸的代謝通路，如：亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、脂肪酸、色氨酸、異亮氨酸生物合成途徑；甘氨酸、絲氨酸、D-氨基酸、蘇氨酸的降解代謝途徑。

圖6 VIP＞1代謝物在釀酒酵母前20條通路富集圖Fig.6 Enrichment of VIP>1 metabolites in the first 20 pathways of Saccharomyces cerevisiae

經(jīng)過PLS-DA分析后共選取了VIP＞1的物質(zhì)共有250種，含有KEGG ID的物質(zhì)有191種，其中能夠富集到酵母代謝通路上的共有38種。其中能夠富集在氨基酸代謝、有機酸代謝和脂肪酸代謝途徑中的物質(zhì)有13種，如表1所示。

表1 酒中的氨基酸及脂肪酸代謝途徑中代謝物VIP＞1代謝物Table 1 Metabolite VIP>1 in a mino acid and fatty acid metabolism pathway

酒中的氨基酸及脂肪酸代謝途徑中代謝物VIP＞1代謝物的含量如圖7所示，酒1中精氨酸、脯氨酸、5-乙酰氨基戊酸酯、二十碳二烯酸、色氨酸的含量最高；十八烷酸、十六烷酸、十四烷酸、(2R,3S)-3蘋果酸甲酯、甘油酸酯、(S)-2-羥基戊二酸鹽酒2中的含量最多；2-氧代丁酸、酪氨酸在酒3中最多。

圖7 酒中氨基酸及脂肪酸代謝途徑中代謝物VIP＞1代謝物含量熱圖Fig.7 Heat diagram of metabolite VIP>1 in a mino acid and fatty acid metabolic pathway in wine

2.5 代謝網(wǎng)絡(luò)分析

代謝途徑分析是將數(shù)據(jù)分析得到的結(jié)果結(jié)合具體的生物代謝系統(tǒng)進行生物學(xué)意義的解釋。將差異代謝物分析得到的關(guān)鍵代謝節(jié)點結(jié)合酵母代謝網(wǎng)絡(luò)分析胞內(nèi)代謝物與胞外風(fēng)味物質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系，如圖8。

圖8 啤酒發(fā)酵過程中代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Metabolic network during beer fermentation

啤酒發(fā)酵過程中影響啤酒風(fēng)味的高級醇形成有兩條途徑：一條是依靠氨基酸的異化作用，通過Ehrlich機制形成高級醇；另一條途徑是通過糖代謝途徑，經(jīng)由氨基酸的合成途徑生成。異丁醇、異戊醇和活性戊醇的前體物質(zhì)分別為：纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，這些高級醇的生成和這些對應(yīng)的氨基酸的代謝密切關(guān)聯(lián)并互相影響[15-17]。

圖8表明異丁醇的代謝與纈氨酸的代謝有密切關(guān)系，當(dāng)纈氨酸的含量高時，異丁醇的含量下降與Chen等[15]的研究結(jié)論相符。脯氨酸并沒有直接參與酵母醇酯代謝，但脯氨酸代謝會影響谷氨酰胺合成，生成的谷氨酰胺在酵母生長時會被利用。酪氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等氨基酸類物質(zhì)在代謝過程中也會生成有機酸或酯類等物質(zhì)來影響啤酒的風(fēng)味。酯類特別是乙酸乙酯的合成與相應(yīng)醇類相關(guān)聯(lián)，這在圖8中的糖酵解途徑中也有所表明。啤酒中的脂肪酸形成一部分來自于酵母代謝的產(chǎn)生，啤酒在發(fā)酵過程時丙酮酸能夠經(jīng)過輔酶A的催化生成脂肪酸。由圖8可以看出用不同糖化工藝制備的麥汁發(fā)酵成的酒，脂肪酸的含量上也有較明顯的差異；例如：十二烷酸、辛酸和二十二碳二烯酸在酒1中的麥汁含量高；十四烷酸、十六烷酸和十八烷酸在酒2中的含量最高。

啤酒成分中的酯類風(fēng)味物質(zhì)主要是由?；o酶A通過醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下與醇類物質(zhì)發(fā)生縮合反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類風(fēng)味物質(zhì)。而酯類物質(zhì)代謝與脂肪酸代謝對酯基輔酶A存在競爭關(guān)系，而麥汁中脂質(zhì)在發(fā)酵過程中會水解產(chǎn)生的脂肪酸，如果代謝流偏向于脂肪酸代謝，必然會影響酯類物質(zhì)生成[18-20]。如圖4中選取酒中差異物質(zhì)中方法3中酯類的種類最多，因此麥汁中的脂質(zhì)會影響酒中酯類的生成[21]。

3 結(jié)論

本實驗通過對不同糖化條獲得的麥汁發(fā)酵酒進行分析，研究糖化條件對釀酒酵母代謝物的影響。發(fā)現(xiàn)改變麥汁的糖化條件以后對麥汁本身的酯類和脂質(zhì)的種類變化較大，主要體現(xiàn)在羧酸酯、脂質(zhì)和內(nèi)酯類物質(zhì)上。發(fā)酵后酒的代謝物通過物質(zhì)篩選和通路富集分析找出關(guān)鍵的代謝物。通過Biplot分析結(jié)果可知，氨基酸類和脂肪酸類物質(zhì)的變化明顯，經(jīng)過通路富集可知，改變糖化條件以后能夠直接在根本上影響糖酵解途徑，進而對釀酒酵母的氨基酸代謝、脂肪酸代謝以及乙酸乙酯、異丁醇等風(fēng)味物質(zhì)的生成產(chǎn)生一定的影響。改變糖化方法以后，酒1中精氨酸、脯氨酸、5-乙酰氨基戊酸酯、二十碳二烯酸、色氨酸的含量最高；十八烷酸、十六烷酸、十四烷酸、(2R,3S)-3蘋果酸甲酯、甘油酸酯、(S)-2-羥基戊二酸鹽酒2中的含量最多；2-氧代丁酸、酪氨酸在酒3中最多。利用本研究得到的關(guān)鍵代謝通路，解析其分子機制，挖掘更多的與風(fēng)味物質(zhì)形成有關(guān)的關(guān)鍵基因和調(diào)控因子，將有助于通過分子手段調(diào)控啤酒釀造中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)量。