高霞，馮慶祥，胡楊，尹濤，尤娟，熊善柏，劉茹

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北武漢 430070）

魚糜制品因高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)價值豐富而廣受消費(fèi)者的喜愛[1,2]。商業(yè)生產(chǎn)時，需加入2%～3%氯化鈉（Sodium Chloride，NaCl）使魚糜中的鹽溶性蛋白充分溶解[3]。加熱過程中，溶出的蛋白伸展并暴露部分活性基團(tuán)[4]，分子間發(fā)生相互作用，形成有序結(jié)構(gòu)的彈性凝膠體[5,6]。但是，鹽含量攝入過多易引發(fā)心血管疾病，不利于人體健康。諸多學(xué)者報道了魚糜制品生產(chǎn)時的減鹽措施，包括使用鈉鹽替代物、添加外源親水膠體、使用新興高新技術(shù)等[7-9]。其中，前期實(shí)驗(yàn)室研究[10,11]發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲波技術(shù)（10～1000 W/cm2，20～100 kHz）可促進(jìn)肌球蛋白溶解，提高低鹽（1%，m/m）魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)性能，但降低了高鹽（＞3%）魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)性能，推測這與超聲強(qiáng)度及鹽含量等因素有關(guān)。目前，大多數(shù)研究集中于超聲強(qiáng)度或鹽含量單因素對魚糜凝膠性能的影響[12-14]，然而，關(guān)于超聲功率、時間及鹽含量三者同時施加對魚糜凝膠性能的影響鮮有報道。

二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計是一種將正交與回歸融為一體的試驗(yàn)方法，可用較少的實(shí)驗(yàn)組合實(shí)現(xiàn)與完全實(shí)施實(shí)驗(yàn)相同項(xiàng)數(shù)的回歸模型，并且旋轉(zhuǎn)性使得預(yù)測值的方差處處相等[15]。應(yīng)用二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)可同時研究多個單因素水平對響應(yīng)值的影響，是一種較好的設(shè)計方案。

本實(shí)驗(yàn)以鰱魚糜為原料，采用二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計研究超聲功率、時間及鹽含量三者同時對魚糜凝膠TCA-可溶性肽的影響，同時測定魚糜凝膠色度與持水性的變化，通過建立非線性回歸方程、繪制響應(yīng)面解析三因素的貢獻(xiàn)度及因素間的交互作用，探討超聲處理對不同鹽含量魚糜中蛋白質(zhì)降解情況及凝膠品質(zhì)的影響，以期為高強(qiáng)度超聲輔助魚糜凝膠的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鰱魚糜[AAA級，水分含量為73.26%（m/m）]，由井力水產(chǎn)食品有限公司提供。福林酚、氯化鈉等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；K600食品調(diào)理機(jī)，德國博朗電器公司；TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀，美國Stable micro system公司；1750型紫外可見分光光度計，日本島津公司；色度計，美國Hunter Lab公司；硬度計，日本Kiya Seisakusho公司。

1.3 方法

1.3.1 高強(qiáng)度超聲波處理與魚糜凝膠樣品制備

取150 g魚糜于真空袋（160×240×0.2 mm）中并封口，將其置于超聲清洗槽中，加入4 L冰水控制超聲溫度為（15±2）℃進(jìn)行超聲處理。

魚糜凝膠的制備參考本實(shí)驗(yàn)室前期[16]的方法。將魚糜用食品調(diào)理機(jī)空斬3 min，通過添加冰水調(diào)節(jié)水分含量至78%，加入NaCl后繼續(xù)斬拌5 min。斬拌后的肉糜經(jīng)抽真空、灌腸后，于40 ℃加熱1 h、90 ℃加熱0.5 h。加熱結(jié)束后，立即將魚糜凝膠置于流動水下冷卻，然后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱存放過夜，第二天進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

研究高強(qiáng)度超聲功率單因素對魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響時，實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：功率0～300 W，時間10 min，鹽含量2%（m/m）；研究超聲時間單因素對魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響時，實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：時間0～40 min，功率180 W，鹽含量2%（m/m）；研究鹽含量單因素對魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響時，實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：鹽含量0～2%（m/m），功率180 W，時間15 min。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)性能測定

將魚糜凝膠于室溫中平衡0.5 h，剝?nèi)ツc衣后，切成2 cm高的圓柱體。選用P/0.25S球形探頭測定樣品的破斷力與凹陷深度，測試參數(shù)設(shè)置為：探頭運(yùn)行程序Return to start，測前速度2 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度2 mm/s，觸發(fā)力5 g。每個樣品測試6～10個平行。

1.3.3 TCA-可溶性肽測定

取3 g魚糜凝膠樣品，加入5%（m/V）冷的TCA溶液（27 mL），并用高速分散機(jī)于6000 r/min下均質(zhì)1 min。均質(zhì)液于4 ℃下放置1 h，10000 r/min離心10 min后保留上清液。上清液中TCA-可溶性肽含量的測定參考Lowry法[17]，用酪氨酸作標(biāo)曲。

1.3.4 色度測定

將魚糜凝膠切成5 mm厚的薄片，使用色度計測定樣品的L*（亮度值）、a*（紅綠值）、b*（黃藍(lán)值）。魚糜凝膠的白度值（Whiteness，記為B）按下式計算：

式中：

B——白度；

L*——亮度值；

a*——紅綠值；

b*——黃藍(lán)值。

1.3.5 持水性測定

將樣品切成5 mm厚，記錄其質(zhì)量W1，用三層濾紙包裹薄片，使用硬度計對其施加5 kg恒力并持續(xù)3 min，去除濾紙后稱量樣品質(zhì)量，記為W2。持水性（Water Holding Capacity，WHC）按下式計算：

式中：

C——持水性（WHC），%；

W2——壓后樣品質(zhì)量，g；

W1——壓前樣品質(zhì)量，g。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用中心組合設(shè)計原理[6]，以超聲功率、時間及鹽含量為自變量，TCA-可溶性肽、色度及持水性為響應(yīng)值，設(shè)計二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)，因素水平表及組合設(shè)計表分別見表1、表2。采用SAS9.0軟件對二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行非線性回歸擬合，二階多項(xiàng)式如下：

表1 二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計因素水平表Table 1 Factor level table of quadratic rotation orthogonal design

表2 二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of quadratic rotation orthogonal design

式中：

Y——響應(yīng)值；

β——方程的回歸系數(shù)；

Xi、Xj——因素水平。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)，每次至少3個平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 9.0軟件作圖，SPSS 22.0軟件中的Duncan方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示數(shù)據(jù)間差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 高強(qiáng)度超聲功率對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響

高強(qiáng)度超聲功率對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響如圖1所示。與對照組相比，超聲處理后魚糜凝膠的破斷力顯著升高（P＜0.05），且隨著超聲功率增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在240 W時獲得最大值（452.21 g），較對照組提高了19.64%。有研究表明魚糜凝膠的破斷力與蛋白質(zhì)分子間的相互作用有關(guān)[18]。魚糜中的功能性蛋白是鹽溶性肌球蛋白[11]，其良好的分散性是促進(jìn)分子間相互作用的重要前提。前期研究發(fā)現(xiàn)[10]高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的溶解度，這有利于提高魚糜凝膠的破斷力。類似地，尹藝霖等[19]研究表明增大超聲功率促進(jìn)了肌原纖維蛋白的分散性，從而提高了蛋白凝膠性能。此外，由圖1可知，魚糜凝膠的凹陷深度隨超聲功率增大呈現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。當(dāng)超聲功率為180、210、240 W時，魚糜凝膠的破斷力與凹陷深度無顯著差異（P＞0.05），故選取180 W超聲功率為二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計的零水平值。

圖1 高強(qiáng)度超聲功率對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響Fig.1 Effect of HIU power-on the breaking force and deformation of surimi gels

2.1.2 高強(qiáng)度超聲時間對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率為180 W，研究了超聲時間對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響，結(jié)果見圖2。魚糜凝膠的破斷力隨著超聲時間延長呈先升高后下降的趨勢，在15 min時獲得最大值440.10 g，較未超聲處理提高了8.90%。高強(qiáng)度超聲處理適當(dāng)時間時，其產(chǎn)生的空穴效應(yīng)及高剪切力、微射流等機(jī)械效應(yīng)能夠提高魚糜中蛋白質(zhì)分子的分散性[20]，這有利于促進(jìn)熱誘導(dǎo)過程中蛋白質(zhì)間發(fā)生相互作用，破斷力增大；然而，超聲時間過長時，蛋白質(zhì)易發(fā)生降解[21]，從而降低了魚糜凝膠的破斷力。類似地，Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)相較于超聲時間15 min時，超聲處理30 min后蝦肉糜凝膠的破斷力顯著降低（P＜0.05）。此外，魚糜凝膠的凹陷深度隨超聲時間延長無顯著變化（P＞0.05）。

圖2 高強(qiáng)度超聲時間對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響Fig.2 Effect of HIU time on the breaking force and deformation of surimi gels

2.1.3 鹽含量對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響

圖3為鹽含量對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響。未添加NaCl時，樣品的破斷力與凹陷深度較低，僅為193.03 g、5.46 mm。隨著鹽含量升高，魚糜凝膠的破斷力與凹陷深度顯著增大（P＜0.05），當(dāng)鹽含量為2.0%（m/m）時，其破斷力與凹陷深度較對照組分別提高了127.16%、97.89%。魚糜膠凝過程中，蛋白質(zhì)分子（尤其鹽溶性蛋白）發(fā)生解折疊暴露出活性位點(diǎn)，促進(jìn)了分子間相互作用，形成質(zhì)地良好的彈性凝膠體[2]。低鹽環(huán)境中，肌球蛋白主要以組裝體形式存在[23]，溶解性較低，限制了加熱過程中蛋白質(zhì)分子的變性與聚集，從而魚糜凝膠質(zhì)地較差。增加鹽含量提高了肌球蛋白的溶出與分散性[10]，有利于熱誘導(dǎo)時蛋白質(zhì)分子充分伸展，從而促進(jìn)分子間發(fā)生相互作用，使得魚糜凝膠的破斷力與凹陷深度顯著增大。該結(jié)果與Cando等[24]的報道一致。

圖3 鹽含量對魚糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響Fig.3 Effect of NaCl contents on the breaking force and deformation of surimi gels

2.2 二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別選取超聲功率180 W、時間15 min及鹽含量1.5%（m/m）為中心水平，設(shè)計三因素五水平的二次旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

2.2.1 高強(qiáng)度超聲處理對不同含鹽量魚糜凝膠TCA-可溶性肽的影響

TCA-可溶性肽可表征蛋白質(zhì)的降解程度，其數(shù)值越大說明小分子肽含量越多，蛋白質(zhì)降解程度越高[16]。采用二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計研究了超聲功率、時間及鹽含量對魚糜凝膠TCA-可溶性肽的影響，結(jié)果如表2所示。二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計共包含23組實(shí)驗(yàn)，其中9組設(shè)置為零水平的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

對表2結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果表明，回歸方程Y=0.5198-0.0015X1-0.0048X2-0.1162X3+0.000002X12+0.00002X1X2+0.00005X22+0.0003X1X3+0.0175X32具有顯著性（R2=0.93，P＜0.01），說明該模型適用于描述本實(shí)驗(yàn)條件下TCA-可溶性肽的變化。

表3 TCA-可溶性肽的回歸系數(shù)與方差分析Table 3 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for TCA-soluble peptides

根據(jù)主因素回歸系數(shù)的絕對值判斷，鹽含量對TCA-可溶性肽的影響最大，超聲時間次之，超聲功率的影響最小。觀察表3發(fā)現(xiàn)，超聲功率、時間均與TCA-可溶性肽呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。魚糜中含有內(nèi)源性蛋白酶[25]，可將蛋白質(zhì)水解為小分子肽。據(jù)此結(jié)果推測超聲波處理可抑制內(nèi)源性蛋白酶的活性，削弱了其水解能力。有研究表明超聲波與傳統(tǒng)加熱聯(lián)用可有效抑制過氧化氫酶的活性[26]，胃蛋白酶和胰蛋白酶經(jīng)305.62 W/cm2強(qiáng)度超聲處理18 min后，活性分別下降了15%和50%[27,28]，類似地，Zhang等[29]通過研究超聲波輔助凝膠化發(fā)現(xiàn)超聲波處理抑制了羅非魚內(nèi)源性蛋白酶的活性。關(guān)于超聲處理對內(nèi)源性蛋白酶活性的影響及機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

此外，方差分析指出鹽含量與TCA-可溶性肽呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），即TCA-可溶性肽隨鹽含量升高而降低，這可能與內(nèi)源性蛋白酶活性受離子強(qiáng)度影響有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，當(dāng)鹽含量提高至5%時，魚糜中TCA-可溶性肽較1%鹽含量時下降了23.22%。相似地，Ohkubo等[30]對白魚中內(nèi)源性蛋白酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，增大鹽含量至3%即可抑制蛋白酶的活性。

由表3可知，X1X3（超聲功率-鹽含量）、X1X2（超聲功率-時間）的交互作用對TCA-可溶性肽具有顯著影響（P＜0.05），因此繪制響應(yīng)面解析兩因素間的交互作用，結(jié)果見圖4。由圖4a可知，低鹽條件下（0、0.5%），TCA-可溶性肽隨超聲功率升高而降低，說明超聲處理協(xié)同低鹽條件可抑制蛋白質(zhì)的降解，推測這與超聲處理抑制蛋白酶活有關(guān)。該結(jié)果一定程度上解釋了高強(qiáng)度超聲協(xié)同低鹽后魚糜凝膠的破斷力與凹陷深度升高[31]；然而，高鹽條件下（2%、3%），TCA-可溶性肽隨超聲功率升高而升高，這不利于魚糜凝膠品質(zhì)。鹽含量增加，魚糜中肌球蛋白的溶解性提高，推測分散性良好的蛋白質(zhì)分子經(jīng)超聲處理后更易發(fā)生降解，易損害魚糜的凝膠品質(zhì)。觀察圖4b發(fā)現(xiàn)，超聲功率較低（≤150 W）時，隨時間延長，魚糜凝膠的TCA-可溶性肽含量逐漸降低；然而，當(dāng)超聲功率高達(dá)240 W時，TCA-可溶性肽隨超聲時間延長逐漸升高。該結(jié)果說明，當(dāng)超聲強(qiáng)度較低時，延長超聲時間有利于更大程度地抑制蛋白酶活性，但是當(dāng)超聲強(qiáng)度較大時，長時間超聲處理也會造成蛋白質(zhì)分子降解，產(chǎn)生更多TCA-可溶性肽。

圖4 超聲功率-鹽含量（a）與超聲功率-時間（b）的交互作用對TCA-可溶性肽的影響Fig.4 Effect of interactive effect of HIU power-salt contents (a)and HIU power-time (b) on the TCA-soluble peptides

2.2.2 高強(qiáng)度超聲處理對不同含鹽量魚糜凝膠色度的影響

色度是評價魚糜制品品質(zhì)的重要指標(biāo)[32]，由表4可知，色度的回歸模型均具有顯著性（P＜0.01）。超聲功率與L*、b*、白度值顯著正相關(guān)（P＜0.01），增大超聲功率可獲得白度較大的魚糜凝膠，推測這與超聲處理誘導(dǎo)形成了致密的凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān)[33]，從而樣品表面光反射率變大，白度值增加。此外，鹽含量與a*、b*呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），即鹽含量降低，魚糜凝膠的紅綠值、黃藍(lán)值增大。a*取決于魚糜中肌紅蛋白的含量[34]，當(dāng)鹽含量降低時，魚糜在膠凝過程中易發(fā)生蒸煮損失，析出較多水分，推測肌紅蛋白的濃度因此增大，導(dǎo)致a*升高。Pietrasik和Li-Chan[6]也報道了類似的結(jié)果。超聲時間對各指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）。進(jìn)一步觀察表4發(fā)現(xiàn)，超聲功率、時間及鹽含量間的交互作用對色度影響不顯著（P＞0.05）。

表4 色度的回歸系數(shù)與方差分析Table 4 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for color values

2.2.3 高強(qiáng)度超聲處理對不同含鹽量魚糜凝膠持水性的影響

持水性可用于表征蛋白質(zhì)與水分子之間的結(jié)合能力[35]。方差分析（表5）顯示，持水性方程具有顯著性（R2=0.85，P＜0.01），且魚糜凝膠的持水性與鹽含量成正比（P＜0.01），即增大鹽含量，魚糜凝膠持水性隨之提升。隨鹽含量升高，由于電荷屏蔽效應(yīng)使肌原纖維蛋白之間的靜電斥力增大[10]，肌球蛋白溶出增多，蛋白質(zhì)分散得更好，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)更加致密均勻[11]，提升了對水分子的截留能力。

表5 持水性的回歸系數(shù)與方差分析Table 5 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for WHC

觀察表5發(fā)現(xiàn)，超聲功率及時間對魚糜凝膠持水性無顯著影響（P＞0.05），這似乎與前期實(shí)驗(yàn)[16]相矛盾，但其實(shí)不然，本實(shí)驗(yàn)的超聲參數(shù)與文獻(xiàn)報道存在差異。另外，由表5可知，鹽含量對持水性的影響最大，其回歸系數(shù)（29.435）遠(yuǎn)大于超聲功率（0.032）與時間（0.228）的回歸系數(shù)，推測鹽含量水平削弱了超聲功率及時間水平對凝膠持水性的影響。

3 結(jié)論

用于評價魚糜凝膠品質(zhì)的模型均具有顯著性（P＜0.01），且各因素對魚糜凝膠品質(zhì)影響的貢獻(xiàn)度依次為鹽含量＞超聲時間＞超聲功率。主因素分析表明鹽含量與TCA-可溶性肽呈負(fù)相關(guān)，增大鹽含量可抑制蛋白質(zhì)降解，從而獲得持水性較高和紅度值較低的凝膠體。此外，交互作用分析揭示了低鹽與超聲功率間存在協(xié)同效應(yīng)，增大超聲功率降低了低鹽魚糜中蛋白質(zhì)的降解程度，提高了其持水性。綜上，高強(qiáng)度超聲波的應(yīng)用可抑制低鹽環(huán)境中蛋白質(zhì)的降解，這有利于提高低鹽魚糜的凝膠性能。