焦文娟，黃華丹，葉鎧雯，劉琳，費永濤，張業(yè)輝，趙甜甜，劉偉峰，陳帥，周芳，張友勝

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）（2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室，廣東廣州 510642）（3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510225）

食品新鮮度是消費者判定食品質(zhì)量和安全的一個可靠指標，能夠反應(yīng)食品的質(zhì)量、顧客的接受度及食用安全性。隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展、人們消費觀的轉(zhuǎn)變，人們對食品的鮮度要求越來越高。因此，新鮮度的檢測尤為重要，快速無損的鮮度可視化的智能包裝受到廣泛關(guān)注[1]。

食品鮮度指示膜是智能包裝的一種，通過顏色的變化指示原料的新鮮度，實現(xiàn)對食品原料鮮度的檢測及實時監(jiān)控。鮮度指示膜由顏色指示劑和成膜基質(zhì)兩個部分組成，目前用于智能指示膜的比色指示劑主要是合成的，包括甲基紅、溴甲酚紫等化學(xué)染料[2]。由于合成化學(xué)染料具有毒性，會對人體健康產(chǎn)生一定的危害[3]，因此，開發(fā)具有天然安全無毒的指示劑顯得尤為重要?；ㄉ帐且环N無毒無害的天然水溶性色素，主要結(jié)構(gòu)會隨著pH值的變化而變化，從而呈現(xiàn)不同的顏色[4]，可以滿足鮮度指示膜指示劑的要求。目前，天然色素作為指示劑也成為了國內(nèi)外研究的熱點之一。Zhai等[5]采用玫瑰茄花色苷作為指示劑，用于指示魚肉的新鮮度變化，指示膜顏色由紅變?yōu)闇\藍色。Ma等[6]研發(fā)了PVA-殼聚糖納米顆粒-桑椹提取物薄膜用于實時監(jiān)測魚的腐敗，發(fā)現(xiàn)顏色由紅變綠色。

花色苷作為天然色素已經(jīng)在鮮度指示膜進行廣泛應(yīng)用，但單一的天然色素存在一定的局限性，比如花色苷的性質(zhì)不穩(wěn)定、易受外界環(huán)境的影響，如何提升花色苷的穩(wěn)定性受到廣泛關(guān)注。將花色苷與輔色劑復(fù)合使用是常見的提高花色苷穩(wěn)定性的方法之一，沒食子酸作為常用的輔色劑，已在果酒或果汁中進行花色苷的輔色應(yīng)用[7]。因此，本研究選擇花色苷與沒食子酸進行復(fù)配制備鮮度指示膜，以期提高花色苷的穩(wěn)定性以及增加花色苷在不同pH值范圍內(nèi)的顯色差異，以沒食子酸來補充花色苷的變色局限范圍，為鮮度指示膜的實際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓花色苷（5%～25%）、聚乙烯醇（1788型、0588低粘度型）、丙三醇（分析純），購于羅恩試劑；明膠，食品級，購于河南萬邦實業(yè)有限公司；沒食子酸，購于上海源葉生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸、氧化鎂，分析純，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉，分析純，購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硼酸，分析純，購于福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；甲基紅，分析純，購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠，分析純，購于上?；瘜W(xué)試劑總廠；基圍蝦，購于廣州盒馬鮮生。

1.2 儀器與設(shè)備

EUROSTAR 60 digital頂置式攪拌器，德國IKA公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PB-10 pH計，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JJ1000電子天平，常熟市雙態(tài)測試儀器廠；SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計，日本SHIMADZU公司；OHG101-3B電熱恒溫干燥箱，上海喆鈦機械制造有限公司；FYL-YS-50LK恒溫箱，北京福意聯(lián)電器公司；VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜，德國Bruker公司；S-3400掃描電子顯微鏡，Hitachi高新技術(shù)有限公司；L＆W厚度儀，瑞典Lorentzen＆Wettre公司；INSTRON 5566電子萬能材料試驗機，美國INSTRON公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀，丹麥福斯（FOSS）集團公司。

1.3 方法

1.3.1 指示膜的制備

稱取0.6 g明膠，加入5 mL丙三醇以及80 mL去離子水，在85 ℃條件下攪拌加熱30 min，然后加入5.4 g低粘度型聚乙烯醇和高粘度型聚乙烯醇，在100 ℃條件下攪拌加熱2 h，期間補足水分。

將上述制成的混合溶液于35 ℃的水中攪拌30 min至其冷卻，加入25 mL花色苷+沒食子酸混合溶液，在35 ℃條件下攪拌交聯(lián)1 h。之后，使用針筒吸取15 mL膜液至于培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中，在35 ℃烘箱中干燥48 h。以此方法制備3種不同比例的指示膜（m花色苷:m沒食子酸=1:0.7、1:0.5、1:0.3）。揭膜后置于相對濕度為50%、溫度為25 ℃的恒溫恒濕中平衡48 h后測定性能。

1.3.2 紫外-可見光光譜的測定

制備不同pH梯度的磷酸鹽緩沖溶液（pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）。制備質(zhì)量濃度為2.5 g/L的花色苷溶液和沒食子酸混合溶液，分別取1 mL花色苷溶液以及1 mL花色苷溶液+0.7、0.5、0.3 mL沒食子酸溶液至10 mL血清瓶中，添加不同pH值梯度的磷酸鹽緩沖溶液至10 mL，混合均勻后使用UV-1800紫外-可見分光光度計進行可見光光譜掃描，波長范圍為400～800 nm[8]。

1.3.3 傅立葉變換紅外光譜的測定

采用傅立葉變換紅外光譜儀分別測定明膠膜、聚乙烯醇膜、明膠聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+沒食子酸膜7種膜的紅外吸收光譜，波數(shù)范圍設(shè)置為3500～500 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)的測定

將明膠膜、聚乙烯醇膜、明膠聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+沒食子酸膜用鋒利刀片切成2 mm×1 mm的薄片，經(jīng)液氮凍裂，真空濺射噴金后，使用Hitachi（日立）S-3400掃描電子顯微鏡觀察膜橫截面的微觀形貌，加速電壓為5 kV。

1.3.5 厚度和機械性能的測定

將制備好的7種膜（明膠膜、聚乙烯醇膜、明膠聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+沒食子酸膜）在恒溫恒濕室內(nèi)（25 ℃，50% RH）放置3 d，然后進行厚度和機械性能的測定。

膜的厚度采用L＆W micrometer 250測定。在待測膜上隨機取5個點測定，取平均值。膜的機械性能使用INSTRON testing machine 5566測定，參照GB/T 1040.3-2006的方法[9]，使用電動沖片機將膜裁剪成啞鈴型，有效測試長度和寬度為12 mm×2 mm，拉伸速度設(shè)定為100 mm/min，測量膜的抗拉強度（Tensile Strength，TS）和斷裂伸長率（Elongation at the Break，EB），每種膜作5個平行，取均值。

1.3.6 指示膜在監(jiān)測基圍蝦鮮度的初步應(yīng)用

購買新鮮的基圍蝦，取可食用部分備用。將花色苷膜和不同比例混合復(fù)合膜，粘貼在一次性飯盒的盒蓋上，指示膜與基圍蝦不直接接觸。每個飯盒放20 g蝦肉，蓋上盒蓋，貼上保鮮膜，于室溫下放置48 h，并根據(jù)GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[10]要求，每隔12 h測定一次揮發(fā)性鹽基氮。

1.3.7 指示膜的色差分析

對于用于指示基圍蝦貯藏過程中的鮮度指示膜進行色差分析，利用色差儀根據(jù)CIE-L*a*b*顏色系統(tǒng)，測定膜的明暗度（L*）、紅綠度（a*）、黃藍度（b*）。以標準白板為色差參比，并按以下公式（1）計算總色差（ΔE）。

式中：

ΔL＝L*-L0*；

Δa＝a*-a0*；

Δb＝b*-b0*；

L*、a*、b*——待測樣品的實測值；

L0*、a0*、b0*——標準白板的值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

實驗結(jié)果表示為平均值±標準差，使用Origin 21軟件和SPSS軟件Duncan’s進行圖表繪制和方差分析，P＜0.05時表明存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜和顏色變化分析

圖1和圖2是四種溶液在不同pH值環(huán)境下的顏色變化和紫外-可見光譜圖。如圖1a所示，隨著溶液的pH值由2.0增加到11.0，花色苷溶液由紅色逐漸變?yōu)樽攸S色，當(dāng)在pH值2.0～3.0酸性條件下，花色苷結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為黃烊陽離子，溶液呈現(xiàn)紅色；當(dāng)在pH值4.0～6.0條件時，顏色逐漸變淺，因為黃烊陽離子被水親核攻擊而水合，花色苷結(jié)構(gòu)從黃烊陽離子轉(zhuǎn)化為無色的甲醇假堿和查爾酮；當(dāng)在pH值7.0～9.0條件時，溶液顏色呈褐色；當(dāng)pH值增至11.0時，花色苷被降解，溶液顏色逐漸轉(zhuǎn)為黃棕色[11,12]。從圖2a可知，不同pH值條件下花色苷溶液的最大吸收峰波長也有差異，在pH值2.0～3.0條件下，最大吸收峰波長為512 nm；當(dāng)pH值增至8.0時，最大吸收峰變?yōu)?70 nm；當(dāng)pH值從9.0增加到11.0時，最大吸收峰為563 nm?；ㄉ杖芤旱念伾兓臀辗宓囊苿优c花色苷自身結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變有關(guān)，在酸性條件下，512 nm處的最大吸收峰是由于花色苷黃烊陽離子的存在；在堿性條件下，花色黃烊陽離子與羥基離子共同作用形成無色的甲醇假堿和查爾酮，隨著pH值的增加，最大吸收峰波長移動到563 nm處[11-13]。

圖1 在pH值2.0～11.0緩沖溶液的顏色變化Fig.1 Color change of buffer solutions in the pH range of 2.0～11.0

圖2 溶液的紫外-可見光譜Fig.2 UV-Vis spectra of solution

由圖1和2所示，花色苷溶液與沒食子酸溶液按比例（m花色苷:m沒食子酸=1:0.7、1:0.5、1:0.3）混合，隨著溶液的pH值由2.0增加至11.0，混合溶液的顏色變化很明顯。當(dāng)pH值≤6.0時，混合溶液的顏色由亮紅色逐漸變?yōu)闇\紅色；當(dāng)pH值為7.0時，溶液呈淺棕色；當(dāng)pH值為8.0時，溶液呈灰色；當(dāng)pH值9.0時，溶液呈灰藍色；在pH值10.0～11.0時，溶液由深綠色向黃綠色轉(zhuǎn)變。與花色苷溶液相比，在pH值2.0～3.0時的最大吸收峰值差別不大，但在pH值8.0時，不同比例混合溶液的最大吸收峰值在596 nm左右，且最大吸收峰隨著pH值增大而增強，在pH值11.0時，不同比例混合溶液的最大吸收峰為601 nm。紅移現(xiàn)象以及吸光度的增加都說明了花色苷和沒食子酸之間存在相互作用，且加入沒食子酸后，混合溶液在不同pH值條件下呈現(xiàn)的色調(diào)更豐富，顏色差異有顯著的提升[14]。添加沒食子酸能夠使花色苷在不同的pH值條件下呈現(xiàn)更多的顏色變化，能夠提升花色苷作為pH值敏感指示劑的潛在應(yīng)用價值。

3.2 傅立葉紅外光譜分析

圖3是7種膜的紅外光譜圖。分別分析明膠膜、聚乙烯醇膜、明膠聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+沒食子酸膜共7種膜的傅立葉紅外光譜，以更深入地了解花色苷、沒食子酸和明膠以及聚乙烯醇之間的化學(xué)相互作用。如圖3所示，聚乙烯醇膜的紅外光譜圖中，3292 cm-1處為-OH的伸縮振動吸收峰，2918 cm-1處為-CH2的伸縮振動吸收峰，1421、1373、1083 cm-1處分別為-CH2變形振動吸收峰、-OH的變形振動吸收峰以及C-O的伸縮振動吸收峰[15]。在明膠膜的紅外吸收光譜圖中，在3292、3075、1630、1539和1236 cm-1處的特征峰分別是由-OH的伸縮振動、N-H的伸縮振動和蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶、Ⅲ帶峰引起的[16]。在明膠聚乙烯醇膜的紅外光譜圖中，與明膠膜和聚乙烯醇膜比較發(fā)現(xiàn)，共混后在3292 cm-1處的-OH伸縮振動吸收峰變寬而強，以及在2918 cm-1處的-CH2的伸縮振動吸收峰變尖，說明了明膠和聚乙烯醇直接存在強烈的氫鍵作用[17]。共混膜的蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶、Ⅲ帶峰分別藍移至1718、1654、1245 cm-1處，進一步證明明膠和聚乙烯醇存在相互作用。加入花色苷后，沒有新峰產(chǎn)生，說明沒有新的共價鍵生成，特征峰的位置和明膠聚乙烯醇膜的相差不大，說明花色苷與明膠聚乙烯醇膜相容性很好，其化學(xué)成分沒有受到明膠和聚乙烯醇的影響，且在1654 cm-1和1556 cm-1處，添加花色苷的特征吸收峰有明顯的增強，是由花色苷中芳香環(huán)骨架上的C=C鍵振動引起，表明其與成膜基質(zhì)存在分子間相互作用[18]。在加入沒食子酸的復(fù)合膜的紅外光譜圖中，同樣沒有新峰產(chǎn)生，說明沒有新的共價鍵形成，且峰的位置與花色苷膜的峰的位置差別不大，對比花色苷膜，在1556 cm-1和1253 cm-1處，添加了沒食子酸的膜在這兩處特征吸收峰變淺，這兩處是芳香環(huán)骨架上的C=C鍵振動[19]和酚類物質(zhì)的-OH鍵面內(nèi)彎曲振動引起[20]，這表明了沒食子酸可以和花色苷很好的結(jié)合，其化學(xué)成分沒有受到影響。

圖3 明膠、聚乙烯醇、明膠聚乙烯醇膜及復(fù)合膜的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectra of gelatin, polyvinyl alcohol, gelatin- polyvinyl alcohol and composite films

3.3 膜的顏色

顏色是指示膜的一個重要特征指標，通過L*、a*、b*和ΔE值對膜的顏色響應(yīng)進行評價，L*表示顏色的明度從暗到亮，a*表示顏色由紅（+）到綠（-），b*表示顏色由黃（+）到藍（-）。如表1所示，相比于花青素膜，不同沒食子酸比例復(fù)合膜的L*和ΔE值顯著增大（P＜0.05），a*值顯著降低（P＜0.05），復(fù)合膜的“綠色”增強、亮度增加，表現(xiàn)出明顯的顏色變化，這可能是由于助色劑（沒食子酸）與花青素之間的相互作用導(dǎo)致的[7]。對于三種不同沒食子酸含量的復(fù)合膜而言，復(fù)合膜（1:0.5）的L*值呈現(xiàn)最大值（95.87），而a*和b*值呈現(xiàn)最小值，分別為-7.14和6.94。復(fù)合膜（1:0.5）的ΔE值最大（96.39），隨著沒食子酸含量的繼續(xù)增加（1:0.7），反而降低了指示膜的色差值，這可能是由于過量沒食子酸的原因。

表1 不同指示膜的顏色Table 1 Color of the different indicates films

3.4 指示膜的微觀結(jié)構(gòu)分析

采用電子掃描電鏡對明膠膜、聚乙烯醇膜、明膠聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+沒食子酸膜共7種膜橫截面微觀結(jié)構(gòu)觀察。如圖4所示，明膠膜的橫截面光滑，從而也可以看出明膠具有脆性斷裂的特點。聚乙烯醇膜的橫截面可以看出存在與韌性斷裂變形的區(qū)域。共混后的明膠聚乙烯醇膜的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，橫截面存在一些顆粒，但比較均勻，沒有顯著的相分離現(xiàn)象，說明明膠和聚乙烯醇具有良好的相容性。加入花色苷后，復(fù)合膜的橫截面出現(xiàn)一些微孔，這可能膜液自身存在氣泡而導(dǎo)致，因為多酚能夠與蛋白作用而增強其起泡性[21,22]。加入沒食子酸后，復(fù)合膜的橫截面相比花色苷膜光滑很多，可以看見多酚均勻分布在膜表面，填補了一些微孔，使復(fù)合膜的致密性增加。但當(dāng)沒食子酸的含量增加到m花色苷:m沒食子酸=1:0.7時，復(fù)合膜上的絮凝物增加，也更粗糙，推測可能是多酚的含量過高而引起蛋白聚集[23]。

圖4 膜橫截面的掃描電鏡Fig.4 Scanning electron micrographs of cross sections of films

3.5 厚度和機械性能分析

膜的力學(xué)性能與成膜基材密切相關(guān)。如表2所示，明膠和聚乙烯醇共混后的復(fù)合膜厚度有顯著增加（P＜0.05），花色苷和沒食子酸的加入也對指示膜的厚度有所影響。加入花色苷之后，膜的厚度有一定的減少，可能是花色苷與明膠和聚乙烯醇產(chǎn)生了分子間的相互作用，從而導(dǎo)致厚度有一定程度的減少。添加沒食子酸作為花色苷的輔色劑后，膜的厚度隨沒食子酸添加量的增加而增加，可能是沒食子酸降低了分子間的相互作用，使得分子間距離增大，導(dǎo)致膜的厚度增加[24]。

表2 7種膜的厚度及機械性能Table 2 Thicknesses and mechanical properties of seven films

評價包裝材料性能的還有兩個重要指標，就是抗拉強度和斷裂伸長率，膜的機械性能受結(jié)晶結(jié)構(gòu)和分子間作用力的影響[25]。明膠與聚乙烯醇共混后，膜的抗拉強度顯著降低（P＜0.05），而加入花色苷后有小幅度的增加（P＜0.05），但再加入沒食子酸后有所下降。拉伸強度主要與膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和分子間氫鍵作用力有關(guān)，花色苷的加入有利于氫鍵形成，膜的抗拉伸強度更高，但加入沒食子酸與花色苷相互作用形成輔色復(fù)合體后，分子內(nèi)相互作用減弱，從而導(dǎo)致抗拉伸強度有一定幅度的降低[26]。而明膠和聚乙烯醇共混后，斷裂伸長率有極大的提升，高達1234.30%。加入花色苷和沒食子酸后，斷裂伸長率雖然有所降低，但都在1000%～1200%之間，明顯高于鄒小波等[27]以淀粉、殼聚糖和聚乙烯醇作為成膜基底材料制備的指示膜（88.16%），而降低的原因可能是花色苷和沒食子酸占據(jù)了更多的空隙位點，減少了水分與明膠和聚乙烯醇間的交聯(lián)[28]。

3.6 鮮度指示膜在基圍蝦新鮮度檢測的初步應(yīng)用分析

圖5是基圍蝦在不同時間的揮發(fā)性鹽基氮和pH值變化圖。魚蝦等肉類腐敗變質(zhì)時，伴隨著蛋白質(zhì)的降解，以及揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生，同時導(dǎo)致貯藏環(huán)境pH值的上升，從而使鮮度指示膜的顏色發(fā)生改變[29]。由圖5可知，隨著放置時間的延長，蝦肉中的TVB-N含量和pH值不斷上升。TVB-N初始值為1.13 mg/100 g，36 h后的TVB-N含量升高至22.8 mg/100 g，48 h后TVB-N含量高達41.53 mg/100 g。根據(jù)GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產(chǎn)品》[30]的規(guī)定，蝦類的消費限值是20 mg/100 g，所以基圍蝦在室溫放置大約32 h（18.80 mg/100g ）后便不能繼續(xù)銷售以及食用?；鶉r的初始pH值為6.83，經(jīng)過12 h的貯藏達到7.22，經(jīng)過48 h的貯藏為7.84。

圖5 基圍蝦揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和pH值的變化Fig.5 Changes of volatile base nitrogen (TVB-N) and pH in basal shrimps

花色苷膜及不同比例的復(fù)合膜在12、24、36 h和48 h時間的顏色及色差ΔE如表3所示，最開始指示膜的顏色是深灰色，24 h后，花色苷膜呈淡黃色，添加了沒食子酸的膜呈淡褐色，此時蝦肉開始腐蝕，散發(fā)出腐臭味。36 h時，花色苷膜的顏色變?yōu)榈S色，添加了沒食子酸的膜呈深綠色，此時蝦肉已經(jīng)不能食用。48 h時，蝦肉高度腐敗，花色苷膜顏色為棕黃色，添加了沒食子酸的膜呈金黃色?；ㄉ漳ぜ安煌壤膹?fù)合膜在24～48 h內(nèi)ΔE的變化呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），但添加沒食子酸的復(fù)合膜的顏色變化更易被肉眼感知和區(qū)別，能更加清晰地反映了基圍蝦的鮮度變化。因此，添加沒食子酸的復(fù)合膜用于基圍蝦的新鮮度指示效果更好。

表3 指示膜的ΔE及外觀顏色變化Table 3 The ΔE and color change of the indicates films

3 結(jié)論

沒食子酸的加入能夠拓寬花色苷在不同pH值條件下的顯色豐富度，且花色苷和沒食子酸與成膜基質(zhì)的相容性很好。加入花色苷之后，膜的厚度有一定的減少，隨著沒食子酸含量的增加，膜的厚度逐漸增加。沒食子酸的添加導(dǎo)致抗壓強度降低，加入花色苷和沒食子酸后，斷裂伸長率雖然有所降低，但都在1000%～1200%之間，添加少量的沒食子酸能夠使復(fù)合膜的橫截面相對光滑（m/m，1:0.3和1:0.5）。將指示膜用于基圍蝦的鮮度指示，隨著時間的推移，基圍蝦逐漸腐敗變質(zhì)，添加沒食子酸的復(fù)合膜顏色變化更明顯（由灰色變成黃色），指示效果好。研究結(jié)果表明花色苷和沒食子酸是智能指示膜的理想指示原料，可用于開發(fā)指示水產(chǎn)品新鮮度的智能包裝，為進一步開發(fā)可視化鮮度指示膜奠定基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用潛力。