付竹賢，關(guān)仁梅，王淑敏，陳偲，羅璠

（1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部四川省重點實驗室，四川成都 610041）（2.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川成都 610041）

腸球菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的菌株[1]，因其具有明顯益生作用，目前廣泛應(yīng)用于奶酪、泡菜、香腸等發(fā)酵食品以及動物飼料生產(chǎn)中[2]。腸球菌是一類來源廣泛、功能多樣而且又具有致病性的微生物種類，由于其抗逆性強的特點，近年來常被作為益生菌用于飼料工業(yè)中，同種類和來源的腸球菌其功能、致病性和抗生素抗性就可能存在較大差異，因此腸球菌種的準確鑒定就顯得尤為必要[3]。腸球菌種類豐富，不同種的腸球菌益生性及安全性也有明顯差異，近年來腸球菌異位感染現(xiàn)象增多，腸球菌使用的安全性受到質(zhì)疑，因此快速準確區(qū)分種間腸球菌差異對于其合理使用及臨床治療都有重要意義[4]。

隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是一種快速的基因分析鑒定法，自20世紀90年代問世以來，因其操作簡便快速、條帶豐富、容易分型等特點，廣泛應(yīng)用于物種遺傳親緣關(guān)系分析、物種鑒定[5-8]等方面。該技術(shù)利用隨機引物對樣品進行擴增，事先不需要知道被測樣品的基因序列，擴增的多態(tài)性條帶可用于樣品間親緣關(guān)系的分析[9-12]，且簡單靈敏、經(jīng)濟便捷，鑒于RAPD的明顯優(yōu)勢，目前在多種生物分型鑒定中廣泛被采用[13-19]。RAPD技術(shù)在細菌的基因分型研究中有深入地研究和應(yīng)用，如Eduardo等[20]利用RAPD-PCR分型技術(shù)對Malasseziaspp.進行分析，可以得出不同來源的菌株彼此間的親緣關(guān)系，且發(fā)現(xiàn)特異性的擴增帶能夠區(qū)分各菌株。Marisa等[21]利用RAPD技術(shù)對芽胞桿菌進行分型鑒定，結(jié)果表明芽胞桿菌在屬內(nèi)存在很高的多態(tài)性。Christian等[22]比較了16S rDNA和RAPD-PCR技術(shù)檢測對171株乳酸菌分離株的鑒定結(jié)果，結(jié)果均為彎曲乳桿菌、桑弗朗西斯乳桿菌和腸球菌，兩者的鑒定結(jié)果相同。

在細菌分類學中可以使用幾種管家基因在種屬水平上進行鑒定分析，因為它整合了細菌染色體周圍不同分子鐘的信息，除16S rDNA基因，管家基因rpoA（編碼RNA聚合酶α鏈）測序?qū)δc球菌屬的物種鑒定具有較高的鑒別力，也被用于腸球菌種水平鑒定[23]。腸球菌種間差異度小，常用的16S rDNA分析不能準確區(qū)分種間腸球菌差異，目前常用于細菌基因分型的分子生物學方法，如隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）、脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）和擴增片段長度多態(tài)性分析（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）等[24]，在腸球菌種間大規(guī)?？焖勹b定中的應(yīng)用還未見系統(tǒng)深入研究和相似度的分型標準。

因此，本研究通過構(gòu)建RAPD篩選體系和分型標準，為腸球菌菌群規(guī)?；焖勹b定提供可行的方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

已知菌株：屎腸球菌（Enterococcus faecium）B13、1003、999、1056、888、7’、106、166、1020、1018、1062、1208、1232、141、451、1074、1096；

耐久腸球菌（Enterococcus durans）15、130、426、22-2、1029、127、10’、178、1451；

海氏腸球菌（Enterococcus hirae）39、1019、1021、1041、1061、1065；

以上32株腸球菌使用16S rDNA結(jié)合rpoA管家基因鑒定。

未知腸球菌：1042、401、461、472、1231、1246、115、147、1004、1005、1009、1010、1011、1014、1016、1017、1024、1026、1027、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1037、1038、1044、1045、1049、1050、1051、1054、1055、1057、1059、1060、1064、1066、1069、1073、1082、1087、1099、1101、1008。

以上46株菌株均分離純化于農(nóng)家傳統(tǒng)泡菜，使用16S rDNA鑒定到屬水平。

1.2 主要儀器設(shè)備

立式自動壓力蒸汽滅菌器，廈門致微儀器有限公司；精密電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；微波爐，廣東美的廚房電器制造有限公司；高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超凈工作臺，中國青島海爾有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特設(shè)備有限公司；超微量核酸蛋白測定儀，上海學靜生物科技有限公司；智能凝膠化學發(fā)光成像系統(tǒng)，中國天能公司；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；水平電泳儀，南京庚辰科學儀器有限公司。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR Master Mix預混酶、Marker DL5000、Marker DL2000均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；Agarose瓊脂糖、50×TAE電泳緩沖液和Gel RED核酸染料購于北京擎科生物科技有限公司；TE緩沖液（pH值8.0）、；PBS緩沖液（pH值7.4）、MRS液體培養(yǎng)基均購于成都欣億維有限公司；DP302型細菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 模板篩選

1.4.1.1 模板提取方法比對

從-20 ℃冰箱中取出保藏菌株，以1%的接種量接種于1 mL的MRS液體培養(yǎng)基，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)16 h。選用試劑盒法和微波提取法兩種方法提取基因組DNA，試劑盒提取方法按說明書操作步驟進行，微波法提取DNA具體操作為：取細菌培養(yǎng)液1 mL，10000 r/min離心2 min，棄去上清液，用1 mL PBS溶液洗滌兩次、1 mL 1xTE溶液洗滌一次，用200 μL 1xTE溶液重懸，功率700 W的微波爐預熱1 min后，加熱2 min，13000 r/min離心5 min，收集上清液即為DNA。用超微量核酸蛋白測定儀測定2種提取方法獲得的基因組DNA OD260/OD280值和DNA的濃度，并電泳檢測基因組DNA條帶及RAPD條帶比較。

1.4.1.2 儲存時間對模板的影響

提取模板于-20 ℃分別存放0、30、50、60、70、80、90 d，電泳檢測基因組DNA的條帶及RAPD分型條帶，選取條帶清晰且重復性好的時間，作為模板保存時間。

1.4.2 單引物篩選

以基因組DNA為模板，選擇8條隨機引物，對模板DNA進行單引物擴增，選取條帶清晰且條帶較多的引物，用于后續(xù)試驗。引物序列信息如表1所示。

表1 RAPD分型隨機引物序列信息Table 1 Oligonucleotide primers used to perform PCR reactions

1.4.3 RAPD雙引物反應(yīng)體系的優(yōu)化

參考劉剛[26]的多條引物擴增條件以及擴增體系略加修改，以屎腸球菌999為模板，隨機選用Primer1+Primer5引物分別對引物添加量、模板添加量進行優(yōu)化。

1.4.3.1 引物添加量篩選

引物添加量梯度設(shè)置為：0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 μL。

1.4.3.2 模板添加量篩選

模板添加量梯度設(shè)置：0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 μL。

1.4.4 雙引物篩選

1.4.4.1 初篩

將篩選到的多態(tài)性良好的單一隨機引物，進行兩兩組合。在篩選得到的RAPD反應(yīng)條件下，選擇B13、1003、999、1056、15、130、178、39、1019、1021作為模板DNA，進行RAPD-PCR擴增，篩選出特異性、穩(wěn)定性高的雙引物組合。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V，30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察后拍照留存。每個實驗重復3次。

1.4.4.2 復篩

在篩選得到的RAPD反應(yīng)條件下，用初篩得到的6對雙引物對32個腸球菌菌株DNA模板進行種間RAPD分型研究。

1.4.5 重復性實驗

1.4.5.1 擴增批次內(nèi)重復性實驗

每個樣品在同個PCR儀上進行3個RAPD-PCR平行實驗，通過比較電泳圖譜判定RAPD-PCR的重復性。

1.4.5.2 擴增批次間重復性實驗

每個樣品，在同個RCR儀上分批擴增3次，比較電泳圖譜判定擴增批次間實驗的重復性。

1.4.6 RAPD在腸球菌分型中的應(yīng)用和驗證

1.4.6.1 RAPD分型

在篩選的RAPD反應(yīng)條件下，用1.4.4篩選出的最適RAPD雙引物對24株已知腸球菌和46株未知腸球菌進行RAPD分型鑒定。

1.4.6.2 管家基因驗證

使用rpoA基因序列分析RAPD分型中各個類別的代表菌株。

PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 1 μL，2×Taq Master Mix預混酶12.5 μL，正反引物各1 μL，無菌雙蒸水9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min，（95 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min 15 s，72 ℃延伸1 min 15 s）3次循環(huán)，（95 ℃變性35 s，46 ℃退火1 min 15 s，72 ℃延伸1 min 15 s）30次循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。? μL擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增產(chǎn)物大小。對合格產(chǎn)物進行序列測定。使用NCBI網(wǎng)站BLAST進行在線比對，比對結(jié)果＞97%鑒定為同一菌種[27]。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Gel RED核酸染料膠染法制膠，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離擴增產(chǎn)物。取5 μL擴增產(chǎn)物點樣于凝膠孔，電泳緩沖液為1×TAE，120 V恒壓電泳30 min后通過凝膠成像系統(tǒng)拍照。對RAPD標記進行處理，并按顯性標記計數(shù)，將電泳圖上清晰的條帶標記為“1”，而在同一位置沒有或不易區(qū)分的條帶標記為“0”，并構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣，用NTsys進行聚類分析，構(gòu)建各菌株的遺傳距離聚類圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 模板篩選

2.1.1 模板提取方法的篩選

經(jīng)微量核酸檢測儀檢測，試劑盒法提取的DNA的OD260/280為1.8～2.0，DNA質(zhì)量濃度為123～353 μg/mL微波法所得到的DNA的OD260/280為1.9～2.1，DNA質(zhì)量濃度為106～308 μg/mL。從數(shù)據(jù)上，雖然試劑盒提取法較微波提取法好，但是微波提取法較為方便快捷，適合大規(guī)模提取，且RAPD分型效果與試劑盒結(jié)果無明顯差異，因此選擇使用微波法用于模板提取。

2.1.2 DNA模板穩(wěn)定性

模板穩(wěn)定性影響RAPD分型結(jié)果，研究結(jié)果顯示微波法提取的DNA模板在-20 ℃條件下90 d保存期間內(nèi)擴增出的RAPD圖譜無明顯變化，說明經(jīng)由微波法提取的DNA模板在-20 ℃條件下在90 d內(nèi)均可用于RAPD-PCR分型研究。

2.2 單引物篩選結(jié)果

如圖1所示，屎腸球菌999的在8條隨機引物擴增下Primer 1～7均可獲得多態(tài)性條帶（泳道1～7），而Primer 8沒有擴增出條帶。因此選用Primer 1～7作為后續(xù)雙引物篩選試驗的引物。

圖1 不同單引物的RAPD-PCR擴增電泳圖Fig.1 RAPD-PCR amplification by different single primer

2.3 RAPD雙引物反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.3.1 最適引物添加量

如圖2所示，引物添加量在0.1～1 μL范圍內(nèi)，隨著引物添加量的增加，擴增結(jié)果條帶的數(shù)量和亮度均有增加，即引物添加量影響擴增帶型的多態(tài)性，當引物添加量大于1 μL時，無特異性條帶增加，故確定最適的引物添加量是1 μL。

圖2 不同引物添加量對菌株999的RAPD擴增圖譜Fig.2 Influence of primer additive volume on RAPD profiles of strains 999

2.3.2 最適模板DNA添加量

由圖3所示，不同模板DNA添加量對反應(yīng)影響顯著，在0.5～1 μL范圍內(nèi)，隨著添加量的增加，帶型豐度增加，模板DNA在添加量為1 μL時擴增的譜帶最為清晰，多態(tài)性較好；當引物添加量高于1 μL時，擴增的出的500 bp以下的3條帶亮度減弱，并出現(xiàn)背景彌散。這是因為本試驗提取的DNA沒有經(jīng)過純化，添加量過多時會抑制RAPD-PCR的進行，故確定最適的模板DNA添加量是1 μL。

圖3 不同DNA添加量對菌株999的RAPD擴增圖譜Fig.3 Influence of DNA additive volume on RAPD profiles of strains 999

綜上所述，經(jīng)過單因素試驗確定最適反應(yīng)體系為：2×PCR Taq Mix12.5 μL，模板DNA1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。

2.4 雙引物篩選結(jié)果

將7個單引物隨機兩兩組合獲得21種組合方式，在RAPD反應(yīng)條件下分別使用21對雙引物對10株腸球菌DNA模板進行RAPD擴增，如圖4所示，篩選得到了6對多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的雙引物組合，即Primer 1+Primer 2、Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5、Primer 2+Primer 4、Primer 3+Primer 4、Primer 3+Primer 5。

圖4 不同雙引物對菌株999的RAPD-PCR擴增電泳圖Fig.4 RAPD-PCR amplification of strain 999 by different double primers

在相同條件下，分別使用6對雙引物對已知32株腸球菌進行RAPD-PCR擴增，結(jié)果顯示使用Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5和Primer 2+Primer 4組合均可獲得豐富的多態(tài)性帶型，可擴增出2～5個條帶；而Primer 1+Primer 2、Primer 3+Primer 5進行RAPD-PCR時均有部分樣品沒有擴增出條帶，Primer 3+Primer 4進行RAPD-PCR時屎腸球菌（1096）與耐久腸球菌（130、15、426、1029、127、178、1451）無法分開，相似度100%。

目前應(yīng)用RAPD技術(shù)對乳酸菌屬間分型研究中，是在75%～88%的相似度下做到屬間分型[7,22]，目前未見RAPD技術(shù)對腸球菌種間的相似度分型標準，三種組合均能明顯找出各種間的差異，分別在86%、80%、86%的相似度下將腸球菌在種間區(qū)分。其中，從區(qū)分度來看，Primer 1+Primer 5組合分辨力最高，可作為腸球菌種間分型的最佳雙引物對。

Primer 1+Primer 3組合RAPD-PCR擴增時發(fā)現(xiàn)在500 bp位置出現(xiàn)海氏腸球菌的特征條帶，可以作為海氏腸球菌的鑒定指標，由圖5所示。研究發(fā)現(xiàn)，海氏腸球菌是一種低感染性的腸球菌[28]，已被國家微生物資源平臺收錄并定義為一種潛在的益生菌。有研究者從山羊奶中分離出一株具有抑菌性、耐高溫、耐酸堿，對常見抗生素敏感，無毒力基因的海氏腸球菌，經(jīng)選擇培養(yǎng)基初篩后，進行細菌的分離純化，并采用形態(tài)學、生化試驗及16S rDNA基因擴增測序?qū)Ψ蛛x菌株進行鑒定，最后鑒定結(jié)果為海氏腸球菌[29]，鑒定方法較為繁瑣，本試驗發(fā)現(xiàn)在Primer 1+Primer 3組合進行RAPD-PCR擴增時發(fā)現(xiàn)500 bp位置的條帶是海氏腸球菌的特征條帶，可以作為海氏腸球菌的鑒定指標。

圖5 Primer 1+Primer 3引物擴增32株腸球菌指紋圖譜Fig.5 Finger print of 32 Enterococcus was amplified with Primer 1+Primer 3

2.5 重復性實驗

使用Primer 1+Primer 5對10個基因組DNA進行擴增，結(jié)果如圖6、7，顯示在批次內(nèi)及批次間，獲得的樣品多態(tài)性圖譜結(jié)果一致，說明在優(yōu)化后的體系條件下，具有較高的重復性及穩(wěn)定性。

圖6 RAPD擴增批次內(nèi)重復性試驗Fig.6 RAPD patterns of repeat test in a batch

圖7 RAPD擴增批次間重復性試驗Fig.7 RAPD patterns of repeat test among a batch

2.6 RAPD在腸球菌分型中的應(yīng)用和驗證

用Primer 1+Primer 5組合對24株已知腸球菌和46株未知分離株基因組DNA進行RAPD擴增。由圖8可知，46株未知腸球菌和24株已知腸球菌在80%的相似度下，可以分為13個亞型。除401、461、472單獨聚在亞型11，其他43株未知菌株均與已知菌株聚類，分別是33株屎腸球菌、8株耐久腸球菌、2株海氏腸球菌；將所有菌株進行管家基因rpoA基因序列分析，43株未知菌株的rpoA結(jié)果和RAPD結(jié)果一致，401、461、472均為耐久腸球菌，說明RAPD應(yīng)用于腸球菌鑒定結(jié)果具有可靠性。

圖8 Primer1+Primer5引物擴增70株腸球菌的聚類樹狀圖Fig.8 Clustering tree of 70 Enterococcus was amplified with Primer1+Primer5

3 結(jié)論

本研究以分離自傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品中的腸球菌為研究對象，從優(yōu)化RAPD體系入手，并應(yīng)用RAPD技術(shù)來對腸球菌分型。首先，高質(zhì)量的DNA是進行PCR、基因克隆、測序和指紋圖譜等分子生物學方法的基礎(chǔ)，采用試劑盒法和微波法提取腸球菌DNA，篩選出微波法為后續(xù)實驗的提取方法；其次，研究表明，退火溫度、PCR Taq Mix酶的添加量、引物添加量、模板添加量均會影響擴增效果。本試驗通過對RAPD反應(yīng)條件中引物添加量、DNA模板添加量的優(yōu)化，確定RAPD最適反應(yīng)體系為：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；最后，RAPD-PCR存在的主要問題是很難在實驗室內(nèi)和實驗室之間得到重復性試驗結(jié)果。本試驗結(jié)果表明，在保證模板樣品、在同一臺PCR儀的前提下，無論是批次內(nèi)驗證實驗還是批次間驗證實驗，獲得的樣品多態(tài)性圖譜結(jié)果一致，故說明在最適的反應(yīng)體系條件下，實驗具有很高的重復性及穩(wěn)定性。

本試驗通過引物的預篩選，得到3對多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物組合，即Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5和Primer 2+Primer 4組合。三種組合都可獲得穩(wěn)定性高的多態(tài)性帶型，分別在86%、80%、86%的相似度下將腸球菌在種水平上分型。Primer 1+Primer 5組合的分辨率最高，因此推薦應(yīng)用在腸球菌種間的分型中。此外，在Primer 1+Primer 3組合進行RAPD-PCR擴增時發(fā)現(xiàn)500 bp位置的條帶是海氏腸球菌的特征條帶，可以作為海氏腸球菌的鑒定指標。

通過RAPD和rpoA基因序列分析對腸球菌分離株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)RAPD結(jié)果和rpoA鑒定結(jié)果一致，說明腸球菌RAPD分型結(jié)果具有可靠性。綜合比較結(jié)果考慮，RAPD技術(shù)在腸球菌分類鑒定中有一定的應(yīng)用價值，同時它有操作簡單快速、屬間和種間區(qū)分效率高、費用低的優(yōu)勢，與其他表型和基因型方法相結(jié)合，可提高菌種鑒定效率和準確性。