王世杰，崔詩琦，姜曉冬，王紅英，錢斯日古楞

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

葡萄糖異構(gòu)酶，又稱木糖異構(gòu)酶，是一種可以將醛糖異構(gòu)化為相應(yīng)酮糖的異構(gòu)酶，在工業(yè)生產(chǎn)中具有很高的應(yīng)用價值。葡萄糖異構(gòu)酶在自然界中的來源十分廣泛，微生物乃至植物和動物細(xì)胞中都有葡萄糖異構(gòu)酶的存在[1]。葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)高果糖漿的關(guān)鍵酶，金屬離子對葡萄糖異構(gòu)酶酶活影響較大[2]。游離葡萄糖異構(gòu)酶的價格較昂貴、易失活、穩(wěn)定性不佳、難以回收利用等缺點限制了其應(yīng)用與發(fā)展[3,4]。

酶的固定化不僅能保持酶的活性，還可以提高酶的穩(wěn)定性，便于酶的分離回收。因此，固定化酶被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的固定化酶交聯(lián)法、吸附法、包埋法、共價結(jié)合法[5-8]，雖然可以提高酶的穩(wěn)定性，但交聯(lián)法與共價結(jié)合法由于反應(yīng)條件激烈，會使酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而降低酶活[9,10]；包埋法由于包埋載體的存在，會使底物與酶之間的相互作用受到阻礙，降低催化效率[11]；吸附法中物理相互作用不強，溫度、pH和攪拌等條件很可能造成酶的脫落等[12]。納米花固定化技術(shù)是一種新型的固定化技術(shù)，它通過酶蛋白、金屬離子與磷酸根離子之間的自組裝，形成類似花狀的結(jié)晶復(fù)合體[13]，在形成過程中，無機磷酸鹽會充當(dāng)載體，將酶固定在納米級的層狀花瓣中,最終這些花瓣聚集成微米級的花狀結(jié)構(gòu)[14]，因此被稱為納米花。納米花固定化技術(shù)一定程度上是一種包埋技術(shù)，金屬離子和陰離子結(jié)合形成沉淀的過程中，酶蛋白附著在上面，但其合成環(huán)境溫和，合成方法簡單，綠色。納米花的花狀結(jié)構(gòu)增加了比表面積的同時對酶起到保護作用，不僅可以提高酶的活性，在酶的穩(wěn)定性提升方面同樣表現(xiàn)良好，因此備受關(guān)注[15]。

本文致力于葡萄糖異構(gòu)酶的固定化研究，采用共沉淀法，制備出納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶，并對制備條件進行優(yōu)化，結(jié)合掃描電鏡、透射電鏡、傅里葉變換紅外光譜、X-射線衍射等技術(shù)及方法對固定化酶的結(jié)構(gòu)進行了表征，并分析其酶學(xué)性質(zhì)；結(jié)果證實，該方法能夠制備出納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶，且其酶學(xué)性質(zhì)表現(xiàn)良好。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

熱場發(fā)射掃描電鏡，日本電子株式會社；X-Max50能譜儀，英國牛津儀器公司；透射式電子顯微鏡，日本電子株式會社；紅外光譜儀，美國珀金埃爾默儀器有限公司；X-射線衍射儀，日本島津；V-1300紫外可見分光光度計，上海美析儀器有限公司。

1.2 實驗材料

葡萄糖異構(gòu)酶（10 U/mg），諾維信生物技術(shù)有限公司；咔唑乙醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽，上海源葉生物科技有限公司；硫酸銅，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；D-果糖（分析純），上海源葉生物科技有限公司；硫酸鎂（分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.3 納米花固定化酶GI@NFs的制備

量取一定量的葡萄糖異構(gòu)酶液，溶解于PBS緩沖液中，并與一定濃度的CuSO4溶液混合，在25 ℃條件下靜置反應(yīng)24 h；在8000 r/min條件下離心5 min后收集沉淀；沉淀用去離子水沖洗3次，冷凍干燥獲得粉末狀納米花固定化酶GI@NFs。

1.4 酶活的測定

果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，以D-果糖為標(biāo)準(zhǔn)物，半胱氨酸鹽酸鹽、濃硫酸、咔唑酒精混合溶液為顯色劑，在560 nm處測定吸光值，得到的回歸方程為Y=0.5575x+0.0208，R2=0.9993。

葡萄糖異構(gòu)酶活力的測定采用硫酸咔唑法。0.75 mL酶液或1 mg固定化酶中加入0.75 mL磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）和0.25 mL硫酸鎂溶液（12 g/L），混勻后加入0.75 mL 70%的葡萄糖溶液；在70 ℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)1 h。取1 mL反應(yīng)液，加入0.2 mL半胱氨酸鹽溶液（24 g/L）和6 mL濃硫酸，混勻后加入0.2 mL咔唑酒精（1.2 g/L）；混勻后在60 ℃下條件下水浴保溫10 min以上；冷卻后在560 nm處測定吸光值。

式中：

A——酶活力，在70 ℃、pH值7.4條件下，每分鐘生成1 μmoL D-果糖所需的酶量定義為1酶活（U）。

E——從標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)560 nm吸光值上讀出的果糖質(zhì)量，mg。

1.5 制備條件的優(yōu)化

1.5.1 PBS濃度

PBS濃度設(shè)置為2、4、6、8、10、12 mmol/L，分別取30 μL酶液溶于9 mL pH值7.4 PBS后，充分搖勻，然后加入30 μL CuSO4搖勻后在25 ℃條件下靜置24 h，于8000 r/min下離心5 min收集沉淀，用去離子水清洗3次以后，測定酶活，確定最適PBS濃度。

1.5.2 CuSO4添加量

CuSO4添加量設(shè)置為15、30、45、60、75、90 μL,分別取30 μL酶液溶于9 mL pH值7.4 PBS后，充分搖勻，然后加入CuSO4搖勻后在25 ℃條件下靜置24 h，于8000 r/min下離心5 min收集沉淀，用去離子水清洗 3次以后，測定酶活，確定最適CuSO4添加量。

1.5.3 酶添加量

酶的添加量設(shè)置為20、30、40、50、60、70 μL，分別溶于9 mL pH值7.4 PBS后，充分搖勻，然后加入30 μL CuSO4搖勻后在25 ℃條件下靜置24 h，于8000 r/min下離心5 min收集沉淀，用去離子水清洗3次以后，測定酶活，確定最適酶添加量。

1.5.4 制備溫度

制備溫度設(shè)置為5、15、25、35、45、55 ℃，分別取40 μL酶液溶于9 mL pH值7.4 PBS后，充分搖勻，然后加入30 μL CuSO4搖勻后在不同溫度條件下靜置24 h，于8000 r/min下離心5 min收集沉淀，用去離子水清洗3次以后，測定酶活，確定最適制備溫度。

1.5.5 制備pH值

制備pH設(shè)置為5.4、6.4、7.4、8.4、9.4、10.4，分別取40 μL酶液溶于9 mL不同pH的PBS后，充分搖勻，然后加入30 μL CuSO4搖勻后在35 ℃條件下靜置24 h，于8000 r/min下離心5 min收集沉淀，用去離子水清洗3次以后，測定酶活，確定最適制備pH值。

1.5.6 制備時間

制備時間設(shè)置為6、12、18、24、30、36 h，分別取40 μL酶液溶于9 mL pH值7.4 PBS后，充分搖勻，然后加入30 μL CuSO4搖勻后在35 ℃條件下靜置不同時間，于8000 r/min下離心5 min收集沉淀，用去離子水清洗3次以后，測定酶活，確定最適制備時間。

1.6 GI@NFs的酶學(xué)性質(zhì)

以下GI@NFs均為1.5最適條件下制備，酶活測定參照1.4方法，在測得最優(yōu)條件（溫度、pH）后，在最優(yōu)條件下測定酶活。

1.6.1 反應(yīng)溫度對酶活的影響

分別在30、40、50、60、70、80 ℃條件下，測定游離酶和GI@NFs的酶活。

1.6.2 反應(yīng)pH條件對酶活的影響

在最適反應(yīng)溫度下，分別調(diào)節(jié)緩沖液pH值為4、5、6、7、8、9、10，測定游離酶和GI@NFs的酶活。

1.6.3 熱穩(wěn)定性

將游離酶和GI@NFs在40、50、60、70、80、90 ℃條件下放置2 h，測定游離酶和GI@NFs的酶活。

1.6.4 pH穩(wěn)定性

將游離酶和GI@NFs分別在pH值為4、5、6、7、8、9的緩沖液中保存24 h后，測定游離酶和GI@NFs的酶活。

1.6.5 重復(fù)利用率

在最適溫度和pH值下對GI@NFs酶活進行測定，并于8000 r/min下離心5 min收集沉淀，用去離子水清洗3次，重復(fù)測其酶活，比較其酶活力變化。

1.6.6 儲存穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶在pH值7.4，0.2 mol/L磷酸緩沖液條件4 ℃保存，每隔1周測定一次酶活，觀察儲存時間的延長對酶活影響。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本文實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，平均值由3組平行實驗所得，采用SPSS和Origin 8.6對結(jié)果進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GI@NFs制備條件的優(yōu)化

2.1.1 PBS濃度

PBS濃度是影響納米花的形成以及酶活表現(xiàn)的重要因素。從圖1中看出，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活力隨制備PBS濃度的增加而提高，PBS濃度6 mmol/L時其活力達(dá)到最高值，隨后活力逐漸降低，這可能是隨著磷酸根離子濃度的增加,有利于納米花的形成，而濃度太高時，反而不會形成納米花，而是形成納米薄片[16]，因此確定6 mmol/L為制備GI@NFs的最適PBS濃度。

圖1 PBS濃度對GI@NFs酶活的影響Fig.1 Effect of PBS concentration on GI@NFs enzyme activity

2.1.2 CuSO4添加量

納米花成核和生長始于Cu2+結(jié)合位點,進而形成了獨立的花瓣,這是納米花形成的關(guān)鍵步驟。所以金屬離子濃度是影響納米花花瓣形成和酶活的重要條件。實驗結(jié)果如圖2所示，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活力隨著CuSO4（16 g/L）添加量的增加而提高，在30 μL的添加量時活力達(dá)到最大值，隨后持續(xù)下降，Cu2+濃度的增加可以促進GI@NFs的形成，但隨著濃度的增加，可能會阻止酶與底物的接觸，甚至?xí)种泼富?，因此確定30 μL為制備GI@NFs的CuSO4最適添加量。

圖2 CuSO4添加量對GI@NFs酶活的影響Fig.2 Effect of CuSO4 additive concentration on GI@NFs enzyme activity

2.1.3 酶添加量

酶蛋白的濃度是影響納米花制備的主要因素之一。從圖3中看出，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活力隨酶蛋白增加而提高，添加量40 μL時，酶活力達(dá)到最高值，隨后固定化酶活力下降，隨著酶添加量的提高，更多的酶分子被固定在納米花上，繼續(xù)增加酶添加量，多余的酶分子無法被固定，其活力反而會降低，因此確定40 μL為制備GI@NFs的最適酶添加量。

圖3 GI添加量對GI@NFs酶活的影響Fig.3 Effect of GI additive concentration on GI@NFs enzyme activity

2.1.4 制備溫度

溫度對納米花固定化酶制備的影響，結(jié)果如圖4。由圖可見，隨著制備反應(yīng)溫度提高，固定化酶的活力增加，35 ℃時其酶活力達(dá)到最高值，隨后逐漸下降，隨著溫度的提高，納米花的形成速度會加快，但是溫度過高會形成更多的沉淀，但納米花的量會變少，同時，高溫可能導(dǎo)致酶的變性失活，從而降低酶活因此，確定35 ℃為制備GI@NFs的最適制備溫度。

圖4 溫度對GI@NFs酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on GI@NFs enzyme activity

2.1.5 制備pH值

pH條件對制備納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶活力表現(xiàn)的影響，如圖5所示。由圖可見，反應(yīng)體系的pH值小于7.4時，固定化酶活力隨著pH值的增加而提高，pH值7.4時，酶活力達(dá)到最高值，隨后其活力持續(xù)下降；原因可能是在酸性和堿性條件下游離酶的酶活都會降低，酶失活，所以形成的納米花的酶活同樣會降低，因此，確定pH值7.4為制備GI@NFs的最適反應(yīng)pH值。

圖5 pH值對GI@NFs酶活的影響Fig.5 Effect of pH value on GI@NFs enzyme activity

2.1.6 制備時間

制備反應(yīng)時間不僅影響形成納米花的花形和松散度，還會影響其酶活力。反應(yīng)時間的影響從圖6中可看出，隨著反應(yīng)時間的延長，固定化酶的活力提高，18 h時達(dá)到最高值，隨后活力下降；隨著制備時間的增加，形成了更多的納米花，但是時間繼續(xù)增加，形成較大的納米花聚集物，從而降低酶活，因此，確定18 h為制備GI@NFs的最適反應(yīng)時間。

圖6 時間對GI@NFs酶活的影響Fig.6 Effect of time on GI@NFs enzyme activity

2.2 納米花固定化酶的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2.1 微觀形貌表征

采用掃描電鏡（Scanning Electron Microscope ，SEM）和透射電鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）對制備納米花固定化酶GI@NFs的微觀形貌進行表征，結(jié)果如圖7所示。由圖可見，GI@NFs呈花狀，花瓣呈片狀，且張開；酶蛋白在花瓣上均勻分布，呈點狀。以上結(jié)構(gòu)特征增加了酶與底物的接觸面積，并且對酶起到支撐和保護作用，有利于酶活表現(xiàn)。

圖7 GI@NFs的SEM圖（a、b）和TEM圖（c、d）Fig.7 SEM (a, b) and TEM (c, d) images of GI@NFs

2.2.2 能譜分析

利用X-射線能譜分析（Energy Dispersive Spectroscopy，EDS）對納米花固定化酶的元素組成進行分析，結(jié)果如圖8。由圖可見，GI@NFs能級色譜圖中的P、O、Cu元素來自于Cu3(PO4)2，而N、O元素來自與酶蛋白，這說明了GI@NFs是由制備離子與酶蛋白通過自組裝形成。

圖8 GI@NFs的能級色譜圖Fig.8 Energy level chromatogram of GI@NFs

2.2.3 傅里葉紅外光譜分析

GI@NFs、Cu3(PO4)2和GI在傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier Transform Infrared Spectrometer，F(xiàn)T-IR）的吸收特征峰如圖9所示。由圖可知，在630 cm-1、991 cm-1和1060 cm-1處為表現(xiàn)P-O的伸縮振動峰，說明GI@NFs中有PO43-基團；在1400 cm-1處表現(xiàn)C=O的伸縮振動峰，該峰在GI和GI@NFs中均有出現(xiàn)，由GI引起，因此可以進一步確定說明GI@NFs是由Cu2+、PO43-和GI構(gòu)成[17,18]。

圖9 Cu3(PO4)2、GI和GI@NFs的FT-IR表征Fig.9 FT-IR characterization of Cu3(PO4)2, GI and GI@NFs

2.2.4 GI@NFs的X-射線衍射分析

GI@NFs的X-射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）結(jié)果如圖10所示。對比Cu3(PO4)2·3H2O的標(biāo)準(zhǔn)卡片（JPSCD 00-022-0548），GI@NFs的衍射峰與其基本一致，表明制備的GI@NFs具有良好的結(jié)晶度。

圖10 GI@NFs的XRD表征Fig.10XRD characterization of Cu3(PO4)2 and GI@NFs

2.3 納米化固定化酶GI@NFs的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 反應(yīng)溫度對酶活的影響

反應(yīng)溫度的變化對GI@NFs酶活的影響如圖11所示。由圖可見，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活力隨反應(yīng)溫度的提高而增加，在60 ℃時其活力達(dá)到最高值；隨后酶活緩慢下降，但在80 ℃時仍保持其最高活力的70%以上。最后確定60 ℃為GI@NFs的最適反應(yīng)溫度，這比其游離酶的提高10 ℃，納米花結(jié)構(gòu)將酶分子限制在花瓣內(nèi)，阻擋了高溫對酶結(jié)構(gòu)變化的影響，避免了酶的變形失活[19]，更高的反應(yīng)溫度有利于工業(yè)應(yīng)用。

圖11 GI和GI@NFS的最適反應(yīng)溫度Fig.11 Optimum reaction temperatures of GI and GI@NFS

2.3.2 反應(yīng)pH條件對酶活的影響

反應(yīng)pH條件對GI@NFs酶活的影響如圖12所示。在酸性和弱堿性條件下，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活力隨pH值的增加而提高，在pH值為8時活力達(dá)到最高值；隨后其活力緩慢下降，在pH值為10時仍保持其最高活力的85%以上。最后確定pH值為8為GI@NFs的最適pH值條件；其游離酶的最適pH值為7，這可能是由于葡萄糖異構(gòu)酶和無機鹽載體之間的相互作用，使酶分子的剛性增強，同時納米花結(jié)構(gòu)降低了葡萄糖異構(gòu)酶對pH值的敏感性，從而擁有更廣的pH值反應(yīng)范圍。

圖12 GI和GI@NFs的最適反應(yīng)pHFIg. 12 Optimal pH of GI and GI@NFs

2.3.3 熱穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶在不同溫度下放置2 h后測定其酶活，結(jié)果如圖13。由圖可見，隨著保存溫度的增加，固定化葡萄糖異構(gòu)酶和及其游離酶的殘余活力均有下降，但固定化酶的活力下降比游離酶的緩慢，且保持相對較高活力，這表明納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶表現(xiàn)良好的熱穩(wěn)定性，納米花結(jié)構(gòu)對酶分子起到了很好的保護作用，使其受到外界環(huán)境變化的影響變小。

圖13 GI和GI@NFs的熱穩(wěn)定性Fig.13 Thermal stability of GI and GI@NFs

2.3.4 pH穩(wěn)定性

將固定化葡萄糖異構(gòu)酶和游離酶在不同pH條件下保存24 h后測定其酶活，結(jié)果如圖14。由圖可見，固定化酶及游離酶在pH值7時其殘余活力均表現(xiàn)最高，而在酸性和堿性條件下，它們活力均不同程度的下降；但固定化酶的殘余活力保持均比其游離酶的明顯高，在pH值4和9時固定化酶仍保持87.06%和73.51%的活力，而游離酶僅存34.21%和43.52%，說明GI@NFs有較強的pH穩(wěn)定性，原因可能是納米花結(jié)構(gòu)保護了酶的活性中心，降低對pH的敏感性，從而增強了酶的pH穩(wěn)定性。

圖14 GI和GI@NFs的酸堿穩(wěn)定性Fig.14 Acid base stability of GI and GI@NFs

2.3.5 重復(fù)利用率

納米化固定化葡萄糖異構(gòu)酶的重復(fù)利用率研究中共進行了8次連續(xù)的測酶活試驗，結(jié)果如圖15。由圖可見，在連續(xù)8次測定酶活時，固定化酶的活力持續(xù)下降，但下降緩慢，在第8次測定時其活力仍保持最初活力的60.32%，說明納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶表現(xiàn)良好的操作穩(wěn)定性，其活性降低原因可能是由于反應(yīng)完成后，酶分子與無機載體的結(jié)合力變?nèi)?，再?jīng)過離心洗滌，部分酶分子從納米花中洗脫，同時，由于反應(yīng)溫度為60 ℃，在反應(yīng)過程中，部分酶蛋白變性失活，導(dǎo)致酶活降低。

圖15 GI@NFs的重復(fù)利用率Fig.15 Reuse rate of GI@NFs

2.3.6 儲存穩(wěn)定性

納米化固定化酶GI@NFs在4 ℃保存5周過程中的酶活表現(xiàn)如圖16。由圖可見，在存儲過程中固定化酶和其游離酶的活力均下降，但固定化酶的活力下降要比游離酶的緩慢，在第5周測定時，固定化酶的酶活保持62.16%，而游離酶只有32.19%，這表明，納米花結(jié)構(gòu)減少了酶的自溶和變性，納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶表現(xiàn)良好的儲存穩(wěn)定性。

圖16 GI和GI@NFs的儲存穩(wěn)定性Fig.16 Storage stability of GI and GI@NFs

3 結(jié)論

本文成功制備了葡萄糖異構(gòu)酶納米花，研究了PBS濃濃度、酶添加量、金屬離子添加量及反應(yīng)溫度、環(huán)境pH值條件和反應(yīng)時間對葡萄糖異構(gòu)酶納米花制備的影響，結(jié)果顯示，40 μL酶液溶解于9 mL pH值為7.4的PBS緩沖液，再與30 μL CuSO4混合，35 ℃、靜置反應(yīng)18 h制備的納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶具有完整的花型，且其花瓣結(jié)構(gòu)均勻、分散。

納米花固定化酶GI@NFs的酶學(xué)性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，GI@NFs的最適反應(yīng)溫度相較于游離酶提高了10 ℃；最適反應(yīng)pH比其游離酶的有所提高，且在弱酸弱堿環(huán)境下均具有較高酶活；在最適反應(yīng)條件下，GI@NFs的負(fù)載量40.36 mg/g，游離酶的酶活為10 U/mg，而GI@NFs的酶活為18.31 U/mg，GI@NFs的活力比其游離酶的活力提高了83.06%。GI@NFs表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性，在不同溫度下都表現(xiàn)出相對更高的酶活力；在不同pH值下保存24 h固定化酶的活力保持均比其游離酶的明顯高，在pH值為4和9時固定化酶仍保持87.06%和73.51%的活力，而游離酶的僅為34.21%和43.52%；固定化葡萄糖異構(gòu)酶在4 ℃下保存5周時，其活力仍保持最初活力的62.16%，表現(xiàn)較好的儲存穩(wěn)定性；重復(fù)利用8次時，活力仍能保持其最初活性的60.32%。

綜上所述，納米花固定化方法是一種簡便快捷的固定化方法，相比于傳統(tǒng)的固定化方法，使用該方法固定化葡萄糖異構(gòu)酶制備方法簡便，反應(yīng)條件溫和，不僅可以有效提高葡萄糖異構(gòu)酶的酶活，且GI@NFs具有更高的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，因此該方法制備的納米花固定化葡萄糖異構(gòu)酶在工業(yè)相關(guān)生產(chǎn)中有一定的應(yīng)用前景。