石玉夢，楊佳璐，劉靜，劉秀雪，霍棟娜，楊紅霞，逄宇晴，陳曉鵬

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617)

黃酮類物質(zhì)廣泛地存在于食源性植物中，是存在于自然界中的重要天然有機(jī)化合物。富含黃酮類成分的膳食可調(diào)節(jié)多種生理過程，如細(xì)胞氧化還原電位、酶活性、細(xì)胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其對預(yù)防慢性疾病、改善糖尿病和心腦血管疾病等有著一定積極作用。但由于黃酮類成分普遍口服生物利用度低[1]，給其影響健康機(jī)制的研究帶來了很大挑戰(zhàn)。例如在水果和蔬菜中廣泛分布的槲皮素與糖苷蘆丁（槲皮素-3-O-蘆?。Ｔ絹碓蕉嗟淖C據(jù)表明，槲皮素和蘆丁具有良好的抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等作用[2]，但槲皮素和蘆丁的水溶解度低，化學(xué)和代謝穩(wěn)定性差，膜通透性受限使得它們在血漿中原型成分的含量極低[3]。由于黃酮類成分較好的生物活性，研究其在血清及組織中的存在形式及其代謝產(chǎn)物的情況一直是研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)[4]，而腸道菌群正是黃酮類成分代謝的“主要器官”。腸道菌群是人和動物腸道內(nèi)普遍存在且構(gòu)成極為復(fù)雜的微生物群體，腸道代謝過程對人類健康有舉足輕重的作用[5-7]。為了進(jìn)一步探索成分與腸道之間的代謝關(guān)系，近年來建立了體外腸道菌孵育模型，其更方便對食品或藥物的代謝條件進(jìn)行控制，操作簡便、花費(fèi)時間較短且可以進(jìn)行大量操作，排除了體內(nèi)代謝研究法中濃度低、其它物質(zhì)干擾較大、代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定的缺點(diǎn)[8]。

兩色金雞菊，又名昆侖雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.），為菊科金雞菊屬植物，始載于《新華本草綱要》，可作為藥食兩用類原料用于食品和藥物的開發(fā)與應(yīng)用[9]。兩色金雞菊在傳統(tǒng)用途中主要作為茶飲起到清熱毒，祛濕和降糖的作用[10]。在現(xiàn)代研究中其被證明具有多種促進(jìn)人體健康的生物學(xué)活性，包括抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病和保護(hù)肝臟等，被認(rèn)為是功能性食品[11,12]。兩色金雞菊中的主要活性成分為黃酮類化合物含量高達(dá)28.4%[13]，其中馬里苷（Marein，奧卡寧-4'-O-葡萄糖苷）為查爾酮主要的葡萄糖苷[14]。阿布拉等[16]研究表明馬里苷可通過調(diào)控自噬保護(hù)db/db小鼠的心肌損傷等。Ma等[17]研究發(fā)現(xiàn)馬里苷具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制作用并且與其代謝產(chǎn)物奧卡寧被認(rèn)為是有效的抗氧化劑。本課題組前期通過對大鼠口服馬里苷后的血、尿、糞便進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)口服之后并未檢測到原型成分，同時發(fā)現(xiàn)馬里苷在體外肝微粒體孵育中穩(wěn)定性良好，說明馬里苷的主要代謝場所在胃腸道[18,19]。為了進(jìn)一步研究黃酮類成分體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)以馬里苷為例，從體外模擬胃腸道環(huán)境出發(fā)探索腸道菌群對馬里苷的代謝規(guī)律，為闡明馬里苷代謝過程和活性成分提供依據(jù)，為黃酮類成分的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠，180～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0008。SPF級動物實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。所有動物的實(shí)驗(yàn)研究均遵循《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》，并且經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批號TCM-LAEC2021081。

1.2 試劑與藥物

馬里苷（批號：DST200311-132）、異綠原酸B（批號：DST200231-145）、奧卡寧（批號：DST191210-105）、黃諾馬苷（批號：DST191102-240）、異奧卡寧（批號：DST200509-453）均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；腦心浸液肉湯，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自美國Fisher公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Nexera超高效液相色譜儀系統(tǒng)，日本島津公司；LCMS9030超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；超聲波清洗機(jī)，天津知著科技有限公司；電子天平，瑞士METTLER TOLEDO；3K15型高速離心機(jī)，美國sigma公司；XW-80A型渦旋混合器，上海滬西分析儀器廠；高壓滅菌鍋，施都凱儀器設(shè)備有限公司；Milli-Q超純水制備儀，Millipore公司；渦旋混合儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；5424R低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.4 馬里苷在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中的代謝

稱取腦心浸液肉湯38.5 g，加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，制備厭氧培養(yǎng)液。采集正常大鼠新鮮糞便樣品，立刻與0.9%（m/V）氯化鈉水溶液按比例1:4（g/mL）混合，渦旋，制成混懸液，在2 h內(nèi)使用，以確保腸道菌群活性。糞便懸液靜置分層10 min，所得上清液即為腸道菌液。取上清液（10 mL），按1:9（V/V）的比例，加入到90 mL厭氧培養(yǎng)液中，混勻得到腸菌孵育液。

實(shí)驗(yàn)分為給藥組、空白組和對照組。取1 mL馬里苷（1.3 mg/mL）加入5 mL腸菌孵育液中為給藥組，5 mL腸菌孵育液（不含馬里苷）為空白組，將馬里苷加入5 mL厭氧培養(yǎng)液中為對照組。每組平行3份，將其放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋后密封，于37 ℃恒溫振蕩器（150 r/min）中厭氧培養(yǎng)0、6、12、24、36 h。于各時間點(diǎn)取出樣品1 mL，加入甲醇8 mL，渦旋振蕩5 min，混勻，14000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

定性色譜質(zhì)譜條件如下：色譜柱：Shim-pack GISS C18柱（100×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈，梯度洗脫，洗脫梯度為：0～1 min，5%～10% B；1～2 min，10% B；2～3 min，10%～15% B；3～5 min，15%～20% B；5～11 min，20%～40% B；11～13 min，40%～80% B；13～15 min，80%～95% B；15～17 min，95% B；17～20 min，5% B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。采用負(fù)離子模式監(jiān)測的大氣壓電噴霧離子源（ESI-）進(jìn)行質(zhì)譜檢測，ESI源溫度設(shè)置為300 ℃，負(fù)（ESI-）電噴霧的接口電壓為3.0 kV，霧化氣流為3 L/min，加熱氣流為10 L/min，干燥氣體流量為10 L/min。樣品測定前，采用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，MS Scan掃描為50～1000m/z，MS/MS為50～1000m/z。二級質(zhì)譜碰撞能量（CE）：（35±17）V。

1.5 對馬里苷主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行含量測定

精密稱取黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷、異綠原酸B、奧卡寧對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為50、30、50、30、50 μg/mL的混合對照品溶液，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別配制空白孵育液、對照品溶液、含藥孵育6 h的孵育液，同1.4樣品處理方法，通過其色譜圖，觀察待測組分出峰位置，及空白孵育液中的內(nèi)源性成分是否存在干擾。分別精密量取一定量的黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷、異綠原酸B、奧卡寧對照品溶液，進(jìn)行倍比稀釋得到混合對照品系列溶液。取空白孵育液加入混合對照品系列溶液適量，按1.4樣品處理方法操作后，依次進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程及相關(guān)系數(shù)。取混合對照品溶液，按1.4樣品處理操作得到供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，選擇3 d分別連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算各個峰的保留時間、峰面積及RSD，考察其重復(fù)性。稱取已測定樣品9份，分為3組，每組3份，每組按1:0.8、1:1及1:1.2的比例分別加入對照品黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷、異綠原酸B、奧卡寧，進(jìn)樣并記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。取混合對照品溶液，按1.4樣品處理方法操作得到供試品溶液。在 0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣并計(jì)算各個峰的保留時間、峰面積及RSD，考察其穩(wěn)定性。

定量色譜條件如下：色譜柱：Shim-pack GISS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈，梯度洗脫，洗脫梯度為：0～1 min，5%～10% B；1～2 min，10% B；2～3 min，10%～15% B；3～5 min，15%～20% B；5～11 min，20%～40% B；11～13 min，40%～80% B；13～15 min，80%～95% B；15～17 min，95% B；17～20 min，5% B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；紫外波長：305 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

1.6 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)使用Labsolutions工作站處理；化合物結(jié)構(gòu)碎片與成分預(yù)測使用Formula Predictor Server分析軟件；代謝產(chǎn)物的含量測定數(shù)據(jù)處理使用Excel 2019。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬里苷在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物的分析

將馬里苷在正常大鼠腸道菌培養(yǎng)液分別在0、6、12、24、36 h下的樣品在UHPLC-Q-TOF-MS/MS中進(jìn)樣分析，根據(jù)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量、二級碎片、保留時間及與標(biāo)準(zhǔn)品對照確定其成分。通過與空白組比較，在腸道菌群培養(yǎng)液中共檢測到11種代謝產(chǎn)物如表1，代謝產(chǎn)物提取色譜圖如圖1。在反應(yīng)開始時可以檢測到馬里苷原型以及M2～M6，在6 h、12 h、24 h的樣品中檢測到了M7～M12，在孵育36 h的樣品中檢測到了M7、M9、M11、M12。

圖1 馬里苷代謝產(chǎn)物提取色譜圖Fig.1 Chromatogram of marein metabolites extraction

表1 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定馬里苷在給藥組及對照組轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物Table 1 Identification of metabolites transformed by marein in the administration group and control group based on UPLC-Q-TOF-MS/MS

M1(tR=7.65 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z449.1104。其二級碎片離子m/z287.0563、269.0458、151.0034、135.0449與馬里苷的裂解規(guī)律完全一致，與標(biāo)品對照鑒定為馬里苷。M2(tR=6.76 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z611.1629。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C27H32O16。根據(jù)二級碎片離子m/z449.1085 [M-H-Glu]-，287.0564 [M-H-2Glu]-，269.0464[M-H-2Glu-H2O]-，135.0447 [M-H-2Glu-H2O-C8H6O-O]-，推測M2為木犀草素7-O-β-D-槐角苷。M3(tR=7.48 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z463.0886。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C21H20O12。根據(jù)二級碎片離子m/z301.0356[M-H-Glu]-，151.0027 [M-H-Glu-H2O-C8H6O3]-。結(jié)合參考文獻(xiàn)[20]，推測M3為槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。M4(tR=7.51 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z447.0938。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C21H20O11。其二級碎片離子有m/z285.0405 [M-H-Glu]-，151.0028[M-H-Glu-C8H6O2]-，135.0451 [M-H-Glu-C8H6O2-O]-。推測M4為橙酮金雞菊苷。M5(tR=5.74 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z449.1100。其二級碎片離子m/z287.0561、269.0454、151.0033、135.0448與馬里苷的裂解規(guī)律完全一致，但其保留時間與馬里苷存在差異，經(jīng)與標(biāo)品對照后鑒定為黃諾馬苷。M6 (tR=8.642 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z515.1204。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C25H24O12。其二級碎片離子主要有m/z353.0883 [M-H-C9H6O3]-，173.0449[M-H-2C9H6O3]-。對比對照品鑒定M6為異綠原酸B。M7(tR=6.98 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z287.0572。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C15H12O6。根據(jù)二級碎片離子m/z151.0039 [M-H-H2O-C8H6O]-，135.0454[M-H-H2O-C8H6O-O]-，并與標(biāo)準(zhǔn)品對照M7為異奧卡寧。M8(tR=7.50 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z303.0528。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C15H12O7。產(chǎn)生的二級碎片離子有m/z285.0391 [M-H-H2O]-，151.0029[M-H-H2O-C8H6O2]-，135.0453 [M-H-H2O-C8H6O2-O]-，結(jié)和文獻(xiàn)參考[21]推測M8為二氫槲皮素。M9(tR=8.51 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z271.0622。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C15H12O5。根據(jù)其二級碎片離子m/z135.0456 [M-H-C8H8O2]-、121.0289[M-H-C8H8O2-CO]-，推測M9為7,3',5'-三羥基黃酮。M10(tR=8.78 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z285.0416。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C15H10O6。二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z267.0293 [M-H-H2O]-，151.0028[M-H-C8H6O2]-，135.0452 [M-H-C8H6O2-O]-。推測該化合物26為6,7,3',4'-四羥基橙酮。

M11(tR=9.37 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z287.0575。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C15H12O6。其二級碎片離子主要有m/z151.0039 [M-H-H2O-C8H6O]-、135.0454 [M-H-H2O-C8H6O-O]-。所以認(rèn)為M11為奧卡寧。M12(tR=10.56 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z301.0365。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C25H10O7。其二級碎片離子主要有m/z178.9992、151.0046、121.0300，符合槲皮素的裂解規(guī)律[22]，故將M12鑒定為槲皮素。

Wu等[23]研究發(fā)現(xiàn)紅花中羥基紅花黃色素A（查爾酮苷類）的主要代謝途徑有脫水、脫氫、羥基化、甲基化、葡萄糖醛酸化等。本實(shí)驗(yàn)中通過代謝產(chǎn)物推測同為查爾酮苷的馬里苷的主要代謝途徑也有脫氫、羥基化、甲基化、葡萄糖醛酸化，此外還有異構(gòu)化、環(huán)裂解和乙酰化。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析還發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)起始時腸菌液中除馬里苷原型成分外還有黃諾馬苷、木犀草素7-O-β-D-槐角苷、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、橙酮金雞菊苷、異綠原酸B五種代謝產(chǎn)物。說明馬里苷在與厭氧培養(yǎng)液和腸道菌孵育液這類含有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)液接觸之后十分不穩(wěn)定，容易發(fā)生異構(gòu)化、糖苷化、葡萄糖醛酸等反應(yīng)。但是不難發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)起始時樣品中存在的都時含有糖基的化合物。孵育6 h后在大鼠腸道菌孵育液中已經(jīng)檢測不到原型成分。在孵育6、12、24 h的樣品中檢測到了異奧卡寧、二氫槲皮素、7,3',5'-三羥基黃酮、6,7,3',4'-四羥基橙酮、奧卡寧、槲皮素。在孵育36 h的樣品中檢測到了異奧卡寧、7,3',5'-三羥基黃酮、奧卡寧、槲皮素。在腸道菌的作用下，馬里苷及其黃酮苷類代謝產(chǎn)物被代謝為各種苷元。

2.2 馬里苷在空白孵育液中代謝產(chǎn)物的分析

在不加腸菌的對照組中共檢測到13種代謝產(chǎn)物，其中包含11種為與2.1中重合的代謝產(chǎn)物，M13、M14為差異代謝產(chǎn)物如表1，代謝產(chǎn)物提取色譜圖如圖1。M13(tR=8.73 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z515.1245。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C25H24O12。其二級碎片離子主要有m/z353.0906 [M-H-C9H6O3]-，173.0467[M-H-2C9H6O3]-，135.046 [M-H-2C9H6O3-H2O-CO]-。推測該M13為洋薊素。M14(tR=8.25 min)在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z515.1237。根據(jù)Formula Predictor Server預(yù)測，該化合物分子式為C25H24O12。其二級碎片離子主要有m/z191.0575[M-H-2C9H6O3]-，179.0365 [M-H-C9H6O3-C10H6O3]-。推測其是與M13為同分異構(gòu)體的異綠原酸A[24]。

2.3 馬里苷主要代謝產(chǎn)物的含量測定結(jié)果

2.3.1 含量測定的方法學(xué)考察

空白孵育液、對照品溶液、含藥孵育6 h的孵育液的色譜圖如圖2所示?？瞻追跤褐械膬?nèi)源性成分對待測成分不存在干擾。該色譜條件下待測物專屬性良好。腸菌培養(yǎng)液中黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷、異綠原酸B、奧卡寧的標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢測限結(jié)果如表2。結(jié)果表明各成分線性關(guān)系良好。日內(nèi)精密度考察中各峰的保留時間RSD≤0.13%，峰面積RSD≤1.63%，日間精密度考察中各峰的保留時間RSD≤1.21%，峰面積RSD≤2.83%，表明該儀器的精密度良好。重復(fù)性考察中各峰的保留時間RSD≤0.08%，峰面積RSD≤1.58%，表明該方法的重復(fù)性良好。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3，結(jié)果表示各組加樣回收率均在98.49%～102.15%之間，RSD≤3.11%，說明該方法加樣回收率合格，所測定的含量測定方法準(zhǔn)確度良好。穩(wěn)定性考察中各峰的保留時間RSD≤1.02%，峰面積RSD≤1.08%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

圖2 專屬性色譜圖Fig.2 Specific chromatogram

表2 馬里苷在大鼠腸道菌培養(yǎng)液主要代謝產(chǎn)物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation and correlation coefficient of main metabolites of marein in rat intestinal bacteria culture medium

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of sample adding recovery rate

2.3.2 馬里苷主要代謝產(chǎn)物的含量測定結(jié)果

由于馬里苷腸道菌代謝產(chǎn)物和降解產(chǎn)物有一定的重合，為進(jìn)一步研究腸道菌的代謝作用，選取了變化明顯、含量可測的4種代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量研究。如表4、表5所示，利用得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算給藥組與對照組中馬里苷、黃諾馬苷、異奧卡寧、異綠原酸B、奧卡寧不同時間段的含量。

表4 馬里苷在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中主要代謝產(chǎn)物含量Table 4 Content of main metabolites of marein in intestinal bacteria culture medium of rats (ng/mL, mean±SD, n=3)

表5 馬里苷在空白培養(yǎng)液中主要代謝產(chǎn)物含量Table 5 Content of main metabolites of marein in blank culture medium (ng/mL, mean±SD, n=3)

黃酮類物質(zhì)在體內(nèi)代謝主要通過腸道與肝臟兩個部位。在胃腸道主要經(jīng)過腸道菌群中的特異性糖苷酶水解、代謝反應(yīng)形成相應(yīng)黃酮苷或黃酮苷元，隨即進(jìn)入血液或肝臟進(jìn)行代謝。腸道菌群是腸道復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落，它與宿主之間有著密不可分的互惠關(guān)系[25]。腸道菌群里含有許許多多不同類型的酶[26]，黃酮苷類物質(zhì)進(jìn)入胃腸道后，其中的大多數(shù)會經(jīng)腸道菌群中的特異性糖苷酶從而代謝轉(zhuǎn)化為苷元，黃酮苷元比黃酮苷更容易吸收[27]。一些強(qiáng)親水性的黃酮苷類物質(zhì)會在胃腸道中發(fā)生水解反應(yīng)或者經(jīng)代謝除去糖基變?yōu)檐赵?，并且苷元相比糖苷更具有親脂性，苷元可以以被動擴(kuò)散的形式穿過腸粘膜細(xì)胞然后再進(jìn)入血液循環(huán)[28]。馬里苷有著結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，容易與其互為同分異構(gòu)體的黃諾馬苷發(fā)生轉(zhuǎn)化。肉蓯蓉中的松果苷[29]以及萊菔子中的蘿卜苷[30]也有類似特性，它們在甲醇溶液中就容易發(fā)甲基化和順式/反式異構(gòu)化的轉(zhuǎn)化。從含量結(jié)果來看，馬里苷在腸菌培養(yǎng)液與厭氧培養(yǎng)液中均快速發(fā)生了異構(gòu)化、葡萄糖醛酸化反應(yīng)。將兩組的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)進(jìn)行到6 h時，馬里苷和黃諾馬苷兩個黃酮苷在含有大鼠腸道菌的培養(yǎng)液中已經(jīng)檢測不到，而在不含大鼠腸道菌的空白培養(yǎng)液中仍能被檢測到。在反應(yīng)進(jìn)行到12 h時，在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中僅能檢測到異奧卡寧和奧卡寧兩個苷元，而在不含大鼠腸道菌的培養(yǎng)液中仍能檢測到馬里苷、黃諾馬苷以及異綠原酸B這三種含有糖基的化合物。比較兩組奧卡寧的含量，發(fā)現(xiàn)在含有腸道菌的培養(yǎng)液中奧卡寧出現(xiàn)的時間點(diǎn)提前，并且奧卡寧的含量在6～36 h為7.99～1.39 ng/mL先高后低，說明腸道菌加快了馬里苷的代謝轉(zhuǎn)化并且可能促進(jìn)了其代謝產(chǎn)物奧卡寧的消化吸收。從異奧卡寧的含量變化上看能發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律，空白培養(yǎng)液中異奧卡寧的含量在12～36 h始終高于其在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中的含量。

Yang等[31]在研究人腸道菌對蘆丁代謝的影響中發(fā)現(xiàn)腸道菌種產(chǎn)生的鼠李糖苷酶可以將蘆丁水解代謝為槲皮素-3-O-葡萄糖苷，此后又進(jìn)一步被其它菌屬代謝為苷元白矢車菊素。在本研究中通過代謝產(chǎn)物在腸菌液中出現(xiàn)的時間順序來看，馬里苷及其異構(gòu)化產(chǎn)物黃諾馬苷首先也是發(fā)生了水解反應(yīng)。同時結(jié)合代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和含量變化趨勢，推測馬里苷的代謝途徑如圖3所示。

3 結(jié)論

本研究從腸道菌群代謝的角度模擬胃腸道體外代謝環(huán)境，在馬里苷大鼠腸道菌群孵育的實(shí)驗(yàn)中共鑒定了11種代謝產(chǎn)物。馬里苷在代謝過程中主要發(fā)生了異構(gòu)化、葡萄糖醛酸化、環(huán)裂解、羥基化、脫氫、乙?；确磻?yīng)。綜合定性結(jié)果以及對原型成分和部分代謝產(chǎn)物的定量結(jié)果來看，馬里苷在腸道菌的作用下，6 h就已檢測不到原型成分，6 h之后黃諾馬苷以及異綠原酸B等糖苷也已經(jīng)檢測不到，而在6 h～24 h異奧卡寧、奧卡寧等由馬里苷代謝產(chǎn)生的苷元含量經(jīng)歷了先增多后減少的過程。馬里苷雖結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定易發(fā)生異構(gòu)化等反應(yīng)，但并不會因此而脫糖水解。但在有腸道菌作用的情況下，馬里苷會迅速脫糖，其代謝產(chǎn)物朝著結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定更易吸收的苷元方向發(fā)展并且代謝速度會加快，說明馬里苷在胃腸道的代謝十分活躍。此次研究成果為兩色金雞菊的物質(zhì)作用基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)，也為諸如綠茶、橘皮、大豆等富含黃酮具有保健作用的食品，提供了更好的研究思路。