李英，劉偉，朱麗英，周治，江凌,4

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 210009）（2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇南京 210009）（3.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210009）（4.南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009）

D-塔格糖的甜度高達(dá)蔗糖的92%，但能量僅含蔗糖三分之一，具有降血糖[1,2]、改善腸道菌群[3]、抗氧化[4]的作用，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。D-塔格糖的合成主要通過化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法[5]合成過程不易控制且副產(chǎn)物難以分離限制了其應(yīng)用。目前，商業(yè)化的D-塔格糖通常是由D-半乳糖經(jīng)過L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（L-AI，EC 5.3.1.4）的異構(gòu)化生產(chǎn)[6]。然而，L-AI的固有熱力學(xué)平衡以及D-半乳糖和D-塔格糖之間的性質(zhì)相似，仍然存在轉(zhuǎn)化率有限和純化成本高的問題[7]。除了通過L-AI轉(zhuǎn)化D-半乳糖途徑外，還可通過半乳糖醇脫氫酶將半乳糖醇一步轉(zhuǎn)化為D-塔格糖。Muniruzzaman等[8]使用Enterobacter agglomerans221e菌株生產(chǎn)D-塔格糖，半乳糖醇轉(zhuǎn)化率高達(dá)92%。除了發(fā)酵法，Zhang等[9]通過在胞外偶聯(lián)半乳糖醇脫氫酶和再生NAD+的NADH氧化酶，以100 mmol/L D-半乳糖醇為底物，12 h后的產(chǎn)率達(dá)90%。雖然利用D-半乳糖醇產(chǎn)D-塔格糖產(chǎn)率高，但是半乳糖醇價(jià)格昂貴，直接利用其做底物不符合經(jīng)濟(jì)效益。為降低底物成本，乳糖或富含乳糖的工業(yè)廢物是研究者常用的廉價(jià)底物。Jia等[10]利用重組大腸桿菌粗酶液可實(shí)現(xiàn)以100 g/L乳糖的乳清粉為原料，制得23.50 g/L D-塔格糖。氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，且沒有復(fù)雜的副產(chǎn)物，是理想的途徑。

有研究表明氧化還原反應(yīng)中，輔因子限制是影響產(chǎn)量的重要因素[11]。半乳糖醇脫氫酶在將半乳糖醇轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的同時(shí)需要消耗輔因子。為避免大量添加外源輔因子且提高產(chǎn)量，多酶級(jí)聯(lián)方式的利用具有重要意義。多酶級(jí)聯(lián)催化已經(jīng)成為生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)物的重要方式[12-15]，由于其“綠色”、高效、可持續(xù)等。同時(shí)，由于底物通道[16]或空間臨近效應(yīng)[17,18]，可以使得一個(gè)酶的產(chǎn)物快速成為另一個(gè)酶的底物，加快反應(yīng)速度[19]?；诘鞍踪|(zhì)的生物分子支架是目前應(yīng)用最廣泛的多酶固定化材料之一，由于其可進(jìn)行基因編輯，可由細(xì)菌合成、組裝條件溫和且經(jīng)濟(jì)[20-22]。Clark等[23]將從深海超嗜熱菌詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）中分離出的預(yù)折疊蛋白的單個(gè)亞基γ-PFD（γ-Prefoldin）突變成可通過靜電相互作用有序排列的EE、KK單體，單體的N-或C-端很容易設(shè)計(jì)來連接功能分子。并利用了熒光蛋白對（mCerulean3、mVenus）,證明了其可在胞外自組裝[24]，表明其有作為支架固定酶的潛力。然而，并未進(jìn)一步探究其胞內(nèi)應(yīng)用。

基于此，在大腸桿菌中異源表達(dá)樹干畢赤酵母（Scheffersomyces stipitisCBS 6054）的D-木糖還原酶（SsXR）和豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarumbv.viciae3841）來源的半乳糖醇脫氫酶（RlGDH），通過大腸桿菌內(nèi)源性β-半乳糖苷酶將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖，SsXR將半乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖醇，RlGDH將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為D-塔格糖。為降低中間產(chǎn)物的流失，利用蛋白支架EE、KK分別與和SsXR、RlGDH進(jìn)行融合，依靠支架的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)雙酶級(jí)聯(lián)，提高D-塔格糖合成效率（圖1），并對其搖瓶中發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化探究，以期為D-塔格糖的高效生物合成提供潛在菌株。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

DH5α、BL21大腸桿菌感受態(tài)購買自生工生物工程（上海）有限公司，本研究用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要生化試劑

蛋白胨、酵母粉，OXOID；瓊脂粉、氯化鈉，國藥集團(tuán)；瓊脂糖、D-塔格糖、L-半胱氨酸鹽酸鹽無水物，源葉生物科技有限公司；乳糖、咔唑，上海麥克林生化科技股份有限公司；硫酸，永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，西隴科學(xué)股份有限公司；BamHI、XhoI等限制性核酸內(nèi)切酶購于TaKaRa公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、小量質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒和膠回收試劑盒購于南京諾維贊生物科技有限公司；Ni預(yù)裝重力柱、變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

Buffer A：20 mmol/L咪唑、500 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH值8.00。

Buffer B：300 mmol/L咪唑、500 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH值8.00。

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10、酵母粉5、氯化鈉10。

LB固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10、酵母粉5、氯化鈉10、瓊脂粉20。

TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12、酵母粉24、甘油10、磷酸二氫鉀2.30、磷酸氫二鉀12.50。

M9培養(yǎng)基（g/L）：七水合磷酸二氫鈉12.80、磷酸二氫鉀3、氯化鈉0.50、氯化銨1、1 mol/L MgSO42 mL、20%葡萄糖溶液20 mL、1 mol/L氯化鈣0.10 mL，補(bǔ)充水至1 L。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MQT-60R搖床，上海旻泉儀器有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；GL-20G-II臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HN98超聲波信號(hào)發(fā)生器，上海汗諾儀器有限公司；T960A智能PCR儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；721N紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；核酸電泳儀，上海天能科技有限公司；F-7000熒光光譜儀，日立公司；科樂比微量分光光度計(jì)，德國伯赫。

1.3 方法

1.3.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室保藏的質(zhì)粒為模版，參照NCBI獲得的SsXR、RlGDH（GenBank AcceSsion No.分別為XP_001385181、WP_011650422）和EE/KK基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如表1所示，引物BamH I-SsXR-F和SsXR-XhoI-R、BamH I-RlGDH-F和RlGDH-XhoI-R所對應(yīng)的模板為質(zhì)粒pETDuet-SnoopCatcher-SsXR-SpyCatcher-RlGDH分別擴(kuò)增片段SsXR、RlGDH；引物r-SsXR-F和SsXR-XhoI-R（r-RlGDH-F和RlGDH-XhoI-R）以pETDuet-SnoopCatcher-SsXR-SpyCatcher-RlGDH質(zhì)粒為模版，pET-BamH I-KK-F和KK-R（pCDF-BamH I-EE-F和EE-R）所對應(yīng)的模板為質(zhì)粒pETDuet-KK-spyCatcher（pCDFDuet-EE-snoopCatcher）；獲取的片段通過引物pET-BamH I-KK-F（pCDF-BamH I-EE-F）和SsXR-XhoI-R（RlGDH-XhoI-R）融合pcr擴(kuò)增得到KK-SsXR（EE-RlGDH）。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，退火溫度根據(jù)引物Tm值設(shè)定，72 ℃延伸，延伸時(shí)間根據(jù)序列長度設(shè)定，33個(gè)循環(huán)后在72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過0.80%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。SsXR、RlGDH、KK-SsXR和EE-RlGDH片段通過BamH I和XhoI雙酶切連接到載體上（pETDuet、pCDFDuet）。通過T4連接酶16 ℃過夜連接并導(dǎo)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。利用抗性基因平板篩選進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，提取質(zhì)粒送至通用生物（安徽）股份有限公司進(jìn)行測序，利用snapgene軟件進(jìn)行同源比對，確定插入序列正確性，得到正確的質(zhì)粒pCDF-SsXR、pCDF-EE-SsXR、pET-RlGDH、pET-KK-RlGDH。最后將提取得到的正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞得到重組菌（對照組：BL21-X/G、實(shí)驗(yàn)組：BL21-EX/KG）。

用相同的方法，利用引物pET-KK-gj-R和pET-KK-gj-F，pCDF-EE-gj-R和pCDF-EE-gj-F分別以pET-KK-RlGDH和pCDF-EE-SsXR為模版得到片段pET-KK-gj和pCDF-EE-gj，引物C-EGFP-F和C-EGFP-R，N-EGFP-F和N-EGFP-R分別以24Ura-C-EGFP和23Leu-N-EGFP為模版獲得片段C-EGFP和N-EGFP。利用同源重組連接并導(dǎo)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。獲得質(zhì)粒pETDuet-KK-C-EGFP、pCDFDuet-EE-N-EGFP。引物BamHI-C-EGFP-F和XhoI-C-EGFP-R，BamHI-N-EGFP-F和XhoI-N-EGFP-R分別以24Ura-C-EGFP和23Leu-N-EGFP為模版獲得片段C-EGFP和N-EGFP通過雙酶切連接到載體上，利用通過T4連接酶16 ℃過夜連接并導(dǎo)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過驗(yàn)證得到pETDuet-C-EGFP和pCDFDuet-N-EGFP。最后將提取得到的正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞得到重組菌游離組（BL21-N/C）和支架組（BL21-EN/KC）。本研究使用的引物序列參見表2。

1.3.2 蛋白支架胞內(nèi)外表征

1.3.2.1 EE-mCherry和KK-GFP酶胞外自組裝表征

有研究表明能觀察熒光共振現(xiàn)象只能是兩種熒光蛋白距離小于10 nm時(shí)[25]。因此，利用已經(jīng)構(gòu)建的大腸桿菌BL21/pCDF-EE-mCherry、BL21/pET-KK-GFP，將其在37 ℃培養(yǎng)OD600到0.60～0.80，加入0.25 mmol/L IPTG，20 ℃誘導(dǎo)24 h后，6000 r/min 10 min收集菌體，用50 mmol/L Tris HCl（pH值7.0）清洗三次，重懸超聲破碎，12000 r/min 4 ℃離心10 min上清液通過Ni柱純化，通過Buffer A去除雜蛋白后，Buffer B洗脫目標(biāo)蛋白，移入透析袋置于純水中透析去除高濃度鹽離子。利用SDS PAGE驗(yàn)證重組蛋白的可溶性表達(dá)，純化的蛋白濃度通過科樂比微量分光光度計(jì)測定。將透析得到的純蛋白EE-mCherry和KK-GFP以1:0、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:12在50 mmol/L PBS（pH值7.0）混合室溫下自組裝1 h后，熒光光譜儀測定熒光強(qiáng)度。

1.3.2.2 KK-C-EGFP和EE-N-EGFP熒光蛋白胞內(nèi)自組裝表征

分裂成兩部分的C-EGFP和N-EGFP熒光蛋白，只有當(dāng)兩個(gè)分裂組分被靶向靠近時(shí)，才能觀察到熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，廣泛應(yīng)用在表征胞內(nèi)的自聚集效果[26,27]。因此，將重組菌（游離組：BL21-N/C和支架組：BL21-EN/KC）接種于5 mL LB，添加5 μL氨芐青霉素（100 mg/mL）和5 μL硫酸鏈霉素（50 mg/mL），37 ℃過夜培養(yǎng)。以2%（V/V）的接種量接種于50 mL TB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.60～0.80時(shí)，添加終濃度為0.25 mmol/L的IPTG于20 ℃下誘導(dǎo)24 h，取適量菌液離心、得到菌體用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值7.0）洗滌菌體3次，重懸，通過稀釋得到OD600相近的菌體重懸液，以488 nm為激發(fā)波長，518 nm為發(fā)射波長測定熒光強(qiáng)度。

1.3.3 重組大腸桿菌發(fā)酵合成D-塔格糖方法

從活化平板上挑取單菌落（游離組、支架組）接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，添加相應(yīng)的抗性，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。以2%（V/V）的接種量，接種于含10 g/L乳糖的50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.60～0.80時(shí)，添加終濃度為0.25 mmol/L的IPTG于25 ℃下誘導(dǎo)與發(fā)酵培養(yǎng)。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)取樣，并測定D-塔格糖產(chǎn)量。

1.3.4 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基種類優(yōu)化

選擇TB、M9以及LB培養(yǎng)基，其余條件不變，按照1.3.3進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.4.2 發(fā)酵溫度優(yōu)化

以LB為培養(yǎng)基，設(shè)置誘導(dǎo)與發(fā)酵溫度為16、20、25、30、37 ℃，其余條件不變，按照1.3.3進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.4.3 誘導(dǎo)劑添加量優(yōu)化

以LB為培養(yǎng)基，誘導(dǎo)與發(fā)酵溫度為20 ℃，設(shè)置誘導(dǎo)劑添加量為0.1、0.25、0.25、1 mmol/L，其余條件不變，按照1.3.3進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.5 D-塔格糖與乳糖測定方法

發(fā)酵液上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，采用Carbomix Ca-NP10（10 μm，交聯(lián)度8%，7.80×300 mm）柱的島津高效液相色譜儀（示差折光檢測器）分析測定D-塔格糖與乳糖。流動(dòng)相為100%水，流速0.40 mL/min，85 ℃，洗脫35 min。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，每次實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。采用Microsoft Excel 365軟件計(jì)算平均值和SD值；采用SPSS26.0進(jìn)行單因素方差分析確定顯著性差異，n.s無顯著性差異（P＞0.05）、*差異顯著（P＜0.05）、**差異非常顯著（P＜0.01）****差異極顯著（P＜0.0001），并用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 EE/KK蛋白支架表征

2.1.1 EE-mCherry和KK-GFP酶胞外自組裝表征

為探究EE/KK支架是否具有自組裝特性，首先在胞外進(jìn)行表征。將熒光蛋白KK-mCherry、EE-GFP通過鎳柱純化，SDS PAGE結(jié)果表明KK-mCherry、EE-GFP可以形成良好的可溶性表達(dá)（圖2）。以不同的化學(xué)計(jì)量比混合在50 mmol/L PBS（pH值7.0）孵育1 h后，測定得到的熒光強(qiáng)度為y軸和波長為x軸得到圖3。圖3表明，隨著KK-mCherry的量增加，GFP在510 nm的熒光強(qiáng)度逐漸降低降低，而KK-mCherry在610 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加。這表明熒光蛋白對形成了熒光共振，證實(shí)EE/KK支架可以胞外自組裝。

圖2 純化的重組蛋白KK-mCherry和EE-GFP的SDS PAGEFig.2 SDS PAGE of purified recombinant proteins KK-mCherry and EE-GFP

圖3 以不同摩爾比組裝的EE-GFP和KK-mCherry熒光蛋白復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜Fig.3 Fluorescence emission spectra of EE-GFP and KK-mCherry fluorescent protein complexes assembled at different molar ratios

2.1.2 KK-C-EGFP和EE-N-EGFP熒光蛋白胞內(nèi)自組裝表征

前面成功驗(yàn)證了支架可在胞外自組裝。為進(jìn)一步驗(yàn)證支架在胞內(nèi)的自組裝特性，將構(gòu)建的重組大腸桿菌游離組（BL21-N/C）和支架組（BL21-EN/KC）分別誘導(dǎo)，使得熒光蛋白（C-EGFP、N-EGFP）和支架-熒光蛋白復(fù)合體（KK-C-EGFP、EE-N-EGFP）在胞內(nèi)表達(dá)。取誘導(dǎo)液離心收集菌體。稀釋得到相同OD600的菌液，觀察到支架組的熒光強(qiáng)度增加了約13.33倍（圖4）。Lau等[26]在釀酒酵母中通過包封蛋白實(shí)現(xiàn)分裂的黃色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度僅增大2.5倍。紫外燈照射下，可見支架組的熒光強(qiáng)度顯著高于游離組（圖5）。以上結(jié)果表明，EE/KK支架可在胞內(nèi)成功自組裝，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的級(jí)聯(lián)。

圖4 游離組和支架組熒光強(qiáng)度對比圖Fig.4 Comparison chart of fluorescence intensity between the free group and the scaffold group

圖5 紫外光下的游離組（BL21-N/C）和支架組（BL21-EN/KC）菌液熒光對比圖Fig.5 Fluorescence comparison of bacteria solution in the free group (BL21-N/C) and scaffold group (BL21-EN/KC) under ultraviolet light

2.2 EE、KK自組裝支架用于D-塔格糖合成

基于EE、KK支架的胞內(nèi)表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步考察其在胞內(nèi)組裝氧化還原途徑雙酶合成D-塔格糖的能力。以大腸桿菌E. coliBL21為出發(fā)菌株，選取Scheffersomyces stipitisCBS 6054來源的木糖還原酶（SsXR）以及Rhizobium legumenosarum來源的半乳糖醇脫氫酶（RlGDH）催化D-半乳糖合成D-塔格糖。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCDF-SsXR與pET-RlGDH，進(jìn)而構(gòu)建游離酶菌株BL21-X/G，SDS-PAGE結(jié)果顯示SsXR（35.9 ku）與RlGDH（27.3 ku）成功表達(dá)（圖6，泳道1）。分別將EE、KK使用GSlinker（GGGGSGGGGS）連接至SsXR與RlGDH的N端，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDF-EE-SsXR與pET-KK-RlGDH，進(jìn)而構(gòu)建支架級(jí)聯(lián)型菌株BL21-EX/KG，SDS-PAGE結(jié)果顯示EE-SsXR（56.0 ku）與KK-RlGDH（47.3 ku）成功表達(dá)（圖6，泳道2）。

圖6 E. coli BL21-X/G與E. coli BL21-EX/KG中蛋白表達(dá)SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of protein expression in E. coli BL21-X/G and E. coli BL21-EX/KG

在含有10 g/L乳糖的LB培養(yǎng)基中，重組菌株BL21-X/G與BL21-EX/KG培養(yǎng)至OD600為0.50～0.60時(shí)，發(fā)酵溫度由37 ℃調(diào)至25 ℃，加入0.25 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。發(fā)酵48 h，EE-KK支架級(jí)聯(lián)體系（BL21-EX/KG）的D-塔格糖產(chǎn)量達(dá)到3.52 g/L，相比于游離體系（BL21-X/G）提高50%（圖7）。結(jié)果說明，基于EE/KK的蛋白支架可以有效級(jí)聯(lián)胞內(nèi)目標(biāo)酶，強(qiáng)化催化效率。據(jù)此推測，EE-KK蛋白支架可能通過拉進(jìn)SsXR與RlGDH酶之間的距離，產(chǎn)生類似“底物通道”效應(yīng)[16]，此外，SsXR與RlGDH催化所需的輔酶（NAD(P)H/NAD(P)+）之間也可以快速循環(huán)，進(jìn)而提高D-塔格糖的合成效率。

圖7 游離酶體系與EE-KK支架級(jí)聯(lián)體系合成D-塔格糖產(chǎn)量比較Fig.7 Comparison of the titer of D-tagatose synthesis by free enzyme system and EE/KK scaffold cascade system

2.3 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

進(jìn)一步地，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基種類、發(fā)酵溫度、IPTG添加量，以期BL21-EX/KG在搖瓶發(fā)酵合成D-塔格糖的產(chǎn)量得到進(jìn)一步提升。

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基種類優(yōu)化

結(jié)果如圖8所示，發(fā)酵48 h，M9培養(yǎng)基中菌株生物量（OD600為8.12）與D-塔格糖產(chǎn)量最低（1.07 g/L），這可能因?yàn)镸9培養(yǎng)基成分簡單，有機(jī)氮源較為缺乏，影響菌體的生長以及蛋白的表達(dá)[28]。而利用TB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，48 h菌株生物量分別達(dá)到12.30和11.10。雖然TB培養(yǎng)基略高于LB培養(yǎng)基，但是TB培養(yǎng)基中D-塔格糖的產(chǎn)量卻顯著低于LB培養(yǎng)基（1.85 g/L VS 3.52 g/L）。猜測是因?yàn)門B培養(yǎng)基中含有甘油，由于甘油的攝入與代謝會(huì)提高大腸桿菌胞內(nèi)NADH的含量，消耗NAD+[29]，而RlGDH在催化半乳糖醇合成D-塔格糖的同時(shí)也會(huì)消耗NAD+合成NADH，因此，甘油的添加可能會(huì)導(dǎo)致NAD+的供給不足，進(jìn)而影響D-塔格糖的合成。

圖8 發(fā)酵培養(yǎng)基種類對D-塔格糖合成的影響Fig.8 Effect of medium type on D-tagatose synthesis

為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的猜測，在LB培養(yǎng)基中分別添加10 g/L甘油、10 g/L葡萄糖以及微量元素，考察對BL21-EX/KG合成D-塔格糖的影響。結(jié)果如圖9所示，微量元素的添加對D-塔格糖的合成具有一定的積極影響，產(chǎn)量略有提高。葡萄糖的添加使得D-塔格糖產(chǎn)量降低56%，這歸結(jié)于大腸桿菌中存在的“葡萄糖效應(yīng)”，影響乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[30]。而甘油的添加也降低了37%的D-塔格糖產(chǎn)量，這與在利用TB培養(yǎng)基發(fā)酵合成過程中的現(xiàn)象一致，證實(shí)了我們的猜測，LB培養(yǎng)基中，甘油的添加會(huì)影響D-塔格糖的合成。因此，后續(xù)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基。

圖9 LB發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘油、葡萄糖以及微量元素對D-塔格糖合成的影響Fig.9 Effects of adding glycerol、glucose and trace elements in LB fermentation medium on the synthesis of D-tagatose

2.3.2 發(fā)酵溫度與誘導(dǎo)劑添加量優(yōu)化

溫度和IPTG濃度是影響外源蛋白表達(dá)的重要因素，此外發(fā)酵溫度也影響細(xì)胞生長代謝與產(chǎn)物的合成。我們在LB培養(yǎng)基中進(jìn)一步考察了不同發(fā)酵溫度和IPTG添加量對合成D-塔格糖的影響。

首先考察了溫度對D-塔格糖合成的影響。圖10所示，菌體生物量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加，30 ℃與37 ℃時(shí)菌體生長速率較快，在16 ℃下則相反。不同的是，D-塔格糖的產(chǎn)量與溫度呈負(fù)相關(guān)。在20 ℃下，D-塔格糖產(chǎn)量最高，達(dá)到3.82 g/L。可能是較高的溫度影響蛋白的表達(dá)，易形成包涵體。因此，綜合考慮，后續(xù)選擇20 ℃為D-塔格糖合成的發(fā)酵溫度。

圖10 不同發(fā)酵溫度對D-塔格糖合成的影響Fig.10 Effects of different fermentation temperatures on the synthesis of D-Tagatose

除溫度之外，IPTG添加量對蛋白的表達(dá)也同樣重要。我們進(jìn)一步比較了不同IPTG濃度（0.1、0.25、0.5和1.0 mmol/L）對D-塔格糖合成的影響。結(jié)果如圖11所示，隨著IPTG濃度的升高反而導(dǎo)致D-塔格糖產(chǎn)量的降低。這與Couto等[31]研究結(jié)果一致，較高的IPTG濃度不會(huì)導(dǎo)致效價(jià)提高反而會(huì)造成代謝負(fù)荷從而影響生產(chǎn)力。0.1和0.25 mmol/L的添加量下，D-塔格糖的產(chǎn)量無顯著性差異。因此，選擇0.1 mmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的IPTG添加量。

圖11 不同IPTG濃度對D-塔格糖合成的影響Fig.11 Effects of different IPTG concentrations on the synthesis of D-Tagatose

2.3.3 最適搖瓶發(fā)酵條件下菌株BL21-EX/KG合成D-塔格糖

基于上述優(yōu)化條件，在搖瓶中考察菌株BL21-EX/KG批次發(fā)酵合成D-塔格糖的能力，結(jié)果如圖12所示。發(fā)酵48 h后，菌體到達(dá)穩(wěn)定期，OD600為11.50。D-塔格糖的產(chǎn)量持續(xù)增長，到60 h時(shí)到達(dá)峰值3.93 g/L，此時(shí)乳糖幾乎完全消耗，D-塔格糖對乳糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.39 g/g，為理論轉(zhuǎn)化率（0.53 g/g）的74%。Zhang等[32]通過肽接頭（GGGGS）3偶聯(lián)β-D-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖異構(gòu)酶實(shí)現(xiàn)從乳糖產(chǎn)D-塔格糖，轉(zhuǎn)化率為42.40%。Zhang等[33]在半乳糖激酶基因失活的植物乳桿菌中過表達(dá)β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，實(shí)現(xiàn)33%的乳糖轉(zhuǎn)化率?？芍緦?shí)驗(yàn)構(gòu)建的菌株可實(shí)現(xiàn)較高的乳糖轉(zhuǎn)化率。然而乳糖消耗速率較慢，從而導(dǎo)致較低的D-塔格糖生產(chǎn)強(qiáng)度[0.07 g/(L·h)]。猜測可能與搖瓶中較低的生物量有關(guān)。此外，大腸桿菌通過乳糖透性酶轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖，轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以結(jié)合高密度發(fā)酵以及細(xì)胞透性化[34]提高D-塔格糖的生產(chǎn)強(qiáng)度。

圖12 BL21-EX/KG搖瓶發(fā)酵合成D-塔格糖過程Fig.12 D-Tagatose production from fermentation by BL21-EX/KG

3 結(jié)論

本研究首先驗(yàn)證了EE-KK單體在胞外和胞內(nèi)均具有自組裝能力。為進(jìn)行概念驗(yàn)證，以大腸桿菌BL21為底盤細(xì)胞，通過與自組裝蛋白支架EE、KK融合表達(dá)SsXR、RlGDH，成功實(shí)現(xiàn)多酶級(jí)聯(lián)催化乳糖合成D-塔格糖。支架組BL21-EX/KG相較于游離組BL21-X/G，塔格糖產(chǎn)量提高了50%。進(jìn)一步從發(fā)酵培養(yǎng)基種類、IPTG添加量、發(fā)酵溫度優(yōu)化了發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件為：LB培養(yǎng)基，溫度20 ℃，0.1 mmol/L IPTG添加量。以10 g/L乳糖為底物，搖瓶中BL21-EX/KG可實(shí)現(xiàn)D-塔格糖產(chǎn)量達(dá)到3.93 g/L，為理論轉(zhuǎn)化率的74%。本研究為基于氧化還原酶途徑生物合成D-塔格糖提供了研究基礎(chǔ)，為多酶級(jí)聯(lián)組裝提供了有效的工具。