賈曉蒙，李思童，路江浩，賈洪利，郭紅敏，霍文敏，楊玲

（河北一然生物科技股份有限公司研發(fā)中心，河北石家莊 050000）

益生菌是指足量攝入時(shí)能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生健康益處的活性微生物，其定植于腸道可以分泌大量的代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，從而增強(qiáng)機(jī)體腸道屏障并調(diào)節(jié)腸道免疫使機(jī)體受益[1-3]。通過(guò)補(bǔ)充益生菌改善腸道微生態(tài)來(lái)治療胃腸道疾病的療法已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，如Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌CCFM16可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群和短鏈脂肪酸代謝緩解中國(guó)成年人的慢性便秘；臧凱麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充益生菌能夠改善便秘和腹瀉人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)及相關(guān)癥狀，提高菌群多樣性和短鏈脂肪酸水平；補(bǔ)充益生菌能夠減少成人的抗生素腹瀉持續(xù)時(shí)間，幫助恢復(fù)營(yíng)養(yǎng)不良兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)并減少腹瀉的發(fā)生[6-9]。Nobutani等[10]發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌CP2305能夠顯著改善腸易激綜合征（Irritable Bowel Syndrome，IBS）的嚴(yán)重性指數(shù)評(píng)分。Palumbo等[11]研究發(fā)現(xiàn)益生菌混合與藥物聯(lián)合使用能夠提高潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）患者的治療效果。

目前人們對(duì)益生菌的研究大多集中于雙歧桿菌屬及乳桿菌屬，而對(duì)嗜熱鏈球菌在改善腸道健康中的應(yīng)用鮮有研究[12]。為明確嗜熱鏈球菌在調(diào)節(jié)腸道健康中的作用機(jī)制，本研究選用HT-29細(xì)胞結(jié)合腸道菌群體外批量發(fā)酵模擬系統(tǒng)，考察了嗜熱鏈球菌S131在特異性調(diào)控粘蛋白和緊密連接蛋白基因表達(dá)水平，調(diào)節(jié)免疫因子分泌，增殖腸道有益菌，并拮抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicE. coli，ETEC）造成的腸道損傷等方面的作用，為開(kāi)發(fā)具有腸道調(diào)節(jié)功能的嗜熱鏈球菌產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌S131河北一然生物科技股份有限公司保藏；HT-29細(xì)胞（人結(jié)腸癌細(xì)胞）武漢普諾賽生命科技有限公司。

胎牛血清、HT-29細(xì)胞培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液，武漢普諾賽生命科技有限公司；細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版（SYBR Green）試劑盒，天根生化科技有限公司；IL-8、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，四正柏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國(guó)nexcelom公司；Multiskan Sky酶標(biāo)儀、Fresco21型高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；CKX41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；DH-160HI二氧化碳培養(yǎng)箱、LRH-250F生化培養(yǎng)箱，昆山一恒儀器有限公司；9700型PCR擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；LM2012實(shí)時(shí)熒光PCR分析儀，上海復(fù)星醫(yī)學(xué)檢測(cè)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)

將在-80 ℃超低溫冰箱中保存的HT-29細(xì)胞取出，37 ℃恒溫水浴迅速解凍復(fù)蘇，培養(yǎng)瓶中加入一定量的HT-29細(xì)胞完全培養(yǎng)基，φ=5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底面積80%后，將其用胰蛋白酶消化處理轉(zhuǎn)移至大號(hào)培養(yǎng)瓶中連續(xù)傳代3次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 S131及ETEC的培養(yǎng)

嗜熱鏈球菌S131及ETEC以3%（V/V）的接種量接種于MRS湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)傳代3次，其中第3代培養(yǎng)18 h以恢復(fù)菌種活力后調(diào)整菌液濃度。3代菌種4 ℃ 5000 r/min離心5 min，收集菌體用PBS洗滌2次，4 ℃ 5000 r/min離心5 min后，去除上清，用MyCoy’s 5A培養(yǎng)基重懸，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整S131及ETEC菌體濃度均為108CFU/mL，備用。

1.3.3 體外發(fā)酵系統(tǒng)

表1 體外發(fā)酵過(guò)程中各分組接種方式Table 1 Inoculation methods of each group during in vitro fermentation

體外發(fā)酵系統(tǒng)中基礎(chǔ)培養(yǎng)基（YCFA）參考陳軍奎等[13]研究配置好后pH調(diào)節(jié)到6.5，然后于厭氧條件下在10 mL的西林瓶中分裝5 mL培養(yǎng)基，密封后高壓滅菌。

取正常人新鮮糞便用生理鹽水按照1:10比例稀釋過(guò)濾得到糞菌懸液，取500 μL處理好的新鮮糞菌懸液接種到Y(jié)CFA培養(yǎng)基中后，按照表2分組接種ETEC及嗜熱鏈球菌S131，于37 ℃培養(yǎng)24 h后將發(fā)酵液于9000 r/min離心3 min，取沉淀進(jìn)行菌群檢測(cè)，上清液0.22 μm膜過(guò)濾后與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)。

表2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences of RT-PCR

1.3.4 CCK-8細(xì)胞增殖能力測(cè)定

HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至3代后將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升2×105個(gè)，每孔100 μL細(xì)胞液接于96孔板中，培養(yǎng)16～20 h細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔接種該分組發(fā)酵上清液10 μL于96孔板，接種10 μL細(xì)胞培養(yǎng)液為空白組，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h后參考CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：每孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

式中：

B——細(xì)胞相對(duì)增殖率，%；

As——實(shí)驗(yàn)組OD值；

Ac——空白對(duì)照組OD值。

1.3.5 發(fā)酵上清液與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)

HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至3代后將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升2×105個(gè)，每孔2 mL細(xì)胞液接于24孔板中，培養(yǎng)16～20 h細(xì)胞貼壁后，更換2 mL新鮮培養(yǎng)液。對(duì)照組、ETEC組、干預(yù)組及治療組分別每孔接種該分組發(fā)酵上清液200 μL于24孔板，接種200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液為空白組，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h后分別收集細(xì)胞及上清液，-80 ℃冰箱儲(chǔ)存待用。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

共培養(yǎng)后HT-29細(xì)胞按照RNA Easy Fast動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（離心柱型）操作說(shuō)明提取細(xì)胞RNA，并通過(guò)Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在-80 ℃保存。使用Super Real熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，分析粘蛋白基因（MUC2）、水通道蛋白-3基因（AQP-3）、緊密連接蛋白基因（ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Occludin）表達(dá)水平，RT-PCR引物序列見(jiàn)表2。

參照SYBR Green試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行加樣。加樣后進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)參考張秋月等[14]并加以修改：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，循環(huán)45次。溶解曲線分析步驟為65 ℃～95 ℃，每步升0.5 ℃，保持5 s。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 ELISA測(cè)定HT-29細(xì)胞免疫因子質(zhì)量濃度

共培養(yǎng)后將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液離心取上清分裝至無(wú)酶PE管中，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)梯度稀釋IL-8、IL-1β標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)操作，細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白孔，反應(yīng)結(jié)束后迅速用酶標(biāo)儀測(cè)定各反應(yīng)孔在450 nm波長(zhǎng)下的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子質(zhì)量濃度。

1.3.8 腸道菌群檢測(cè)

收集發(fā)酵液離心取沉淀，參考楊玲等[15]研究用磁珠法提取沉淀中微生物的總DNA并進(jìn)行qPCR檢測(cè)，由河北一然生物科技股份有限公司MAP腸道檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。采用Origin軟件繪圖，采用Excel 2016、SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌S131對(duì)HT-29細(xì)胞黏蛋白表達(dá)的影響

腸道中的杯狀細(xì)胞能夠分泌黏蛋白形成一層黏液屏障，黏液屏障能夠覆蓋在腸道上皮細(xì)胞表面從而保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免受病原菌和有毒有害物質(zhì)的侵襲，同時(shí)粘液屏障也是腸道的潤(rùn)滑劑，黏液層的完整性對(duì)腸上皮細(xì)胞保護(hù)及腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是至關(guān)重要的[8,16,17]。II型黏蛋白（MUC2）是典型的分泌型黏蛋白，存在于小腸和大腸中，能夠形成粘液骨架，是腸道粘液的主要成分[18]。研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，S131使HT-29細(xì)胞MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平提升至1.34倍，同時(shí)ETEC下調(diào)MUC2基因的表達(dá)水平至0.75倍，而S131的干預(yù)能夠改善ETEC對(duì)MUC2基因表達(dá)的抑制效果，使其恢復(fù)至正常水平還略有升高。表明S131能夠增加腸道的粘液分泌，緩解ETEC感染造成的粘液屏障損傷。

圖1 嗜熱鏈球菌S131對(duì)HT-29細(xì)胞黏蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Streptococcus thermophilus S131 on mucin expression in HT-29 cells

2.2 嗜熱鏈球菌S131對(duì)HT-29細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

腸上皮組織結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，是有效避免腸道細(xì)菌或其他物質(zhì)透過(guò)腸粘膜進(jìn)入其他組織的基礎(chǔ)[17,19]。腸上皮細(xì)胞之間既能夠形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、孔徑較小的緊密連接結(jié)構(gòu)，也可以形成結(jié)構(gòu)層次簡(jiǎn)單、孔徑較大的緊密連接結(jié)構(gòu)，選擇性的透過(guò)小分子量或大分子量分子[20]。研究表明，益生菌能夠使體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)、改變緊密連接蛋白在胞內(nèi)的分布[21]。同時(shí)腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌分泌的短鏈脂肪酸能夠起到維持腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接的作用，從而保護(hù)腸道機(jī)械屏障[22]。與對(duì)照組相比，S131的刺激顯著上調(diào)了HT-29細(xì)胞緊密連接蛋白基因的表達(dá)水平，ZO-1、ZO-2、Claudin-1與Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)率分別為4.59、2.17、5.81和4.25，而ETEC使HT-29細(xì)胞ZO-2的mRNA相對(duì)表達(dá)率下調(diào)至0.63，同時(shí)上調(diào)了ZO-1的相對(duì)表達(dá)率至1.39，未發(fā)現(xiàn)ETEC對(duì)Claudin-1和Occludin基因表達(dá)的顯著影響。但S131的干預(yù)能夠在ETEC存在的情況下上調(diào)各緊密連接蛋白的相對(duì)表達(dá)。與張中偉、Sawada等[23,24]研究發(fā)現(xiàn)致病菌能夠通過(guò)改變緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)與功能、破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等方式影響腸道屏障功能的結(jié)果略有差異，本研究顯示S131能夠上調(diào)HT-29細(xì)胞緊密連接蛋白的基因表達(dá)，但ETEC對(duì)其表達(dá)的抑制效果并不明顯，ETEC對(duì)腸道機(jī)械屏障的破壞可能是通過(guò)其它機(jī)制造成的。

圖2 嗜熱鏈球菌S131對(duì)HT-29細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Streptococcus thermophilus S131 on tight junction protein expression in HT-29 cells

2.3 嗜熱鏈球菌S131拮抗ETEC引起的HT-29細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

圖3 嗜熱鏈球菌S131拮抗ETEC引起的HT-29細(xì)胞炎癥因子表達(dá)Fig.3 Streptococcus thermophilus S131 antagonizes the expression of inflammatory factors in HT-29 cells induced by ETEC

大量研究表明，ETEC能夠影響腸道屏障的通透性、破壞免疫穩(wěn)態(tài)，從而引起腸道炎癥，最終損害腸道健康[25,26]。抗生素則被認(rèn)為是最有效的抗菌藥物，而抗生素的副作用及耐藥菌的出現(xiàn)使得人們對(duì)新的干預(yù)方式產(chǎn)生了極大興趣[27,28]。郭遠(yuǎn)驥等[29]與Candela等[30]研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬能夠有效抑制ETEC刺激HT-29細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，益生菌能夠降低仔豬或小鼠體內(nèi)炎癥因子水平，從而降低炎癥反應(yīng)[31-33]。與先前研究結(jié)果相似，我們的研究結(jié)果顯示，ETEC組促炎因子IL-8及IL-1β濃度與對(duì)照組差異顯著，相較于對(duì)照組分別增加了20.82%和50.05%，表現(xiàn)出較高的促炎作用；接種S131后，IL-8與IL-1β濃度相較于ETEC組分別下降了30.16%和86.82%，相較于對(duì)照組分別下降了15.62%和80.22%，表明S131能夠抑制ETEC刺激HT-29細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子IL-8與IL-1β，從而抑制炎癥發(fā)生、提高腸道免疫力。

2.4 嗜熱鏈球菌S131對(duì)HT-29細(xì)胞水通道蛋白-3表達(dá)的影響

圖4 嗜熱鏈球菌S131對(duì)HT-29細(xì)胞水通道蛋白-3表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Streptococcus thermophilus S131 on aquaporin-3 expression in HT-29 cells

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)水在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)，哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)10種不同的水通道蛋白亞型[34,35]。其中水通道蛋白-3（AQP-3）是介導(dǎo)人體結(jié)腸水液代謝的關(guān)鍵因子之一，其表達(dá)可受多種因素的影響，有研究表明可以通過(guò)調(diào)節(jié)AQP-3的表達(dá)來(lái)控制結(jié)腸對(duì)水液的吸收速率，從而改善便秘或者腹瀉癥狀[36]。由圖可知與對(duì)照相比S131能夠使HT-29細(xì)胞AQP-3基因表達(dá)率提高至1.33倍，ETEC使HT-29細(xì)胞AQP-3基因相對(duì)表達(dá)率下調(diào)至0.34，而S131的干預(yù)能夠改善ETEC造成的AQP-3表達(dá)下調(diào)。雖然ETEC引起腹瀉的水外流機(jī)制尚未明確，但其可能與AQP-3表達(dá)下調(diào)有關(guān)，而S131可能通過(guò)恢復(fù)AQP-3的表達(dá)改善ETEC造成的腹瀉，這與Wu等[37,38]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LB1改善ETEC引起仔豬腹瀉的機(jī)制相似。

2.5 嗜熱鏈球菌S131拮抗ETEC造成的HT-29細(xì)胞損傷

腸黏膜包括單層的上皮細(xì)胞、固定上皮細(xì)胞的結(jié)締組織和黏膜平滑肌共三層不同的結(jié)構(gòu)。腸上皮細(xì)胞的完整性對(duì)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、阻擋致病菌和內(nèi)毒素的入侵至關(guān)重要[39]。多項(xiàng)研究表明ETEC具有的毒力基因能夠通過(guò)破壞細(xì)胞骨架、引起炎癥反應(yīng)多種機(jī)制對(duì)宿主的腸道上皮細(xì)胞造成損傷[40,41]。我們的研究表明ETEC能夠降低HT-29細(xì)胞的存活率，與對(duì)照相比ETEC組的細(xì)胞增殖率降低了2.06%，而S131的干預(yù)能夠使HT-29細(xì)胞的增殖率提高21.07%，表明S131能夠清除ETEC產(chǎn)生的毒素類物質(zhì)，并產(chǎn)生有益于腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，從而拮抗ETEC對(duì)腸上皮細(xì)胞的損傷。

圖5 嗜熱鏈球菌S131拮抗ETEC造成的HT-29細(xì)胞損傷Fig.5 HT-29 cell damage caused by ETEC antagonism by Streptococcus thermophilus S131

2.6 嗜熱鏈球菌S131對(duì)腸道有益菌的影響

圖6 嗜熱鏈球菌S131對(duì)腸道有益菌的影響Fig.6 Effect of Streptococcus thermophilus S131 on beneficial bacteria in intestinal tract

乳桿菌和雙歧桿菌是公認(rèn)的有益菌，能夠通過(guò)多種機(jī)制改善腸道健康。柔嫩梭菌（Faecalibacterium）是腸道中主要的丁酸產(chǎn)生菌之一，能夠起到維持腸道穩(wěn)態(tài)和抗炎的作用，研究表明患有消化系統(tǒng)疾病的患者，如慢性便秘、乳糜瀉、IBS及IBD患者中的柔嫩梭菌豐度低于平均水平[42,43]。多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）參與調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，能夠提高宿主的營(yíng)養(yǎng)利用率并維持腸道微生態(tài)平衡[44,45]。對(duì)體外發(fā)酵系統(tǒng)中的腸道有益菌豐度進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)S131能夠增加柔嫩梭菌屬和多形擬桿菌屬的相對(duì)豐度，但對(duì)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度無(wú)顯著性影響。ETEC顯著降低了系統(tǒng)中雙歧桿菌、多形擬桿菌屬和柔嫩梭菌屬的相對(duì)豐度，但對(duì)乳桿菌屬的相對(duì)豐度無(wú)顯著性影響。另外，S131干預(yù)改善了ETEC造成的乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、多形擬桿菌和柔嫩梭菌屬的降低，使其恢復(fù)正常水平。表明S131能夠增加腸道有益生菌，并緩解ETEC造成的腸道有益菌生長(zhǎng)抑制。

3 結(jié)論

本研究以HT-29細(xì)胞與腸道菌群體外批量發(fā)酵模擬系統(tǒng)相結(jié)合，考察了嗜熱鏈球菌S131對(duì)腸道屏障的改善作用、對(duì)ETEC損傷腸道的拮抗作用及對(duì)腸道有益菌的增殖效果。結(jié)果表明S131可能通過(guò)增強(qiáng)HT-29細(xì)胞的黏蛋白表達(dá)和緊密連接性并下調(diào)炎癥反應(yīng)來(lái)拮抗ETEC對(duì)腸上皮細(xì)胞的損傷，同時(shí)對(duì)ETEC造成的HT-29細(xì)胞AQP-3表達(dá)下調(diào)也能夠起到一定的緩解作用。S131增加了柔嫩梭菌屬和多形擬桿菌屬的相對(duì)豐度，并改善了ETEC造成的有益菌種屬降低。表明S131具有增強(qiáng)腸道屏障、拮抗致病菌損傷和調(diào)節(jié)腸道菌群的潛力。本研究采用的腸道菌群體外批量發(fā)酵系統(tǒng)與HT-29細(xì)胞相結(jié)合的方法能夠在一定程度反映嗜熱鏈球菌對(duì)腸道健康的調(diào)控，但其在體內(nèi)的作用機(jī)制還需更嚴(yán)格的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究來(lái)驗(yàn)證。