徐豪，王雪竹，俞卓利，高靖汝，郭瑞，李嬌妹，李松濤，韓強(qiáng)

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江杭州 310053）（2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，浙江杭州 310053）

荷葉，是睡蓮科植物蓮的干制葉，自古以來(lái)就被當(dāng)作藥物和食物同時(shí)使用，具有清暑化濕、升發(fā)清陽(yáng)，涼血止血的功效[1]，主要分布在黃河流域、長(zhǎng)江地區(qū)、珠江中下游，尤以湖北、湖南、浙江、江蘇等南方各省為主[2]?，F(xiàn)代藥物化學(xué)發(fā)現(xiàn)，荷葉含有荷葉堿、黃酮、多糖和揮發(fā)油等化合物，具有降壓降脂、抗氧化、抗炎和抗癌等多種作用[3-6]。因此，荷葉茶或者含有荷葉成分的食品或藥物受到社會(huì)各界越來(lái)越多的關(guān)注，市場(chǎng)對(duì)于荷葉藥材的需求也越來(lái)越大，但目前市面上所售的荷葉藥材成分不一，各種組分相差較大[7]，對(duì)于荷葉藥材的藥效有很大影響?！吨袊?guó)藥典（2020版）》規(guī)定以Nuci含量作為荷葉質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)，目前研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、不同品種和不同處理方式會(huì)影響荷葉中荷葉堿的含量[8-11]，但同一產(chǎn)地不同品種對(duì)荷葉中Nuci含量影響鮮有報(bào)道。因此，有必要研究同一產(chǎn)地不同品種的荷葉中有效成分的含量差異。

近年來(lái)，高脂血癥（Hyperlipidemia，HLP）的發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)[12]。高脂血癥主要指體內(nèi)血脂水平異常升高，臨床上表現(xiàn)為T(mén)G、總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）的升高和（或）高密度脂蛋白膽固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）的降低，是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等嚴(yán)重危害機(jī)體健康的疾病的主要致病因素[13-15]。肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所，是脂質(zhì)沉積的主要器官，肝臟的脂質(zhì)代謝水平與高脂血癥、糖尿病、脂肪肝等心血管疾病密切相關(guān)[16]。因此，維持肝臟的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)對(duì)于預(yù)防和治療高脂血癥具有重要意義。

荷葉堿（Nuciferine，Nuci）是荷葉的主要活性成分，據(jù)研究，荷葉堿具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌、降血壓等多種生物活性，是一種具有多種藥理作用的植物生物堿[17-20]。研究發(fā)現(xiàn)，荷葉堿可以通過(guò)抑制脂質(zhì)合成蛋白SCAP、SREBP-1c、SREBP2等和促進(jìn)脂質(zhì)分解蛋白CPT-1a、CD36、ACC、ATGL等對(duì)高脂小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積起抑制作用。荷葉堿可明顯改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量能力[21]，減少動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型或泡沫細(xì)胞模型中泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積[22]。

因此，本研究以荷葉及荷葉堿為研究對(duì)象，對(duì)荷葉品種間荷葉堿含量進(jìn)行分析，并初步探究荷葉堿對(duì)AML-12細(xì)胞的降脂作用及其機(jī)制，為荷葉的選材及相關(guān)降脂產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

荷葉于2022年7月采摘自西湖荷花栽培基地（中國(guó)，杭州），采摘25種不同品種荷葉（春曉、秋水長(zhǎng)天、金合歡、牡丹蓮、矮壽金蓮、粉玲瓏、喜相逢、牢頭紅、紅臺(tái)蓮、碧蓮、金珠落玉盤(pán)、金鳳、粉層托珠、小臺(tái)紅、女兒紅、佛座蓮、落花綣、藤壺蓮、紅石榴、念恩、逸心蓮、轉(zhuǎn)冬藥、黃匙、之江鴻運(yùn)、小水紅）；于60 ℃烘干24 h，水分烘干后粉碎過(guò)60目，得荷葉粉末，于-20 ℃保存。

AML-12細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)脂代謝實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

荷葉堿（純度≥98%），批號(hào)：H04211807002，成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈、甲醇，分析純，德國(guó)Merck公司；三乙胺，分析純，上海麥克林公司；冰醋酸，色譜純，上海麥克林公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó) Gibco公司；甘油三酯試劑盒，南京建成生物工程研究所；噻唑藍(lán)（MTT），美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），美國(guó)Sigma公司；抗體AMPK、P-AMPK和ATGL，美國(guó)Abcam公司；油紅O染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

Waters e2695型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；SK3300H超聲波表面清洗器，上?？茖?dǎo)儀器責(zé)任有限公司；MR-4100多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Dynatech公司；AxioObserverA1研究級(jí)倒置顯微鏡，德國(guó)蔡司集團(tuán)；CLASS1003111型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Tanon-6200化學(xué)發(fā)光成像儀，上海天能科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 荷葉品種間荷葉堿含量測(cè)定

1.2.1.1 荷葉堿提取液制備

經(jīng)前期單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)荷葉堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確立荷葉堿的最佳提取工藝。精確稱(chēng)取5.0 g干燥荷葉粉末，在90～100 ℃的水浴環(huán)境下，用15倍體積的水，蒸汽回流提取2次，每次60 min，合并兩次提取液，放置備用。

1.2.1.2 色譜條件

1.2 儀器與試劑 BACT/ALERT 3D全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶（BioMerieux，法國(guó)），VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（BioMerieux，法國(guó)），藥敏紙片（Oxoid，英國(guó)），5%哥倫比亞羊血瓊脂培養(yǎng)基和M-H培養(yǎng)基（迪景，廣州）。

依據(jù)中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）：色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑Inert Sustain C18（4.6 mm×1500 mm，5 μmol/L）；流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（27:70.6:1.6:0.78，V/V/V/V）；流速為1.0 mL/min；色譜柱柱溫為25 ℃；儀器進(jìn)樣量為20 μL；酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[23]，將荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成質(zhì)量濃度為3、15、30、60、90、120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，用HPLC檢測(cè)荷葉堿峰面積，HPLC圖如圖1所示。以標(biāo)準(zhǔn)溶液摩爾濃度為橫坐標(biāo)（C），以峰面積為縱坐標(biāo)（S），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：線性回歸方程為S=65652C-26483，R2=0.9992。試驗(yàn)結(jié)果表明，荷葉堿質(zhì)量濃度在3～120 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積存在良好的線性關(guān)系。為保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確可靠，可用于荷葉中荷葉堿含量的檢測(cè)。

圖1 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.1 HPLC diagram of nuciferine standard

1.2.1.4 品種間荷葉堿含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)取25種荷葉粉末5.0 g，每種3份，按照1.2.1.1的步驟制備荷葉提取液，并在1.2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，記錄各品種荷葉堿峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算出荷葉堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 荷葉堿降脂試驗(yàn)

1.2.2.1 藥液配制

將油酸溶解于氫氧化鈉溶液中，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的BSA，稀釋至摩爾濃度為3 mmol/L，得油酸鈉鹽溶液。精確稱(chēng)取2.95 mg荷葉堿，將其加入1 mL二甲基亞砜溶液中充分溶解，配制成摩爾濃度為10 mmol/L的母液，并于-40 ℃保存。

1.2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

將AML-12細(xì)胞復(fù)蘇后，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，用DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度到達(dá)70%～80%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代接板用于開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為4組：UT組（完全培養(yǎng)基）、OA組（含0.4 mmol/L油酸）、Nuci-25 μmol/L組（含0.4 mmol/L油酸和25 μmol/L荷葉堿）、Nuci-50 μmol/L組（含0.4 mmol/L油酸和50 μmol/L荷葉堿）。

1.2.2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[21]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AML-12細(xì)胞以每孔5000個(gè)均勻接種于96孔板上，待細(xì)胞貼壁后，加入DMEM/F-12培養(yǎng)基，并添加不同摩爾濃度的候選物在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中干預(yù)24 h。干預(yù)結(jié)束前4 h，在96孔板中加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)干預(yù)4 h，棄掉舊培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，待充分溶解后，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。

1.2.2.4 甘油三酯（TG）測(cè)定

按南京建成甘油三酯試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法檢測(cè)AML-12細(xì)胞內(nèi)TG含量。以蒸餾水做空白對(duì)照，取培養(yǎng)液上清離心，吸取2.5 μL上清液于96孔板中，再加入250 μL工作液，37 ℃孵育10 min，孵育完成后在酶標(biāo)儀510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。細(xì)胞蛋白濃度使用BCA試劑盒檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表示為每克細(xì)胞總蛋白中所含的甘油三酯的質(zhì)量濃度（mg/g）。

1.2.2.5 油紅O染色

按碧云天油紅O染色試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)AML-12細(xì)胞進(jìn)行固定及染色。在干預(yù)結(jié)束后，緩慢吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，接著用PBS洗滌2次，再加入4%（m/V）多聚甲醛固定液固定10 min，PBS漂洗2次，加入染色洗滌液覆蓋細(xì)胞20 s，隨后吸除染色洗滌液，加入油紅O染色工作液覆蓋細(xì)胞，37 ℃染色10 min，吸除油紅O染色工作液，再加入染色洗滌液，靜置30 s，吸去染色洗滌液后用PBS洗滌2次，再用蘇木素染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行5 min常溫復(fù)染，加入染色洗滌液清洗，最后吸除染色洗滌液，用PBS反復(fù)洗滌，在顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.2.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[24]，在處理后的AML-12細(xì)胞中，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，用BCA試劑盒檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)濃度，并將各組蛋白質(zhì)濃度調(diào)平。將樣品蛋白質(zhì)等量上樣，用10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，再低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%（m/V）脫脂奶粉的TBS-T溶液室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBS-T洗膜3次，加入二抗室溫?fù)u床孵育1 h。采用數(shù)字凝膠成像儀對(duì)拍攝圖像，通過(guò)Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 25.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 8軟件系統(tǒng)繪圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異用單項(xiàng)ANOVA比較，P＜0.05時(shí)，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種對(duì)荷葉中荷葉堿含量的影響

《中國(guó)藥典（2020版）》規(guī)定以荷葉堿含量作為荷葉藥材質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)。由表1可知25種荷葉中荷葉堿含量在0.22～0.68 mg/g之間，其中金鳳、騰壺蓮和牡丹蓮等品種中荷葉堿含量低于如佛座蓮、落花綣、逸心蓮等高荷葉堿含量品種，差異甚至可達(dá)3倍。本次研究發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地不同品種荷葉中荷葉堿含量差異明顯，這與羅栩強(qiáng)等[25]報(bào)道的不同產(chǎn)地的荷葉藥材中荷葉堿含量存在差異的研究理論相似。

表1 不同品種荷葉中荷葉堿含量表（n=3）Table 1 Results of alkaloid content in different varieties of lotus leaves (n=3)

2.2 荷葉堿及油酸對(duì)AML-12細(xì)胞活性的影響

由圖2可知，不同濃度的荷葉堿（6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）和不同濃度的油酸（50、100、200、400、800 μmol/L）處理24 h后，各組細(xì)胞活性與UT組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），即荷葉堿（6.25～100 μmol/L）和油酸（50～800 μmol/L）都沒(méi)有對(duì)AML-12細(xì)胞活性有損傷,這與Li[21]的研究結(jié)果一致。研究根據(jù)人體推薦飲荷葉茶量、荷葉的荷葉堿含量及人和小鼠給藥換算比例[26]，確定荷葉堿給藥濃度為25 μmol/L和50 μmol/L。

圖2 AML-12細(xì)胞的活力變化Fig.2 Changes in viability of AML-12 cells

2.3 荷葉堿對(duì)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響

大量研究表明，甘油三酯蓄積在高脂血癥的發(fā)病中起著重要的作用，是引起高脂血癥的主要原因。大量甘油三酯在肝臟中積累，使得肝細(xì)胞脂肪變性，肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，從而導(dǎo)致高脂血癥、肥胖、肝硬化甚至肝癌等疾病的發(fā)生[27]。為了探究荷葉堿在AML-12細(xì)胞中起降TG作用，在建立高脂模型后，用25 μmol/L和50 μmol/L的荷葉堿溶液干預(yù)作用16 h。由圖3可知，25 μmol/L和50 μmol/L荷葉堿組中TG含量分別降低了26.52%和33.17%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果表明荷葉堿能抑制AML-12細(xì)胞中的甘油三酯的蓄積情況。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量Fig.3 Intracellular triglyceride content in each group(ˉx±s, n=3)

2.4 油紅O染色結(jié)果

由圖4可知，UT組細(xì)胞沒(méi)有著色，而模型組在0.4 μmol/L油酸處理24 h后，細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)黃褐色脂滴，細(xì)胞著色明顯；荷葉堿聯(lián)合油酸共同處理后，細(xì)胞內(nèi)脂滴密度和著色均有所降低（P＜0.05），且隨著荷葉堿摩爾濃度的增加，抑制作用也越明顯。在李晨馳[28]的研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素對(duì)油酸所致的AML-12細(xì)胞脂質(zhì)蓄積有一定改善作用，油紅O染色程度隨藍(lán)莓花青素干預(yù)降低，這與本研究和汪嬌等[29]的結(jié)果相似。

圖4 荷葉堿對(duì)油酸所致的AML-12細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響（400×）Fig.4 Effect of nuciferine on oleic acid-induced lipid accumulation in AML-12 cells

2.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

采用Western blot測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果由圖5可知，AML-12細(xì)胞暴露于油酸后，AMPK的磷酸化水平明顯降低（P＜0.001），ATGL表達(dá)水平降低（P＜0.05）。在添加荷葉堿共同培養(yǎng)后，AML-12細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平顯著提高，ATGL的表達(dá)水平回升。Ma等[30]、王艷等[31]、趙丹丹等[32]的研究報(bào)道表明，AMPK能在各種代謝相關(guān)器官中不同程度的表達(dá)，并且可以被細(xì)胞壓力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和影響細(xì)胞能量代謝的物質(zhì)等條件激活，并在激活后發(fā)揮促進(jìn)炎癥、腫瘤和糖脂代謝正向調(diào)控的作用。在本次研究中觀察到，荷葉堿能抑制油酸誘導(dǎo)的P-AMPK和ATGL蛋白表達(dá)量降低，提示AMPK/ATGL信號(hào)通路參與了荷葉堿對(duì)AML-12細(xì)胞的降脂作用。

圖5 各組細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)情況Fig.5 The expression of intracellular protein in each group(ˉx±s, n=3)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)HPLC法對(duì)同一產(chǎn)地不同品種的25種荷葉所含荷葉堿含量進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)不同品種間荷葉中荷葉堿含量差異較大，同時(shí)，在建立AML-12細(xì)胞脂質(zhì)蓄積模型后，發(fā)現(xiàn)荷葉堿對(duì)油酸誘導(dǎo)的AML-12細(xì)胞脂質(zhì)蓄積存在一定抑制作用，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，這可能是通過(guò)激活A(yù)ML-12細(xì)胞內(nèi)AMPK/ATGL通路，調(diào)節(jié)胞體能量代謝平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究為荷葉相關(guān)產(chǎn)品的選材和開(kāi)發(fā)利用提供參考，也為治療高脂血癥提供一個(gè)潛在的可能性藥物。