張亞勤,楊 涵,龍丹丹,陳怡穎,王金鳳,喬 宇,戴歡歡,蘇 洪△

(普洱市人民醫(yī)院:1.生殖遺傳中心;2.眼科,云南 普洱 665000)

耳聾的發(fā)生與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān),約60%的耳聾患者是由遺傳因素引起。在遺傳性耳聾中,約80%為非綜合征型耳聾(NSHL)。GJB2基因突變是NSHL的致病因素之一,其是最常見(jiàn)的耳聾基因。在GJB2基因中,目前在耳聾基因網(wǎng)站(https://deafnessvariationdatabase.org)已經(jīng)更新300多種與聽(tīng)力損傷相關(guān)的致病性突變。GJB2基因的突變具有種族和地域特征,其突變種類(lèi)多,且仍有新的突變?cè)诓粩啾话l(fā)現(xiàn)。

云南普洱地區(qū)由于具有眾多的少數(shù)民族,而且較多少數(shù)民族世居于此,因此具有獨(dú)特的民族特點(diǎn)和地域特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)的耳聾研究數(shù)據(jù)大多來(lái)自?xún)?nèi)地漢族人群,云南少數(shù)民族地區(qū)的研究數(shù)據(jù)較少。本研究通過(guò)分析云南普洱地區(qū)新生兒GJB2基因突變情況,旨在豐富本地區(qū)耳聾基因數(shù)據(jù),為區(qū)域化開(kāi)展耳聾基因檢測(cè)、遺傳咨詢(xún)及預(yù)防干預(yù)提供重要信息。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2021年6月至2023年2月在普洱市人民醫(yī)院產(chǎn)科出生的799例新生兒為研究對(duì)象,收集其足跟血樣本,采用聚合酶鏈反應(yīng)-堿基序列直接測(cè)序方法檢測(cè)GJB2基因編碼區(qū),分析該區(qū)域基因多態(tài)性分布情況。本研究由普洱市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可,所有參與該研究的新生兒家屬均簽署了知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑 DNA提取試劑盒采用北京天根生化科技有限公司的干血斑基因組DNA提取試劑盒(DP334);聚合酶鏈反應(yīng)主要采用TaKaRa公司的 Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)試劑(RR902A),使用儀器為AB veriti DX梯度擴(kuò)增儀;堿基序列直接測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司完成,使用儀器為AB 3730XL型基因分析儀。

1.2.2基因組DNA提取 由護(hù)士按照新生兒足跟血采集規(guī)范采集新生兒足跟血,制成4個(gè)血斑濾紙并晾干,保存于-20 ℃冰箱。檢測(cè)時(shí),用血片打孔器將血斑打孔得到3 mm直徑的干燥血斑5～10片,用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3檢測(cè)方法 GJB2基因的編碼區(qū)位于2號(hào)外顯子,實(shí)驗(yàn)所用上游引物序列為5′-TCTTTTCCAGAGCAAACCGC-3′,下游引物序列為5′-TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段為776 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋全部編碼區(qū)。聚合酶鏈反應(yīng)體系為25 μL,其中2×mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板DNA約50 ng,剩余體積用超純水補(bǔ)齊。聚合酶鏈反應(yīng)在AB veriti DX儀器上進(jìn)行,擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共32個(gè)循環(huán);72 ℃充分延伸7 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進(jìn)行DNA測(cè)序,用DNAstar分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,與NCBI網(wǎng)站下載的GJB2基因序列(NC_000013.11)進(jìn)行比對(duì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)所得數(shù)據(jù)采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算GJB2基因突變分布,以及各基因多態(tài)性的基因型頻率與等位基因頻率。采用Arlerquin3.11遺傳統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)GJB2的基因分布進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡分析,計(jì)算等位基因單倍型頻率,并對(duì)各基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用Arlerquin3.11軟件對(duì)799例研究對(duì)象進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn),各基因位點(diǎn)的基因頻率觀察值與期望值之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明本研究納入的研究對(duì)象來(lái)自同一遺傳學(xué)群體,符合Hardy-Weinberg平衡,反映本研究群體的代表性良好。見(jiàn)表1。

表1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

2.2GJB2基因多態(tài)性分布檢測(cè)結(jié)果 在799例新生兒樣本的測(cè)序結(jié)果中,共檢測(cè)到12種GJB2基因多態(tài)性結(jié)果,其中以c.79G>A、c.341A>G、c.109G>A、c.608T>C 4種基因多態(tài)性的突變頻率較高,分別為46.06%、36.30%、13.89%、4.51%。其他8種基因多態(tài)性的突變頻率較低,均不足1.00%。在799例新生兒樣本中,有486例檢測(cè)到GJB2基因突變,總突變率為60.83%,見(jiàn)表2。在檢出的12種基因多態(tài)性中,c.109G>A、c.299-300delAT、c.235delC、c.512insAACG是致病性基因突變,檢出這4種基因突變的樣本共114例,突變率為14.27%,見(jiàn)表3。

表2 GJB2基因多態(tài)性分布情況

表3 GJB2基因致病性突變頻率(n=799)

2.3各基因多態(tài)性的基因型頻率與等位基因頻率 檢出的12個(gè)GJB2基因多態(tài)性位點(diǎn),均只檢出2種等位基因。在突變頻率較高的4個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)中,c.79G>A位點(diǎn)的GG基因型頻率為53.94%,GA基因型頻率為38.42%,AA基因型頻率為7.63%,等位基因G頻率為73.03%,等位基因A頻率為26.97%。c.341A>G位點(diǎn)的AA基因型頻率為63.70%,AG基因型頻率為32.17%,GG基因型頻率為4.13%,等位基因A頻率為79.66%,等位基因G頻率為20.34%。c.109G>A位點(diǎn)的GG基因型頻率為86.11%,GA基因型頻率為12.89%,AA基因型頻率為1.00%,等位基因G頻率為92.62%,等位基因A頻率為7.38%。c.608T>C位點(diǎn)的TT基因型頻率為95.49%,TC基因型頻率為4.38%,CC基因型頻率為0.13%,等位基因T頻率為97.43%,等位基因C頻率為2.57%。見(jiàn)表4。

表4 GJB2基因多態(tài)性的基因型頻率與等位基因頻率(n=799)

2.4單倍型頻率分析 799例新生兒樣本中,以表3中基因多態(tài)性位點(diǎn)順序排列,經(jīng)Arlerquin3.11軟件分析,共存在12個(gè)GJB2基因多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型22種,其中單倍型頻率大于0.1%的有12種,單倍型頻率大于1.0%的有6種,這6種分別為GGAWWTCTWCCC、AGGWWTCTWCCC、AGAWWTCTWCCC、GAAWWTCTWCCC、GGAWWCCTWCCC、AAGWWTCTWCCC,其單倍型頻率分別為65.08%、18.27%、6.13%、5.82%、1.38%、1.06%。見(jiàn)表5。

表5 GJB2基因12個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型分布情況(n=1 598)

2.5連鎖不平衡分析結(jié)果 采用Arlerquin3.11軟件對(duì)本研究檢測(cè)出的12個(gè)GJB2基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)c.79G>A與c.341A>G兩位點(diǎn)存在顯著連鎖不平衡(D′=0.987 4,r2=0.674 0)。

3 討 論

在我國(guó),GJB2、SLC26A4 和GJB3 基因是最常見(jiàn)的耳聾基因,占遺傳性耳聾基因的 70%～80%,其中 GJB2 基因占比55%[1]。據(jù)研究報(bào)道,新生兒中聽(tīng)力損傷的患病率約為 1.8/1 000,到5歲時(shí),這一比率將達(dá)到約2.7/1 000[2]。我國(guó)的新生兒聽(tīng)力篩查目前已經(jīng)比較普遍,這一舉措使很多先天性聽(tīng)力損傷的患兒可以更早被發(fā)現(xiàn),并早期實(shí)施干預(yù),從而對(duì)其后續(xù)的語(yǔ)言和認(rèn)知發(fā)展都起到了良好的作用。但是,目前的篩查方案尚不能完全滿(mǎn)足早期發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾、藥物性耳聾等需求,而耳聾基因的篩查可以有效補(bǔ)充目前的方案。所以,如果將傳統(tǒng)的新生兒聽(tīng)力篩查方案結(jié)合耳聾基因篩查,可以更有效地對(duì)耳聾實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)與干預(yù),更進(jìn)一步地降低耳聾發(fā)生率。

由于耳聾基因種類(lèi)較多,其基因組異質(zhì)性程度也較高,在不同地區(qū)和不同民族的研究中,耳聾基因的數(shù)據(jù)存在較大的差異。如果要廣泛地對(duì)新生兒進(jìn)行較全面的耳聾基因篩查,社會(huì)投入的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將較重,因此,對(duì)不同的地區(qū),甚至不同的民族進(jìn)行更詳細(xì)的耳聾基因數(shù)據(jù)分析,可以更加針對(duì)性地設(shè)計(jì)本地化新生兒耳聾篩查方案,不僅可以有效實(shí)現(xiàn)耳聾早期篩查與干預(yù)的目的,而且能夠有效降低篩查費(fèi)用。

云南普洱地區(qū)地處中國(guó)西南邊境,具有少數(shù)民族眾多的特點(diǎn),少數(shù)民族人口占總?cè)丝诘?1%,這與我國(guó)其他地區(qū)漢族人口占大多數(shù)的特點(diǎn)明顯不同。為了明確本地區(qū)耳聾基因分布,本研究組隨機(jī)收集了本地區(qū)799例新生兒樣本,首先對(duì)GJB2基因進(jìn)行了編碼區(qū)測(cè)序,以期為耳聾基因篩查本地化提供更有意義的數(shù)據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在799例普洱地區(qū)新生兒中,GJB2基因突變總攜帶率為60.83%,其中,包括c.109G>A突變位點(diǎn)在內(nèi)的致病性基因突變率為14.27%。由于國(guó)內(nèi)目前主要使用熱點(diǎn)檢測(cè)的方法進(jìn)行新生兒耳聾基因檢測(cè),而這些熱點(diǎn)中目前普遍不包含c.109G>A突變位點(diǎn)。為了與其他地區(qū)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),研究組統(tǒng)計(jì)了不包括c.109G>A突變?cè)趦?nèi)的GJB2致病性基因突變率為0.50%。經(jīng)調(diào)查,各地區(qū)的新生兒耳聾基因篩查結(jié)果中,GJB2熱點(diǎn)突變率大多在1%～3%,如邱小兵等[3]報(bào)道贛南地區(qū)為2.04%,張秀秀等[4]報(bào)道黔西南地區(qū)為1.60%,陳愛(ài)玲等[5]報(bào)道無(wú)錫市為2.84%,李茜等[6]報(bào)道揚(yáng)州地區(qū)為3.03%,唐佳等[7]報(bào)道廣東江門(mén)地區(qū)為1.80%,高儒真等[8]報(bào)道北京協(xié)和醫(yī)院為2.5%,范霞林等[9]報(bào)道海南省為1.56%,趙娟萍等[10]報(bào)道銀川市為2.11%。本研究發(fā)現(xiàn),云南普洱地區(qū)新生兒GJB2致病基因0.50%的突變率明顯低于其他各地區(qū)報(bào)道的突變率。這可能是GJB2基因在不同地區(qū)、不同民族中遺傳基因差異性分布的體現(xiàn)。下一步,研究組將進(jìn)一步擴(kuò)大研究數(shù)據(jù),將各民族基因數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,明確云南普洱地區(qū)新生兒耳聾基因突變率與其他各地差異的原因。

對(duì)于c.109G>A突變,本研究發(fā)現(xiàn)其在普洱地區(qū)新生兒中攜帶率較高,達(dá)13.89%。c.109G>A突變最初被確定為雜合子對(duì)照中的多態(tài)性[11],后來(lái)發(fā)現(xiàn)在聽(tīng)力受累個(gè)體中為純合子或與已知的致病性 GJB2 變異體反式[12-13]。然而,隨著研究發(fā)現(xiàn),這些變異的一些純合子似乎聽(tīng)力正常[14-15],人們又提出了外顯率降低來(lái)解釋這種不一致性[16]。本研究發(fā)現(xiàn),既往關(guān)于GJB2基因c.109G>A是否致耳聾存在較大爭(zhēng)議,但近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),c.109G>A突變與遲發(fā)性聽(tīng)力損失關(guān)系密切[17-19]。但是由于這個(gè)位點(diǎn)在人群中攜帶率很高,大家對(duì)其爭(zhēng)議一直存在。為解釋爭(zhēng)議,ClinGen聽(tīng)力損失專(zhuān)家小組收集已經(jīng)發(fā)表的相關(guān)數(shù)據(jù),進(jìn)行了大量病例對(duì)照研究,對(duì)c.109G>A突變形成了共識(shí),并做出了解釋,認(rèn)為與對(duì)照人群相比,該位點(diǎn)在聽(tīng)力損失患者中顯著過(guò)高[20]。目前在ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)將該突變更新為非綜合征性遺傳性聽(tīng)力損失相關(guān)的致病性變異。LIN等[21]對(duì)1 517例NSHL患者進(jìn)行了GJB2突變譜的研究,發(fā)現(xiàn)c.109G>A位點(diǎn)雜合突變的聽(tīng)力比純合突變更差。

巫朝霞等[19]建議,將GJB2基因c.109G>A位點(diǎn)納入人群針對(duì)性的耳聾基因檢測(cè),將其作為早期分子標(biāo)識(shí)在新生兒中進(jìn)行普遍性篩查,結(jié)合后期聽(tīng)力跟蹤隨訪(fǎng)以提高遲發(fā)性耳聾及輕中度耳聾的早期發(fā)現(xiàn)率和干預(yù)率。本研究組也認(rèn)為,可以將c.109G>A位點(diǎn)作為耳聾基因檢測(cè)熱點(diǎn),輔助臨床對(duì)遲發(fā)性聽(tīng)力損失的預(yù)測(cè)與診斷,而臨床也應(yīng)重視并加強(qiáng)對(duì)c.109G>A突變的認(rèn)識(shí),進(jìn)一步補(bǔ)充耳聾基因的遺傳咨詢(xún)內(nèi)容。

除c.109G>A位點(diǎn)外,本研究發(fā)現(xiàn)的其他致病性基因突變是c.235delC、c.299-300delAT、c.512insAACG。經(jīng)調(diào)查,目前市場(chǎng)上一些耳聾基因檢測(cè)的試劑盒中,還沒(méi)有將c.512insAACG位點(diǎn)納入檢測(cè)范圍,這將會(huì)造成一定概率的致病基因漏檢。對(duì)此本研究組建議臨床應(yīng)針對(duì)性擴(kuò)大耳聾基因的檢測(cè)范圍。劉暢等[22]根據(jù)廣東省耳聾疾病診療的基本情況,綜合考慮各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的檢測(cè)效力、檢測(cè)時(shí)間與檢測(cè)成本,設(shè)計(jì)了一套適合廣東地區(qū)實(shí)際情況的聾病階梯式基因診斷策略。該研究從經(jīng)濟(jì)與臨床需求角度探討了實(shí)施階梯式耳聾基因診斷策略的可能性。本課題組認(rèn)為,其他地區(qū)也可以結(jié)合本地需求,對(duì)這種策略進(jìn)行探討及實(shí)踐嘗試。

本研究?jī)H針對(duì)云南普洱地區(qū)新生兒GJB2基因進(jìn)行了檢測(cè)分析,而對(duì)其他常見(jiàn)的耳聾基因,如GJB3、SLC26A4及線(xiàn)粒體DNA 12S rRNA基因等還未進(jìn)行分析。接下來(lái)將持續(xù)擴(kuò)大樣本量,進(jìn)行更完善的耳聾基因檢測(cè)分析,以期進(jìn)一步明確本地區(qū)耳聾基因分布,為臨床早期發(fā)現(xiàn)預(yù)防及遺傳咨詢(xún)提供更多數(shù)據(jù)支持。