譚艷美,陳三俊,譚玉林,吳 智,蒙國(guó)照,譚艷飛

(1.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 郴州 423000;2.湘南學(xué)院生物醫(yī)藥微生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 郴州 4230003.郴州市第一人民醫(yī)院疼痛科,湖南 郴州 423000;4.郴州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌糖尿病科,湖南 郴州 423000)

脂噬是一種選擇性的自噬進(jìn)程,能有效識(shí)別并調(diào)控脂質(zhì)代謝,選擇性地將脂滴包裹在細(xì)胞溶酶體中,脂滴在溶酶體中被酸性脂肪酶降解后送至細(xì)胞外的高密度脂蛋白(HDL)中,進(jìn)而促進(jìn)膽固醇流出,維持脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn),脂噬減弱會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展[3],也就是說(shuō),AS的發(fā)生很有可能與細(xì)胞內(nèi)脂噬的減弱有關(guān)。

圍脂滴蛋白(perilipin2,PLIN2)是PAT家族中的成員之一,在AS發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用。有研究證明,PLIN2也可通過(guò)激活自噬和刺激膽固醇的外流影響人類對(duì)AS的易感性[4],同時(shí)在PLIN2缺陷的心肌細(xì)胞中,脂噬減弱引起細(xì)胞內(nèi)甘油三酯蓄積[5]。

脂質(zhì)的異常蓄積是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此研究脂質(zhì)蓄積的機(jī)制對(duì)防治AS具有重要意義。結(jié)合課題組前期對(duì)PLIN2在AS發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究,本研究擬探討PLIN2在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中是否有抑制脂噬的作用,以期為AS的防治和機(jī)制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù);DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco,8122691);特級(jí)胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司,164210);oxLDL(廣州奕元生物技術(shù)有限公司,YB-002);油紅O(Sigma,SHBL1039);LC3A/B兔mAb(Cell Signaing Technology,12741);SQSTM1/p62 抗體(Cell Signaing Technology,5114);兔PLIN2的單克隆(Abcam,ab108323);GAPDH多克隆抗體(Proteintech,10494-1-AP);辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)親和純山羊抗兔IgG(proteintech,SA00001-2);特超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Beyotime,P0018AM);LipofectamineTM3000(Thermo Fisher,L3000001);si-musPLIN2(HonorGene)。

1.2方法

1.2.1泡沫細(xì)胞模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于6孔板中,每孔含完全培養(yǎng)基2 mL,加入終濃度為100 μg/mL的ox-LDL處理12、24、48 h,油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。

1.2.2小干擾RNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)查找鼠源 PLIN2蛋白編碼區(qū)序列,設(shè)計(jì)合成小干擾 RNA,具體序列為正義鏈:5′-GUUCAGAAGCCGAGCAACUAU-3′;反義鏈5′-AUAGUUGCUCGGCUUCUGAAC-3′。

轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種至培養(yǎng)板中,預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯片達(dá)到70%～90%。轉(zhuǎn)染時(shí),按說(shuō)明書先用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM3000和siRNA,充分混勻,再在每管已稀釋的LipofectamineTM3000試劑中按1∶1比例加入稀釋的siRNA,室溫孵育10～15 min,最后將siRNA-脂質(zhì)復(fù)合物加入細(xì)胞中,孵育2～4 d,分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.3分組 為研究PLIN2敲減后ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)脂噬基因的變化情況,將細(xì)胞分為5組,分別為對(duì)照組、空質(zhì)粒組、ox-LDL處理組、siPLIN2組和siPLIN2+ox-LDL處理組。

1.2.4油紅O染色 避光條件下配備油紅O工作液,去離子水與油紅O儲(chǔ)備液比例為2∶3,混勻后用0.2 μm濾膜過(guò)濾3次備用。將已做處理的12孔板取出,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,每次10 min,每孔加入4%多聚甲醛1 mL固定細(xì)胞30 min,固定完畢,PBS洗滌3次。每孔加入1 mL油紅O工作液染色30 min,顯微鏡下觀察細(xì)胞脂滴染色情況,PBS洗滌3次。每孔加入蘇木素1 mL染核5 s,PBS洗滌3次,顯微鏡觀察染核情況。載玻片滴適量甘油,取出孔板中蓋玻片,待表面液體蒸發(fā)將其覆于甘油上,封片保存拍照。

1.2.5Western blot 細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,稀釋后的一抗(PLIN2、LC3、p62、GAPDH)孵育,4 ℃過(guò)夜,TBST洗膜3次,每次10 min,HRP標(biāo)記二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,采用ECL試劑盒顯影。

2 結(jié) 果

2.1泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建 隨著ox-LDL處理時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒逐漸增加,處理12 h脂質(zhì)顆粒少量增加,處理24 h脂質(zhì)顆粒增加明顯,處理48 h脂質(zhì)顆粒相對(duì)24 h時(shí)略多,但細(xì)胞形態(tài)也變得不規(guī)則,提示ox-LDL處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)改變細(xì)胞形態(tài),后續(xù)泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建實(shí)驗(yàn)選擇100 μg/mL的oxLDL處理24 h。見圖1。

注:A.無(wú)ox-LDL處理;B.ox-LDL處理12 h;C.ox-LDL處理24 h;D.ox-LDL處理48 h。

2.2泡沫細(xì)胞內(nèi)PLIN2和脂噬相關(guān)基因表達(dá)情況 PLIN2在ox-LDL處理的細(xì)胞內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)蛋白含量逐漸增加,48 h增加顯著。LC3在泡沫細(xì)胞中隨著脂質(zhì)增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),48 h達(dá)到高峰;而p62蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比是下降的,在ox-LDL處理24 h時(shí)降至最低,48 h略有增加。見圖2。也就是說(shuō),隨著泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的增多,PLIN2和LC3在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)量也是增加的,而p62則呈先下降后增加的趨勢(shì),提示脂噬在泡沫細(xì)胞形成時(shí)隨著細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積增多是先增強(qiáng)后減弱的。

注:1為對(duì)照組;2為ox-LDL處理12 h;3為ox-LDL處理24 h;4為ox-LDL處理48 h。與對(duì)照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

2.3轉(zhuǎn)染 按步驟轉(zhuǎn)染siPLIN2后48 h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PLIN2蛋白含量,當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為30 pmol/μL時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高,達(dá)到60%以上;當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為20 pmol/μL和50 pmol/μL時(shí),轉(zhuǎn)染效率在50%以下,見圖3。說(shuō)明轉(zhuǎn)染濃度為30 pmol/μL時(shí),PLIN2基因在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)沉默效果最佳。

注:1為對(duì)照組;2為20 pmol/μL(siPLIN2);3為30 pmol/μL(siPLIN2);4為50 pmol/μL(siPLIN2)。與對(duì)照組比較,aP<0.01,bP<0.001。

2.4沉默PLIN2脂噬相關(guān)基因變化 PLIN2基因敲除的巨噬細(xì)胞內(nèi)LC3的蛋白表達(dá)量明顯降低,但在PLIN2基因敲除的泡沫細(xì)胞內(nèi)LC3并沒有明顯的變化。然而,p62在PLIN2敲除的巨噬細(xì)胞內(nèi)沒有明顯變化,但在PLIN2敲除的泡沫細(xì)胞內(nèi)卻有明顯的升高,見圖4。說(shuō)明PLIN2影響了泡沫細(xì)胞內(nèi)脂噬基因p62的表達(dá)。

注:1為對(duì)照組;2為空質(zhì)粒組;3為ox-LDL處理組;4為siPLIN2處理組;5為siPLIN2+ox-LDL處理組。與對(duì)照組比較,aP<0.05;與空質(zhì)粒組比較,bP<0.05;與ox-LDL處理組比較,cP<0.05。

3 討 論

近年來(lái),自噬在AS發(fā)生發(fā)展中的作用得到了廣泛的關(guān)注,有研究表明,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬可延緩AS斑塊的形成,進(jìn)而治療相關(guān)疾病[6]。那么,脂噬作為一種特殊類型的選擇性自噬,可在細(xì)胞內(nèi)選擇性降解脂滴維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡,而且當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的脂噬不足或過(guò)度脂噬時(shí)都會(huì)引起機(jī)體脂代謝紊亂導(dǎo)致疾病的發(fā)生[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道,在AS保護(hù)作用中脂噬在巨噬細(xì)胞自噬中發(fā)揮了重要作用[8],體內(nèi)和體外選擇性激活和追蹤脂噬,充分了解AS中的脂噬機(jī)制,確定巨脂噬和微脂噬在AS脂代謝中的作用,發(fā)現(xiàn)脂噬在治療AS相關(guān)疾病的治療潛力是研究者的目的[9]。本研究以PLIN2與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的關(guān)系為切入點(diǎn),初步探討PLIN2在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞脂噬中的作用,為發(fā)現(xiàn)脂噬在AS中的治療潛力提供依據(jù)。

PLIN2是JIANG等[10]在1992年利用差別雜交篩選技術(shù)在脂肪細(xì)胞中分離提取到的一種蛋白,后來(lái)發(fā)現(xiàn)其與脂肪代謝密切相關(guān),不僅促使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積,還抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流,有學(xué)者將PLIN2認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的標(biāo)志物[11]。有研究表明,PLIN2在AS發(fā)展進(jìn)程中一方面可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生;另一方面其也可加速泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積[12-13]。近年有文獻(xiàn)報(bào)道,在心肌細(xì)胞中PLIN2缺乏會(huì)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)脂噬,從而引起心肌細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[4],說(shuō)明PLIN2與細(xì)胞內(nèi)脂噬有關(guān),那么在AS的泡沫細(xì)胞脂噬中PLIN2是否也發(fā)揮了作用。本研究表明,在ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞中,脂噬相關(guān)蛋白LC3的蛋白表達(dá)量會(huì)隨著胞內(nèi)脂質(zhì)的增加而增加,此趨勢(shì)與PLIN2蛋白表達(dá)量變化是一致的,而脂噬相關(guān)蛋白p62則隨著脂質(zhì)的增多呈先下降后增加的趨勢(shì),與LC3相反,表明在ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中脂噬是先增強(qiáng)后減弱的,這與鄭舒展等[14]發(fā)現(xiàn)的ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成24 h內(nèi),LC3比值升高、p62水平降低、脂噬增強(qiáng),24 h后LC3比值降低、p62水平升高、脂噬減弱存在一致性。

另外,本研究還發(fā)現(xiàn),在RAW264.7巨噬細(xì)胞中敲除PLIN2后LC3蛋白表達(dá)量降低,提示PLIN2可能有影響LC3表達(dá)的作用。有文獻(xiàn)提示,在PLIN2缺乏的心肌細(xì)胞中溶酶體和脂滴共定位減少,脂噬減弱[4],這與本研究中PLIN2敲除后LC3蛋白表達(dá)量下降的結(jié)果一致,說(shuō)明PLIN2有調(diào)控脂噬的作用。

同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),在ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7泡沫細(xì)胞中敲除PLIN2后LC3蛋白表達(dá)量變化不明顯,但p62蛋白表達(dá)量增加,提示PLIN2在泡沫細(xì)胞脂噬中有下調(diào)p62蛋白表達(dá),增強(qiáng)脂噬的作用。而有文獻(xiàn)報(bào)道,白藜蘆醇可通過(guò)上調(diào)人脂肪變性HHL-5細(xì)胞的PLIN2表達(dá),促進(jìn)脂噬相關(guān)分子LC3β和Rab7的表達(dá),從而增強(qiáng)脂噬緩解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[15],與本研究中泡沫細(xì)胞內(nèi)PLIN2增強(qiáng)脂噬的結(jié)果一致。但是,PLIN2調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞內(nèi)脂噬的機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究證明了在RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)PLIN2有調(diào)控脂噬的作用,在ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中,脂噬隨著細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)增加先增強(qiáng)后減弱,同時(shí),在PLIN2敲除的泡沫細(xì)胞內(nèi),p62蛋白表達(dá)量明顯增加,脂噬減弱。在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,泡沫細(xì)胞的形成是重要的一環(huán),若能通過(guò)增強(qiáng)脂噬,延緩泡沫細(xì)胞和AS斑塊的形成速度,那么在治療冠心病、腦血管疾病和糖尿病等AS相關(guān)疾病的方法和手段上便可以提供更多的可能。