鄧雙年，李娟，李輝

1 臨汾市人民醫(yī)院腫瘤科，山西 臨汾 041000；2 臨汾市人民醫(yī)院消化科；3 臨汾市人民醫(yī)院胸外科

胃癌發(fā)病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，確診時(shí)多進(jìn)展為晚期。該病通常以手術(shù)治療為主，但術(shù)后腫瘤仍有較高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，預(yù)后極差，對(duì)患者的生活質(zhì)量影響較大［1］。安羅替尼是一種口服多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)多種與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接抑制，同時(shí)安羅替尼還具有抗腫瘤血管生成的作用［2-4］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）/Smads 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等生理過(guò)程密切相關(guān)［5］。研究表明Smad7 可抑制TGF-β1對(duì)Smad3 的磷酸化，對(duì)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用［6］。目前安羅替尼通過(guò)TGF-β1/Smads信號(hào)通路作用胃癌的機(jī)制尚不完全明確。2020 年5月—2022 年5 月，我們探討了安羅替尼對(duì)胃癌細(xì)胞AGS遷移和侵襲的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌AGS 細(xì)胞，購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。安羅替尼（貨號(hào)：S8726，美國(guó)Selleckchem 公司），TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761（貨號(hào)：S49933，上海源葉生物科技有限公司），胎牛血清（貨號(hào)：110.11-8611，上海四季青生物科技有限公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基（貨號(hào)：C11875500BT，美國(guó)Gibco公司），RIPA 裂解液（貨號(hào)：P0013B，上海碧云天生物科技有限公司），活細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）試劑盒（貨號(hào)：A311-01，南京諾唯贊生物科技有限公司），鼠抗人［TGF-β1（貨號(hào)：MAB1835，美國(guó)RD 公司）、p-Smad3（貨號(hào)：HK3086，美國(guó)CST 公司），Smad3、Smad7、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖維黏連蛋白（FN）及β-actin 一抗（貨號(hào)分別為66516、66478、60335-1、66219-1、60330-1、66042-1，武漢三鷹生物科技有限公司）］、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗）（貨號(hào)：SA00001-1，武漢三鷹生物科技有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO18AIC，日本三洋電機(jī)公司），倒置熒光顯微鏡（MF52-N，廣州市明美光電技術(shù)有限公司），酶標(biāo)儀（IMARK，美國(guó)BIO-RAD 公司），凝膠成像系統(tǒng)（FluorChem HD2，美國(guó)Proteinsimple公司）等。

1.2 人胃癌AGS 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 于液氮中取胃癌AGS凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，37 ℃、5% CO2條件下在RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁至80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AGS細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 將細(xì)胞分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和抑制劑組，對(duì)照組細(xì)胞不干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組（2 μmol/L安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組）分別給予2、4、8 μmol/L 安羅替尼。本研究中從4 μmol/L 安羅替尼組開始細(xì)胞活力與對(duì)照組相比降低，為避免細(xì)胞死亡太多干擾實(shí)驗(yàn)，抑制劑組選擇在4 μmol/L 安羅替尼基礎(chǔ)上加入10 μmol/L TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761 進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，后置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 人胃癌AGS 細(xì)胞活力的測(cè)定 采用CCK-8法。細(xì)胞分組與給藥方法同1.3，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，調(diào)整密度至2×105/mL，將其接種到96孔板中，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。各組干預(yù)24 h 后，加入CCK-8 溶液10 μL 孵育2 h 后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組OD 值（450 nm），每組檢測(cè)3次。細(xì)胞活力（%）=OD（實(shí)驗(yàn)組或抑制劑組-空白組）/OD（對(duì)照組-空白組）×100%。

1.5 人胃癌AGS 細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞分組與給藥方法同1.3，取各組干預(yù)24 h 的AGS 細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

1.6 人胃癌AGS 細(xì)胞的遷移和侵襲能力測(cè)定 采用Transwell 小室法。細(xì)胞分組與給藥方法同1.3，取Transwell 小室，在上室中加入無(wú)血清細(xì)胞懸液0.25 mL，調(diào)整密度為1×105/mL，下室加入0.45 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h后，棄上清，PBS清洗3 次，用4%甲醇固定30 min 后進(jìn)行晾干處理，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗3次，在細(xì)胞侵襲能力分析實(shí)驗(yàn)時(shí)，小室用基質(zhì)膠預(yù)處理，其他步驟相同。將Transwell小室倒置于顯微鏡上，每孔隨機(jī)選5個(gè)不同區(qū)域，用顯微鏡觀察拍照。每孔隨機(jī)選5 個(gè)不同區(qū)域。Image J圖像分析軟件計(jì)算遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 人胃癌AGS 細(xì)胞中EMT 和TGF-β1/Smads 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞分組與給藥方法同1.3，干預(yù)24 h 時(shí)，收集各組細(xì)胞，提取蛋白后定量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h 后參照抗體說(shuō)明書加入一定稀釋比例的一抗（TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad7、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN 及β-actin），4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST 洗滌后加入山羊抗鼠IgG 二抗，孵育2 h，洗滌3 次，最后加入顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。蛋白灰度值用G 表示，蛋白相對(duì)表達(dá)量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白（β-actin）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人胃癌AGS 細(xì)胞活力比較 干預(yù)24 h后，對(duì)照組、2 μmol/L 安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組、抑制劑組細(xì)胞活力分別為1.00 ± 0.07、0.89 ± 0.04、0.76 ± 0.06、0.60 ±0.08、0.52 ± 0.02。與對(duì)照組相比，2 μmol/L安羅替尼組AGS 細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；4、8 μmol/L 安羅替尼組細(xì)胞活力降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）。本研究中4、8 μmol/L 安羅替尼組細(xì)胞活力與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），為避免細(xì)胞死亡太多干擾實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取安羅替尼4 μmol/L作為最適濃度加入10 μmol/L TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761 作為抑制劑組進(jìn)行干預(yù)。與4 μmol/L 安羅替尼組相比，抑制劑組細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。

2.2 各組人胃癌AGS 細(xì)胞生長(zhǎng)情況 人胃癌AGS細(xì)胞處理24 h后，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)組和抑制劑組細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，貼壁能力下降，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形狀變?yōu)椴灰?guī)則狀態(tài)且細(xì)胞碎片增多。見(jiàn)圖1。

圖1 各組AGS細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.3 各組人胃癌AGS 細(xì)胞遷移能力比較 干預(yù)24h 后，對(duì)照組、2 μmol/L 安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組、抑制劑組細(xì)胞遷移數(shù)分別為（220.67 ± 27.50）、（166.67 ± 15.01）、（110.33 ± 16.62）、（88.33 ± 16.04）、（28.33 ±7.02）個(gè)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與4 μmol/L 安羅替尼組相比，抑制劑組細(xì)胞遷移數(shù)進(jìn)一步降低（P＜0.05）。

2.4 各組人胃癌AGS細(xì)胞侵襲能力比較 干預(yù)24 h后，對(duì)照組、2 μmol/L 安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組、抑制劑組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（215.00 ± 26.51）、（160.00 ± 18.52）、（107.33 ± 17.04）、（87.33 ± 9.45）、（26.33 ± 6.66）個(gè)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組侵襲數(shù)降低（P＜0.05），呈劑量依賴性；與4 μmol/L 安羅替尼組相比，抑制劑組細(xì)胞侵襲數(shù)進(jìn)一步降低（P＜0.05）。

2.5 各組人胃癌AGS 細(xì)胞中EMT 相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組AGS細(xì)胞中EMT相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較（± s）

表1 各組AGS細(xì)胞中EMT相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與4 μmol/L安羅替尼組相比，#P＜0.05。

組別對(duì)照組2 μmol/L安羅替尼組4 μmol/L安羅替尼組8 μmol/L安羅替尼組抑制劑組E-cadherin 0.30 ± 0.01 0.80 ± 0.02*1.20 ± 0.07*1.40 ± 0.03*1.42 ± 0.05#N-cadherin 1.50 ± 0.04 1.20 ± 0.07*1.12 ± 0.05*0.81 ± 0.03*0.70 ± 0.01#Vimentin 1.33 ± 0.05 1.20 ± 0.04*1.10 ± 0.05*0.51 ± 0.03*0.10 ± 0.01#FN 0.90 ± 0.02 0.50 ± 0.03*0.40 ± 0.02*0.20 ± 0.01*0.05 ± 0.01#

2.6 各組人胃癌AGS細(xì)胞中TGF-β1/Smads信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 各組AGS細(xì)胞中TGF-β1/Smads信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（± s）

表2 各組AGS細(xì)胞中TGF-β1/Smads信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與4 μmol/L安羅替尼組相比，#P＜0.05。

組別對(duì)照組2 μmol/L安羅替尼組4 μmol/L安羅替尼組8 μmol/L安羅替尼組抑制劑組TGF-β1 1.30 ± 0.08 1.10 ± 0.06*0.90 ± 0.07*0.20 ± 0.04*0.10 ± 0.02#Smad3 1.00 ± 0.09 1.01 ± 0.08 1.02 ± 0.05 1.04 ± 0.06 1.03 ± 0.05 p-Smad3 1.20 ± 0.02 1.02 ± 0.07*0.90 ± 0.05*0.35 ± 0.04*0.21 ± 0.04#Smad7 0.91 ± 0.03 1.04 ± 0.07*1.10 ± 0.07*1.31 ± 0.05*1.51 ± 0.06#

3 討論

胃病發(fā)病原因主要有不良飲食習(xí)慣與飲食結(jié)構(gòu)、慢性幽門螺旋桿菌感染等［7］。早、中期的胃癌可以通過(guò)手術(shù)治療加之以放、化療，提高患者生存率，但多半患者就診時(shí)已發(fā)展為晚期，通過(guò)手術(shù)較難根治。研發(fā)更具安全性與療效藥物來(lái)抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是胃癌治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［8］。近年來(lái)諸多學(xué)者對(duì)安羅替尼進(jìn)行的研究表明，其不僅能抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)其他腫瘤的生長(zhǎng)也同樣發(fā)揮抑制作用［9］。楊斌等［10］對(duì)肝內(nèi)膽管上皮腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼對(duì)HCCC-9810 細(xì)胞具有殺傷作用，可以抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。張?jiān)?1］研究表明安羅替尼治療胃癌的作用及抑制胃癌遷移及侵襲機(jī)制可能是由于安羅替尼通過(guò)下調(diào)淋巴管生成因子表達(dá)的水平發(fā)揮作用。以上研究提示，安羅替尼可調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可為本實(shí)驗(yàn)的開展提供理論支撐，為治療胃癌開辟一種新的途徑。這些研究提示安羅替尼對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，4、8 μmol/L安羅替尼組中人胃癌AGS 細(xì)胞活力明顯降低，實(shí)驗(yàn)組中經(jīng)不同濃度安羅替尼處理后細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制，表明安羅替尼可以抑制人胃癌AGS 細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組中人胃癌AGS 細(xì)胞遷移和侵襲能力下降，表明安羅替尼可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，E-cadherin 蛋白表達(dá)升高，N-cadherin、Vimentin 和FN 蛋白表達(dá)降低。提示安羅替尼可抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲及EMT進(jìn)程。

TGF-β1/Smads 通路作為經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲等過(guò)程［12］。EMT 的發(fā)生發(fā)展與TGF-β1/Smads 信號(hào)通路密切相關(guān)。EMT 現(xiàn)象廣泛存在于消化系統(tǒng)腫瘤中，且在癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。TGF-β1/Smads信號(hào)通路與胃癌關(guān)系較為密切，陳春苗等［13］研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿通過(guò)TGF-β/Smad 通路能調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移及EMT 進(jìn)程。魏良煜［14］研究表明，安羅替尼能調(diào)控TGF-β1和EMT相關(guān)蛋白Vimentin表達(dá)。本研究中4、8 μmol/L 安羅替尼組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，為避免細(xì)胞死亡太多干擾實(shí)驗(yàn)，選取安羅替尼4 μmol/L 作為最適濃度加入10 μmol/L TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761 進(jìn)行TGF-β1/Smads 通路驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與4 μmol/L安羅替尼組相比，抑制劑組細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)一步受到抑制，細(xì)胞活力、遷移、侵襲能力及TGF-β1、p-Smad3、N-cadherin、Vimentin、FN 蛋白表達(dá)降低，E-cadherin和Smad7蛋白表達(dá)升高。上述結(jié)果表明安羅替尼抑制人胃癌AGS 細(xì)胞的遷移、侵襲通過(guò)介導(dǎo)TGF-β1/Smads通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，干預(yù)其EMT進(jìn)程發(fā)揮作用。

綜上所述，安羅替尼可抑制人胃癌AGS 細(xì)胞遷移和侵襲，其作用機(jī)制與介導(dǎo)TGF-β1/Smads 信號(hào)通路進(jìn)而干預(yù)EMT進(jìn)程有關(guān)。