鄧海蓮，吳月瑩，沙文月，羅金花，楊宇，馮德輝

1 廣東醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，廣東 湛江 524000；2 廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科

青蒿素（ART）及其衍生物除具有抗瘧疾作用外，還能抑制腫瘤細胞生長、分裂、遷移［1］。另外，它們還具有抗纖維化、抗病毒、消除炎癥等作用［2-3］。ART 及其衍生物具有共同的基團：含有過氧化橋的倍半萜內(nèi)酯，因此具有相似的藥理特性，包括下調(diào)氧化應激［4］、免疫抑制［5］、誘導細胞凋亡［6］、調(diào)控細胞自噬［7］等。現(xiàn)就ART及其衍生物調(diào)控自噬治療疾病的研究進展及相關信號通路綜述如下。

1 青蒿素及其衍生物與自噬的關系

我國古代醫(yī)者在古籍中曾提及“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”治療瘧疾。“青蒿”是蒿科草本植物，具有涼血解毒、消除骨熱、避暑、防止瘧疾復發(fā)和消除黃疸的功效［8］。蒿科草本植物是我國民間俗稱的“甜艾草”，亦是傳統(tǒng)中藥常用的一味藥材，而ART 便是從蒿科草本植物中分離得到。因ART 溶解性差、生物利用度低，雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等衍生物相繼問世。目前ART 及其衍生物是應用最廣泛、認可度最高的抗瘧疾藥物，它們具有共同的基團：含有過氧化橋的倍半萜內(nèi)酯，決定了它們具有相似的作用機制。過氧化橋在ART 及其衍生物發(fā)揮抗瘧疾作用過程中至關重要［9］。近年來，ART及其衍生物被發(fā)現(xiàn)除了具有抗瘧疾作用外，還能抑制腫瘤細胞的增殖和分化［1］，并且與細胞周期阻滯、氧化應激［4］、細胞凋亡和自噬［7］等機制相關。

20世紀50年代，首次在酵母中發(fā)現(xiàn)了自噬體和自噬現(xiàn)象［10］，電鏡下觀察到胞質內(nèi)自噬體的形成是一個連續(xù)性過程。自噬被激活后，首先在內(nèi)質網(wǎng)出現(xiàn)隔離膜；隨后延伸雙層膜結構包裹受損的蛋白質或者細胞器，形成成熟自噬體，在一系列自噬蛋白協(xié)助下轉運至溶酶體；接著雙層膜結構與溶酶體膜相融合，包裹的蛋白質或者細胞器釋放入溶酶體，被溶酶體酶降解，完成自噬過程。根據(jù)降解的底物不同，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬，非選擇性自噬主要在饑餓環(huán)境下被激活，降解受損物質，形成代謝循環(huán)利用環(huán)，為細胞提供營養(yǎng)和能量；而非選擇性自噬主要與保護細胞結構相關，根據(jù)作用的對象不同，可分為線粒體自噬、過氧化物酶自噬、內(nèi)質網(wǎng)和核糖體自噬等。同時，自噬也被認為是一種Ⅱ型程序性細胞死亡，過度的自噬不僅不能保護細胞，反而會導致細胞死亡。自噬對機體的雙刃劍作用讓其在人類腫瘤及代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。

相關文獻報道，ART 及其衍生物除了抑制腫瘤細胞生長繁殖外［7］，還能通過調(diào)控自噬增加耐放化療腫瘤細胞對藥物的敏感性［11］。此外，ART 及其衍生物通過調(diào)控自噬降解肝硬化的細胞外基質沉積、改善肝細胞損傷、抑制甚至逆轉肝纖維化進程［3］。相關研究表明，ART 及其衍生物還能調(diào)控自噬，抑制滑膜的異常細胞增殖，修復軟骨細胞異常表達，具有改善骨關節(jié)炎的潛質［12］。血管細胞發(fā)生自噬是血管內(nèi)各類細胞在缺氧、血流剪切力增強等應激環(huán)境下降解受損蛋白質、為細胞提供能量以及修復受損細胞的保護機制，ART 及其衍生物被發(fā)現(xiàn)能調(diào)控自噬、修復受損的血管細胞［13］。同時，研究表明ART及其衍生物對腎臟疾病尤其是足細胞相關性腎臟疾病，具有一定的治療潛力［14］。總的來說，ART 及其衍生物已批準用于臨床，其安全性、有效性已經(jīng)在一定程度上得到保證，根據(jù)藥物特性和疾病特點，開發(fā)舊藥新功能一直是有吸引力的命題，因此ART 及其衍生物的臨床應用會受到越來越多的關注。

2 青蒿素及其衍生物對自噬調(diào)控的相關信號通路

2.1 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路mTOR 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，ART及其衍生物被發(fā)現(xiàn)能通過調(diào)節(jié)mTOR 表達調(diào)控自噬，影響生長因子、氧化應激因子等分泌，從而調(diào)控能量代謝、調(diào)節(jié)蛋白質合成和分解。mTOR 是信號通路中間站，與自噬調(diào)節(jié)相關的上游通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路和腺苷單磷酸激活的蛋白激酶信號通路（AMPK）。上游信號通路激活后促進mTOR 磷酸化使其活化，活化的mTOR 誘導下游信號因子Unc-51 樣自噬激活激酶（Ulk）磷酸化而失活，從而抑制自噬的發(fā)生［15］。

2.1.1 PI3K/Akt/mTOR 信號通路 PI3K/Akt/mTOR 信號通路是一條經(jīng)典的自噬信號通路，與細胞的生長代謝、周期調(diào)節(jié)有密切關系。在營養(yǎng)充足情況下，PI3K/Akt/mTOR信號通路激活，mTOR活化促使Ulk 637 號位和757 號位的絲氨酸（Ser308 和Ser757）磷酸化而失活，進而抑制Ulk復合物的活性，抑制自噬啟動。在饑餓或者細胞應激期間，mTOR活性受到抑制，Ulk 特定位點的磷酸化被解除，活化的Ulk 復合物隨后轉移到內(nèi)質網(wǎng)的隔離膜上，啟動自噬。研究表明，ART 及其衍生物能影響這條通路的上中下游其中一兩個環(huán)節(jié)從而調(diào)控自噬。LIU等［13］在人臍靜脈內(nèi)皮細胞模型中發(fā)現(xiàn)，相比對照組，雙氫青蒿素組微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3-Ⅱ）表達水平更高，Akt、mTOR、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）磷酸化水平更低。通過siRNA 干擾沉默自噬相關蛋白ATG5 能減弱雙氫青蒿素組LC3-Ⅱ水平的高值，而使用mTOR 抑制劑雷帕霉素預處理后，雙氫青蒿素組未出現(xiàn)LC3-Ⅱ表達進一步升高，上述結果表明Akt/mTOR 通路活性下調(diào)是雙氫青蒿素誘導血管內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬的機制。姜廣利等［16］將宮頸癌HeLa 細胞作為研究對象，隨機設置對照組、雙氫青蒿素組、順鉑組及雙氫青蒿素加順鉑組，實驗結果發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素加順鉑組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達低，而p-mTOR/mTOR 和 p-Ulk /Ulk 表達升高，提示雙氫青蒿素可能通過激活mTOR/Ulk 信號途徑抑制自噬，從而提高宮頸癌的化療敏感性。在順鉑耐藥胃癌細胞SGC7901/DDP 體外模型中，ZHANG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素干預后，使用mRFP-GFP-LC3腺病毒轉染和透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)自噬增強，蛋白質印跡檢測發(fā)現(xiàn)PI3K、Akt 和mTOR 磷酸化水平降低，表明雙氫青蒿素通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導自噬，克服了癌細胞耐藥特性引發(fā)細胞死亡，可作為治療耐藥性胃癌的潛在藥物。

2.1.2 AMPK/mTOR 信號通路 AMPK 是一種能量感應蛋白，維持能量代謝平衡，當機體AMP/ATP值上調(diào)或者下調(diào)時，AMPK 啟動相關信號通路干預能量流動，同時調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生和能量消耗途徑來儲存機體內(nèi)能量。在能量充足情況下，活化的mTOR除了直接磷酸化Ulk 使其失活外，還能通過破壞AMPK 與Ulk 之間相互作用來阻止Ulk 活化，抑制自噬啟動。而能量缺乏時，AMPK 被激活，活化的AMPK 抑制mTOR 的磷酸化，其對Ulk 的抑制被解除，啟動自噬。DU等［17］探究雙氫青蒿素干預白血病細胞株的實驗中觀察到，雙氫青蒿素能上調(diào)LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7、Beclin1等自噬相關蛋白表達，同時p-AMPK/AMPK 表達水平升高，而mTOR 磷酸化被抑制，下游蛋白p70S6K 表達增加，表明雙氫青蒿素通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR 信號通路激活自噬，誘導細胞死亡。在此基礎上，敲除ATG7 基因或者使用自噬抑制劑（3-MA 或BafA1）后，自噬相關蛋白表達明顯下降，自噬被抑制，雙氫青蒿素對白血病細胞株的毒性變小，而使用雷帕霉素對mTOR 活性抑制后加劇了雙氫青蒿素激發(fā)的細胞死亡。此外，研究還發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素誘導的自噬能增加細胞內(nèi)鐵蛋白及過氧化物表達，誘導缺鐵性貧血，導致白血病細胞株死亡，表明雙氫青蒿素可能是治療白血病的有效藥物。

2.2 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路MAPK 是一組真核保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過調(diào)節(jié)自噬參與細胞分化、增殖等生理活動，與自噬相關的亞基主要包括c-jun N 端激酶（JNK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）及p38 三種亞基。MAPK 亞基調(diào)節(jié)自噬的機制錯綜復雜，有時甚至截然相反，尤其是在ATR 及其衍生物等藥物特定的處理條件下如何精細調(diào)控細胞自噬仍未被闡明。研究表明，MAPK/JNK激活后可以促使Bcl-2家族蛋白磷酸化，從而將Beclin1 從復合體中游離出來，與自噬相關蛋白Vps34結合，促進自噬體成核，同時JNK 還可以直接激活相關自噬基因ATG 促進自噬。JIA等［18］在研究雙氫青蒿素對胰腺癌細胞株作用時發(fā)現(xiàn)，相比對照組，雙氫青蒿素組LC3-Ⅱ、JNK、Beclin1表達增強，mTOR 表達減弱，使用JNK 抑制劑或者siRNA 干擾沉默JNK 后，雙氫青蒿素組Beclin1 水平下調(diào)，自噬表達減弱，細胞死亡率升高，表明雙氫青蒿素通過MAPK/JNK 信號通路誘導了胰腺癌細胞株發(fā)生保護性自噬，抑制JNK 表達有可能增強雙氫青蒿素的治療功效，JNK 基因沉默有可能成為治療胰腺癌的手段。然而，YAO 等［19］發(fā)現(xiàn)MAPK/JNK 信號通路在調(diào)節(jié)雙氫青蒿素衍生物L-A03誘導人乳腺癌癥細胞發(fā)生自噬時起著相反的結果。實驗結果顯示，處理乳腺癌細胞株MCF-7 時，L-A03 組自噬相關蛋白LC3-II表達增強，但JNK磷酸化水平降低，而使用JNK 特異性抑制劑SP600125 后，L-A03 組自噬表達進一步增強，乳腺癌細胞株死亡率更高，類似的結果在另外一種乳腺癌細胞株MDA-MB-231中得到印證，表明雙氫青蒿素衍生物L-A03 誘導乳腺癌細胞發(fā)生自噬可能與MAPK/JNK 信號通路受抑制相關，JNK 基因失活有可能成為治療乳腺癌的靶點。MAPK/JNK 信號通路在自噬調(diào)節(jié)中極其復雜，有時甚至互相矛盾，這一現(xiàn)象在其他研究中亦有體現(xiàn)［20］，考慮與藥物激活其他的細胞活動如凋亡、炎癥、氧化應激等間接影響了自噬調(diào)節(jié)的方向有關，仍需設計更多實驗進一步明確其中機制。LIU 等［21］采用雙氫青蒿素另外一種衍生物DHA-37 處理非小細胞肺癌體外模型時發(fā)現(xiàn)，DHA-37 組自噬表達增強，同時ERK1/2、p38 以及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達明顯升高，而JNK1表達和對照組差異無統(tǒng)計學意義，使用ERK1/2 抑制劑PD98059 逆轉了LC3-Ⅱ/LC3-I 上調(diào)，并阻止了DHA-37 誘導的HMGB1 增加，阻止了DHA-37誘導的細胞死亡，而使用p38抑制劑SB203580 也出現(xiàn)了相似的實驗結果，表明DHA-37誘導的自噬增強導致肺癌細胞株死亡可能與MAPK/ERK和p38信號通路相關。該實驗還設計了肺癌異種移植裸鼠體內(nèi)模型，發(fā)現(xiàn)p-ERK、p-p38、HMGB1、LC3-Ⅱ水平升高，進一步印證了上述結論。上述研究表明，MAPK 信號通路在ART 及其衍生物調(diào)控自噬治療相關疾病的發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用。

2.3 活性氧（ROS）信號通路 ROS 是一組化學性質活潑、氧化性強的物質，包括羥自由基、雙氧水、超氧陰離子、一氧化氮等。體內(nèi)的ROS 水平往往維持在極低狀態(tài)，當機體受到刺激時會產(chǎn)生大量的ROS，引發(fā)細胞氧化應激，進而誘導細胞炎癥、凋亡、自噬等。相關研究發(fā)現(xiàn)，在ART及其衍生物實驗中，ROS能通過多種細胞信號通路調(diào)控自噬，促進細胞發(fā)生自噬性死亡或自噬性保護，同時自噬亦能逆反饋調(diào)節(jié)ROS 水平。DU 等［22］在食管癌細胞系中發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素誘導細胞自噬。MA 等［23］在此基礎上進一步研究了其中機制，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的ROS 水平明顯上調(diào)，而使用抗氧化劑NAC 阻斷ROS 后，觀察到雙氫青蒿素組自噬水平較前明顯下降，細胞活性抑制明顯減弱。HU 等［24］通過對骨髓瘤、白血病、直腸癌、宮頸癌等多種細胞株的研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素通過抑制各細胞株鐵蛋白重鏈（FHC）和錳超氧化物歧化酶（MnSOD）表達，引起ROS 累積，誘導細胞自噬，實驗發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑阻斷ROS 可抑制雙氫青蒿素誘導細胞自噬。上述研究表明，雙氫青蒿素誘導細胞自噬可能與ROS水平相關。SHEN等［25］研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素抑制骨肉瘤細胞增殖，對骨肉瘤有潛在治療價值，其作用機制主要與鐵依賴的ROS水平上調(diào)、激活上游自噬過程、阻斷后期自噬降解相關。

2.4 核因子-κB（NF-κB）信號通路 NF-κB 是一組調(diào)控細胞分化、增殖的轉錄因子家族，主要有Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel（Rel）、NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）等5 種亞型。一般情況下，NF-κB 的轉錄并不活躍，其與IκB 家族抑制蛋白結合形成無活性復合體，當受到外界刺激時，IκB發(fā)生磷酸化，NF-κB被激活，向細胞核轉移，NF-κB活化，進而調(diào)節(jié)下游因子。NF-κB 參與了細胞凋亡、壞死、炎癥、自噬等過程。研究發(fā)現(xiàn)自噬與NF-κB 信號通路有相互交叉作用，NF-κB信號通路受抑制，自噬激活，機體產(chǎn)生保護或者損傷作用，反之亦然。HU 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素通過抑制NF-κB核轉位來調(diào)控各種癌細胞株發(fā)生自噬。許浩等［26］在宮頸癌細胞株體外模型中觀察發(fā)現(xiàn)，相比對照組，雙氫青蒿素組自噬表達增強、NF-κB表達被抑制，并且細胞增殖抑制明顯，雙氫青蒿素誘導自噬抑制宮頸癌細胞株活性的機制有可能與阻斷NF-κB 信號通路相關，但該實驗并未設計NF-κB 通路激活劑或抑制劑進一步印證。JIANG等［12］將軟骨細胞作為研究對象，隨機設置對照組、腫瘤壞死因子（TNF-α）組、雙氫青蒿素組和TNF-α+雙氫青蒿素組，結果發(fā)現(xiàn)TNF-α+雙氫青蒿素組自噬水平較雙氫青蒿素組明顯升高，此外TNF-α 組p65 表達增強并且出現(xiàn)核轉位、IκB 表達降低，但用雙氫青蒿素預處理后降低了p65 表達，并且誘導了軟骨細胞中IκB 的積累，說明雙氫青蒿素抑制了TNF-α 刺激的NF-κB信號傳導。該實驗還使用了NF-κB抑制劑SM7368，觀察到IκB的表達增強，NF-κB途徑受到抑制，但軟骨細胞中LC3-Ⅱ水平升高，驗證了NF-κB通路在雙氫青蒿素誘導軟骨細胞發(fā)生自噬的作用。LI 等［27］研究卵巢癌細胞系發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯和雙氫青蒿素誘導的自噬可能抑制了卵巢癌細胞系的NF-κB信號通路。相關研究表明，NF-κB 信號通路影響mTOR 蛋白的磷酸化從而調(diào)節(jié)細胞自噬［28］，但并未有研究直接表明ART 及其衍生物處理時，NF-κB 信號通路能調(diào)節(jié)mTOR蛋白的磷酸化。

綜上所述，青蒿素及其衍生物可通過mTOR、MAPK、ROS、NF-κB等信號通路調(diào)控自噬，對多種疾病起到緩解作用。