姚麗倩 顧婷婷

江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 昆山市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇昆山 215300

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌器官惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見(jiàn)類(lèi)型[1]。雖然大部分PTC惡性度低，預(yù)后良好，但是仍有10%的患者發(fā)生侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且發(fā)病人群年輕化[2]。目前臨床上超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢細(xì)胞學(xué)是診斷PTC的有效方法，但因超聲穿刺取樣、人工制片及病理醫(yī)生閱片等多方面的原因，只有70%～80%的患者得以確診[3]。研究表明，特異性分子標(biāo)志物可提高甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)的診斷準(zhǔn)確度。近年來(lái)，已有研究建議將鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）、細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）、人骨髓內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物（human bone marrow endothelial markers，HBME-1）和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule 56，CD56）等分子標(biāo)志物用于臨床診斷PTC，但這些標(biāo)志物的可靠性還存在較大的爭(zhēng)議[4]。本文旨在探究BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56四種抗體單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)診斷PTC的效果，確定其在臨床診斷PTC的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年11月至2022年11月昆山市第一人民醫(yī)院（本院）病理科179例甲狀腺手術(shù)標(biāo)本，其中62例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、腺瘤等結(jié)節(jié)為良性組，117例PTC結(jié)節(jié)為惡性組。良性組男10例，女52例；年齡25～78歲，平均（52.9±13.48）歲；平均病程（16.85±6.21）個(gè)月。惡性組男36例，女71例；年齡26～76歲，平均（43.45±11.71）歲；病程（12.95±4.25）個(gè)月；腫塊直徑0.1～3.8 cm，平均（0.92±0.35）cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)其他腫瘤病史、免疫系統(tǒng)及感染性疾病史；無(wú)手術(shù)史及放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：免疫組織化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)不完整；術(shù)前合并髓樣癌、濾泡癌等其他類(lèi)型腫瘤。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2021-06-040-K01）。

1.2 免疫組織化學(xué)方法

常規(guī)石蠟制片，厚度3～4 μm切片備用。EnVision法染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。一抗BRAFV600E抗體（克隆號(hào)VE1）購(gòu)自Roche公司，CK19、HBME-1、CD56單克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 結(jié)果判讀

顯微鏡觀察切片染色情況，無(wú)著色0分、黃色1分、棕色2分、褐色3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比兩項(xiàng)所得分?jǐn)?shù)相乘，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～6分為陽(yáng)性（++），＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[5]。結(jié)果由兩名高年資醫(yī)師判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC病理巨檢及蘇木精-伊紅染色特點(diǎn)

PTC結(jié)節(jié)肉眼觀察多為灰白、實(shí)性、質(zhì)中，與周?chē)谞钕俳M織界限欠清。組織學(xué)上PTC細(xì)胞呈乳頭狀結(jié)構(gòu)及腺管樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核偏大，呈毛玻璃狀，可見(jiàn)核重疊、核溝及核內(nèi)包涵體。

2.2 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56抗體在甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)的表達(dá)

對(duì)179例甲狀腺結(jié)節(jié)行免疫組化染色，BRAFV600E表達(dá)定位于PTC細(xì)胞胞質(zhì)，多呈中-強(qiáng)陽(yáng)性（圖1A）；CK19表達(dá)定位于PTC細(xì)胞胞質(zhì)，多呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性（圖1B）；HBME-1表達(dá)定位于PTC細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜，呈中-強(qiáng)陽(yáng)性（圖1C）；CD56表達(dá)定位于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞胞膜，呈強(qiáng)陽(yáng)性，PTC細(xì)胞為陰性（CD56在PTC細(xì)胞膜染色陰性作為診斷PTC的陽(yáng)性判斷）（圖1D）。

圖1 PTC細(xì)胞BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56抗體免疫組化染色

BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在PTC結(jié)節(jié)和良性結(jié)節(jié)中表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。本組117例PTC中，BRAFV600E陽(yáng)性100例（85.47%），CK19陽(yáng)性117例（100.00%），HBME-1陽(yáng)性116例（99.15%），CD56陰性109例（93.16%）；62例良性結(jié)節(jié)中，BRAFV600E陽(yáng)性3例（4.84%），CK19陽(yáng)性26例（41.94%），HBME-1陽(yáng)性5例（8.06%），CD56陰性6例（9.68%）。見(jiàn)表1。

表1 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)表達(dá)率比較

2.3 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)的診斷效能

BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56聯(lián)合診斷PTC時(shí)，聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性均高于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)診斷的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性+假陰性）例數(shù)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽(yáng)性）例數(shù)×100%；準(zhǔn)確性=（真陽(yáng)性+真陰性）/總例數(shù)×100%。見(jiàn)表2。

表2 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56診斷PTC的效能（%）

3 討論

甲狀腺結(jié)節(jié)可發(fā)生于各個(gè)年齡段，女性居多，患者多無(wú)明顯癥狀，少數(shù)會(huì)出現(xiàn)咽喉疼痛不適感[2]。PTC多分化較好，易與良性增生病變混淆。其次甲狀腺炎癥時(shí)，間質(zhì)纖維組織增生，又易導(dǎo)致臨床發(fā)生誤判。免疫組化是目前臨床病理普及的方法，當(dāng)多種抗體優(yōu)化組合能更有效地鑒別甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)。

BRAF在絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路中，通過(guò)激活P21從而修復(fù)基因損傷，是一種抑癌基因。甲狀腺中，該基因突變導(dǎo)致編碼蛋白異常，使其失去抑癌作用，進(jìn)而引起細(xì)胞發(fā)生異型增生，導(dǎo)致癌變[6]。目前與BRAF基因突變相關(guān)研究多建立在基因水平上，而禹樂(lè)等[7]研究表明，運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)BRAFV600E表達(dá)產(chǎn)物（單克隆抗體VE1）與BRAFV600E基因突變有高度一致性。本研究中，良性組BRAFV600E抗體陽(yáng)性率為4.84%，且染色均為輕-中等強(qiáng)度；惡性組BRAFV600E陽(yáng)性表達(dá)率85.47%，明顯高于良性組，且染色均為中-強(qiáng)陽(yáng)性。BRAFV600E診斷PTC特異性達(dá)95.16%，靈敏性85.47%，準(zhǔn)確性88.83%，是診斷PTC的可靠標(biāo)志物。CK19是一類(lèi)低分子量角蛋白，通常表達(dá)于膽管、胰腺等上皮細(xì)胞[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CK19在PTC中表達(dá)水平較高，多表現(xiàn)為中等及以上強(qiáng)度表達(dá)，靈敏度高達(dá)100%。但是，CK19特異度不高，在甲狀腺良性病變也可呈陽(yáng)性表達(dá)，只是表達(dá)強(qiáng)度及陽(yáng)性率不穩(wěn)定[9]。結(jié)果顯示，CK19在PTC結(jié)節(jié)的靈敏度也為100%，但其特異度僅58.06%，診斷準(zhǔn)確性為85.47%。值得注意的是，CK19在良性結(jié)節(jié)中的陽(yáng)性率雖達(dá)到了41.93%，但其染色均為中等及以下強(qiáng)度，而在PTC結(jié)節(jié)中，均為彌漫強(qiáng)陽(yáng)性，說(shuō)明CK19中等以上強(qiáng)度著色對(duì)PTC有較好的警惕性作用，但其低特異性導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用受限[10]。HBME-1是一種特異性抗原成分，存在于間皮細(xì)胞表面微絨毛，常在間皮瘤和一些腺癌細(xì)胞中表達(dá)，在腫瘤中起促進(jìn)血管形成及細(xì)胞增殖作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[11]。相關(guān)研究報(bào)道，HBME-1在PTC組織中特異度和靈敏度均較高，且多呈中度或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫等良性病變中很少表達(dá)，其在PTC結(jié)節(jié)和甲狀腺良性結(jié)節(jié)的表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）[12]。本研究結(jié)果中，HBME-1在甲狀腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為99.15%，在甲狀腺良性結(jié)節(jié)中的陽(yáng)性表達(dá)率為8.06%，診斷PTC的特異性為91.93%，準(zhǔn)確性高達(dá)96.65%?？梢?jiàn)，HBME-1在用于PTC的診斷與鑒別診斷時(shí)，是比較理想的標(biāo)志物。臨床診斷中，可選擇特異度高的HBME-1和靈敏度強(qiáng)的CK19蛋白聯(lián)合診斷PTC，大大提高其診斷準(zhǔn)確性。CD56在NK細(xì)胞、星形細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞、神經(jīng)元及少量活化的T細(xì)胞中表達(dá)，是神經(jīng)細(xì)胞黏附、神經(jīng)外胚層及神經(jīng)內(nèi)分泌組織細(xì)胞的介導(dǎo)因子，CD56表達(dá)缺失或降低可促進(jìn)腫瘤的增殖和遷移，還與患者預(yù)后相關(guān)[13]。研究顯示，CD56蛋白在PTC中表達(dá)缺失，在甲狀腺正常濾泡上皮細(xì)胞及良性病變中呈陽(yáng)性表達(dá)[14]。本研究結(jié)果表明，惡性組CD56陰性表達(dá)率為93.16%明顯高于良性組的9.68%，CD56靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性均高達(dá)90%以上。郭宏義等[15]研究表明，合理地聯(lián)合應(yīng)用分子標(biāo)志物能顯著提高臨床診斷PTC的準(zhǔn)確性。這一結(jié)果與本研究結(jié)果相吻合，具有可信度。同時(shí)提示在甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)鑒別診斷中，從抗體的表達(dá)水平，抗體的染色強(qiáng)度等多個(gè)角度綜合判定，可大大提高PTC的診斷準(zhǔn)確性。本研究中BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56聯(lián)合抗體診斷PTC的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性均達(dá)到100.00%，診斷效能均高于各個(gè)抗體單獨(dú)使用，說(shuō)明抗體合理地聯(lián)合使用是診斷PTC的極可靠的輔助工具。

綜上所述，BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56是甲狀腺良、惡性病變鑒別診斷的重要輔助指標(biāo)，CK19陽(yáng)性表達(dá)是診斷PTC的敏感性指標(biāo)，BRAFV600E、HBME-1異常過(guò)表達(dá)和CD56表達(dá)缺失是診斷PTC的特異性分子標(biāo)記，合理運(yùn)用這四種標(biāo)志物組合，聯(lián)合檢測(cè)有助于臨床提高PTC的診斷準(zhǔn)確性。同時(shí)，運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)BRAFV600E突變較基因測(cè)序成本低、效率高，具有一定的社會(huì)效益，值得推廣。