魯長海，何曉峰，林 緒，劉云苑，陳潔瓊

(廣電計量檢測集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 511450)

維生素是人類為維持正常生理機(jī)能不可缺少的一類微量有機(jī)化合物，多為酸、醇和酚類物質(zhì)。維生素的種類很多，根據(jù)其溶解性可分為水溶性維生素和脂溶性維生素兩大類。水溶性維生素主要包括維生素C(又叫抗壞血酸)及B族維生素。其中B族維生素有12種以上，被世界一致公認(rèn)的有9種[1-9]。維生素B族包括維生素B1(硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(煙酸、煙酰胺)、維生素B5(泛酸鈣)、維生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)、維生素B12(鈷胺素)、維生素B9(葉酸)、維生素B7(生物素)等，對保健食品的質(zhì)量監(jiān)控、疾病的診斷和治療以及生命科學(xué)等領(lǐng)域也具有重要的意義[10-11]。

現(xiàn)有維生素方法對于復(fù)雜基質(zhì)樣品檢測前處理繁瑣、速度慢，準(zhǔn)確度不高且大多面對復(fù)雜基質(zhì)中的各種維生素分離不佳，本問提供了一種快速檢測方法，使用微波輔助萃取大幅縮短提取時間，使用液質(zhì)聯(lián)儀同時檢測食品中9種維生素：硫胺素(維生素B1)、核黃素(維生素B2)、煙酰胺(維生素B3)、泛酸(維生素B5)、吡哆醇(維生素B6)、生物素(維生素H)、葉酸(維生素B9)、維生素B12和維生素C。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：鹽酸硫胺素(94.43%)，Dr；核黃素(97.6%)、鹽酸吡哆醇(99.9%)、D-生物素(99.9%)、L-抗壞血酸(99.7%)，安譜；煙酰胺(99.9%)、維生素B12(96.5%)、葉酸(89.9%)，BePure；D-泛酸鈣(99.9%)，天津阿爾塔。

試劑：鹽酸(優(yōu)級純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨水(化學(xué)純)，廣州化學(xué)試劑廠；乙醇(色譜純)，CNW；甲醇(質(zhì)譜級)，Sigma；甲酸(質(zhì)譜級)，CNW；乙酸銨(質(zhì)譜級)，LiChropur；偏磷酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

耗材：HLB固相萃取小柱(500 mg，6 mL)，Biocomma；有機(jī)系濾膜(津騰，尼龍66，13 mm，0.22 μm)。

耗材：市售某品牌多維片。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4500超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國SCIEX公司；超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；UV-2600i紫外可見分光光度計，日本島津；XS205DU電子分析天平(0.001 mg)，瑞士梅特勒；ME204E電子分析天平(0.01 mg)，瑞士梅特勒；Milli-Q Advantage超純水機(jī)，美國密理博；高速離心機(jī)，蜀科；渦旋振蕩器，美國SI。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量前須經(jīng)五氧化二磷干燥24 h，稱取鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、泛酸、生物素、煙酰胺、維生素B12各約10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用20%甲醇水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)定容至刻度，作為儲備液，濃度約為1 000 μg/mL；稱取核黃素約10 mg，分別置50 mL棕色容量瓶中，用5 mL鹽酸(1+1)超聲溶解后20%甲醇水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)定容，濃度約為200 μg/mL；稱取葉酸約10 mg，置10 mL容量瓶中，加入約1 mL水，加入1滴氨水，溶解后用20%甲醇水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)定容，濃度約為1 000 μg/mL。

(2)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

配制標(biāo)準(zhǔn)中間液前，核黃素按照GB 5009.85附錄A進(jìn)行濃度校準(zhǔn)，煙酰胺按照GB 5009.89附錄B進(jìn)行濃度校準(zhǔn)，鹽酸吡哆醇按照GB 5009.154附錄A進(jìn)行濃度校準(zhǔn)。

準(zhǔn)確吸取各維生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用水稀釋至最終濃度分別為1.00 μg/mL：鹽酸硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、生物素、維生素B12；2 μg/mL：煙酰胺、泛酸、葉酸；5 mL；20 μg/mL：L-抗壞血酸。

(3)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制

取不含維生素的空白樣品按照樣品處理方法制得空白基質(zhì)溶液。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液定容至刻度混勻。此標(biāo)準(zhǔn)混合系列工作液中鹽酸硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、生物素、維生素B12的濃度分別為10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL；煙酰胺、泛酸、葉酸的濃度分別為20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL、1 000 ng/mL；L-抗壞血酸濃度分別為200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL、 1 600 ng/mL、2 000 ng/mL、4 000 ng/mL、8 000 ng/mL、10 000 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理

(1)提取

準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣1 g(精確至0.001 g)于 50 mL棕色容量瓶中，加入40 mL 20%甲醇水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)，搖勻，置微波萃取儀480 W萃取30 s，取出冷卻后加水溶液至刻度，混勻。以10 000 r/min離心5 min。取上清液待用。

取上清液1 mL至100 mL棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。稀釋液過0.22 μm 水相濾膜過濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

(1)液相色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；進(jìn)樣量5 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫40 ℃；梯度洗脫：流動相A為20 mmol/L乙酸銨含0.1%(V/V)甲酸水，流動相B為0.1%甲酸甲醇，洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

(2)質(zhì)譜條件

氣簾氣流速：30 L/min；霧化氣流速(GS1)：50 L/min；輔助加熱氣流速(GS2)：50 L/min；碰撞氣(CAD)：中等強(qiáng)度(medium)；輔助加熱氣溫度：550 ℃；噴霧電壓：5 500 V(ESI+)；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。

1.3.4 定性測定

(1)采用優(yōu)化后的儀器方法及質(zhì)譜參數(shù)對樣品進(jìn)行掃描，如目標(biāo)物無響應(yīng)則樣品未檢出，無需定量。

(2)如掃描后出現(xiàn)目標(biāo)物陽性則按照超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件測定試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的色譜保留時間，當(dāng)試樣中檢出與某標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時間一致的色譜峰(變化范圍在±2.5%之內(nèi))，并且試樣色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對豐度比(k)的偏差不超過表2規(guī)定的范圍，可以確定試樣中檢出相應(yīng)化合物。

表2 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

1.3.5 定量測定

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1.3.4)按儀器參考條件進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子的色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，采用線性過原點繪制曲線，外標(biāo)法。

1.3.6 結(jié)果計算

如目標(biāo)物檢出按下列公式(1)計算出樣品中目標(biāo)物的含量：

(1)

式中：X——試樣中各待測物的含量，mg/kg

c——待測物的濃度，μg/L

V——樣液最終定容體積，mL

m——試樣溶液所代表的質(zhì)量，g

f——稀釋倍數(shù)

計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值，保留三位有效數(shù)字。

2 討論與結(jié)論

2.1 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用標(biāo)準(zhǔn)儲備液直接作為質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化用溶液，采用針泵流動注射連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行質(zhì)譜全掃描檢測，得到被測化合物一級質(zhì)譜圖，找出兩者對應(yīng)的母離子，再進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到相應(yīng)的子離子信息。然后優(yōu)化兩者的碰撞能量及去簇電壓等參數(shù)，使兩者的母離子與特征碎片離子強(qiáng)度最佳，各標(biāo)準(zhǔn)品的定性和定量離子對以及最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)見表2。各維生素物的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表3。

表3 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜檢測參數(shù)

2.2 微波輔助萃取溶劑的優(yōu)化

水是水溶性維生素的最優(yōu)提取溶劑，甲醇和乙腈是常用提取溶劑，分別選擇水溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH=4.5)、20%甲醇水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)、20%乙腈水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)作為提取溶劑，分別對同一某品牌多維片進(jìn)行測定，結(jié)果回收率分布如表4所示。

表4 不同提取溶劑回收率分布圖

經(jīng)過比較，甲醇水溶液的回收率明顯更為優(yōu)異，因此選擇甲醇水作為提取溶劑。

2.3 提取液pH的優(yōu)化

另行將提取液調(diào)節(jié)pH為10.0和4.0進(jìn)行檢測，結(jié)果除堿性環(huán)境中葉酸回收率較大提高至92%，其余品種維生素回收率均大幅下降，因而最終仍然以pH=4.0的甲醇水作為提取溶劑。

2.4 萃取時間的優(yōu)化

將微波的時間分別調(diào)整為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s，然后按照流程測試，結(jié)果如表5所示。

表5 不同萃取時間條件下的回收率

由表5可以看出，隨著時間的增加，在10～30 s的時間內(nèi)，維生素的回收率逐漸增加，30～50 s，維生素的回收率趨于平穩(wěn)，甚至略有下降，分析原因，可能是微波有助于維生素的溶出，30 s時達(dá)到最佳提取效率，30 s后部分維生素略有分解，因此，最終選擇萃取時間為30 s。

2.5 微波功率的優(yōu)化

調(diào)節(jié)微波萃取的功率分別為160 W、320 W、480 W、640 W、800 W，分別對某品牌多維片樣品進(jìn)行微波輔助萃取，維生素的回收率如表6所示。

表6 不同微波功率對樣品回收率的影響

由表6可知，微波功率對提取效率有較大的影響，當(dāng)功率為480 W時，達(dá)到最大提取效率，有少許維生素降解的跡象，超過480 W后存在較為明顯的降解，所以選擇微波萃取的功率為480 W。

2.6 溶劑溶劑用量的優(yōu)化

選用磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0的甲醇水溶液作為提取溶劑，選擇微波功率480 W，萃取時間30 s，30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL提取液進(jìn)行微波萃取，萃取的各種維生素回收率如表7所示。

表7 不同體積提取溶劑用量對應(yīng)的維生素回收率

表8 方法特異性實驗結(jié)果

從表7可以看出，隨著提取溶劑體積的增加提取回收率逐漸上升，當(dāng)提取溶劑用量到達(dá)50 mL后維生素的回收率到達(dá)平衡點，再增加提取溶劑用量對結(jié)果影響不大，在此條件下的回收率已能滿足《GB 5009.295-2023 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 化學(xué)分析方法驗證通則》的要求。

2.7 方法特異性

分別采用陰性基質(zhì)以及向陰性基質(zhì)中添加鹽酸硫胺素、核黃素、煙酰胺、泛酸、鹽酸吡哆醇、生物素、葉酸、維生素B12和L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行專屬性測定，發(fā)現(xiàn)陰性基質(zhì)中無對檢測造成干擾的雜質(zhì)。

2.8 檢測限和定量限

取制備的空白基質(zhì)溶液，加入適量維生素B1、B2、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、葉酸、B12和L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(維生素B12所用空白溶液為水)。逐級稀釋，進(jìn)入儀器分析，以大于3倍信噪比時的溶液濃度為檢出限，大于10倍信噪比時的溶液濃度為定量限。

2.8.1 檢測限

維生素B1、維生素B2、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、葉酸、生物素、維生素B12的檢測限均為1.0 ng/mL，當(dāng)稱樣量為1 g，最終定容體積為50 mL時，維生素B1、B2、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、葉酸的、生物素、維生素B12的檢測限均為0.05 μg/g；維生素C(L-抗壞血酸)的檢測限為10.0 ng/mL，當(dāng)稱樣量為1 g，最終定容體積為50 mL時，維生素C的檢測限為0.5 μg/g。

2.8.2 定量限

維生素B1、B2、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、葉酸、生物素、維生素B12的定量限均為3.0 ng/mL，當(dāng)稱樣量為1 g，最終定容體積為50 mL時，維生素B1、B2、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、葉酸、生物素、維生素B12的定量限均為0.15 μg/g；維生素C(L-抗壞血酸)的檢測限為30.0 ng/mL，當(dāng)稱樣量為1 g，最終定容體積為50 mL時，維生素C的定量限為1.5 μg/g。

2.9 測定范圍

按照1.3.1配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測試，然后將結(jié)果以各組分定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，各組分含量為橫坐標(biāo)對其進(jìn)行線性回歸，的到各組分的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果見表5，線性關(guān)系圖見圖3。表明以該方法測試維生素B1、B2、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、葉酸、B12和L-抗壞血酸的含量，在表9中所列線性范圍內(nèi)，方法線性關(guān)系良好。

表9 測定范圍測試結(jié)果

2.10 精密度試驗

為保證方法的重現(xiàn)性，以某品牌多維片為樣品進(jìn)行了精密度試驗。平行配制六份樣品樣液進(jìn)行測試，測試結(jié)果如表10所示。六份樣品測試結(jié)果中9種維生素的結(jié)果之間的RSD均小于5%，精密度良好。

表10 方法精密度測試結(jié)果

表11 方法正確度試驗結(jié)果

2.11 正確度試驗

按照1倍定量限濃度、2倍定量限濃度、10倍定量限濃度進(jìn)行加標(biāo)，每個濃度平行測定三次，最終所有回收率均在80%～110%范圍內(nèi)。

3 結(jié) 論

本文建立了一種針對食品中9種維生素的利用微波輔助萃取快速提取，使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速檢測的方法。本文研究了微波輔助萃取食品中維生素的溶劑組成以及萃取液的pH值、微波萃取的功率以及時間等，最終得到了微波輔助萃取的最佳條件為：使用pH=4的甲醇水作為萃取溶劑，在480 W的功率下微波萃取30 s。在此條件下，該方法中所有9種維生素成分均在10～200 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，方法檢出限均低于1.0 ng/mL，定量限均低于3.0 ng/mL，回收率均在80%～110%之間，連續(xù)六次平行實驗結(jié)果之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%。相比較現(xiàn)有技術(shù)，該方法前處理時間大幅縮短，可極大提高分析效率，同時，方法靈敏度高，選擇性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于食品中多種維生素的同時快速檢測。