劉雪凌，林 貝，周莉莉，于 翠，亢 娜

(燕京理工學(xué)院，河北 三河 065201)

蝦殼含有豐富的蛋白質(zhì)、甲殼質(zhì)和酶等，可提取制備活性多肽，作為化妝品中的化工原料或者醫(yī)藥材料[1-3]；京津冀地區(qū)以及其它沿海城市有很多水產(chǎn)公司以及餐飲店，以及在唐山、秦皇島等沿海城市進(jìn)入旅游旺季時(shí)人們大量食用海鮮，產(chǎn)生很多蝦頭、蝦殼固體廢物。如果回收利用蝦頭蝦殼制造高附加值的化工產(chǎn)品活性肽，不僅可以消除環(huán)境污染，還可以增加公司的經(jīng)濟(jì)效益，并且可以安排城鎮(zhèn)職工就業(yè)。

目前，國(guó)內(nèi)外制備多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化學(xué)合成法、基因重組法、分離提取法等。蛋白酶水解法應(yīng)用較為普遍?；瘜W(xué)合成法包括固相合成法和液相合成法。固相合成法多應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室利用基因工程的方法開(kāi)發(fā)各類蛋白多肽類藥物已應(yīng)用于醫(yī)療實(shí)踐中。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，用于蛋白質(zhì)及多肽分離純化的方法日益先進(jìn)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

北極甜蝦蝦殼，山東榮信水產(chǎn)食品集團(tuán)股份有限公司提供；木瓜蛋白酶(800 μg/mg，生化試劑)，山東卡貝因生物科技有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)，山東德彥化工有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)，廊坊市金?；び邢薰?；鹽酸(分析純)，濟(jì)南競(jìng)宇新材料技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，沈陽(yáng)晟達(dá)化工有限公司；磷酸(85%，分析純)，濟(jì)寧市旭力化工有限公司；牛血清蛋白(生化試劑)，西安澤邦生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004B電子分析天平，上海佑科儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，滄州晶碩試驗(yàn)儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；組織搗碎機(jī)，常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司；乳化機(jī)，安徽博進(jìn)化工機(jī)械有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海岐耀儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)，杭州俊升科學(xué)器材有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將北極甜蝦蝦殼放入干燥箱中低溫(約50 ℃左右)干燥，放進(jìn)組織粉碎機(jī)中粉碎成粉末，然后裝入自封袋中備用；實(shí)驗(yàn)時(shí)取適量蝦殼粉，用無(wú)水乙醇脫色，過(guò)濾后留取濾渣，濾渣用去離子水洗滌2～3次后，加入木瓜蛋白酶溶液進(jìn)行酶解制取多肽，同時(shí)用磷酸氫二鈉緩沖溶液和鹽酸調(diào)節(jié)pH，提取制備一段時(shí)間后放進(jìn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行離心分離，取上清液放進(jìn)烘箱進(jìn)行烘干，烘干后進(jìn)行稱量并計(jì)算多肽產(chǎn)率[4]，同時(shí)對(duì)產(chǎn)品測(cè)定水解度測(cè)定[5]。

該制備工藝研究了酶解濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH對(duì)多肽產(chǎn)率的影響，同時(shí)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了最佳工藝研究。

式中：m1——干燥后燒杯和產(chǎn)物的總質(zhì)量，g

m2——空燒杯的質(zhì)量，g

M——稱取原料粉末的質(zhì)量，g

酶解液中氨基酸態(tài)氮通過(guò)甲醛滴定法滴定，水解度的計(jì)算公式如下：

水解度=(酶解液游離氨態(tài)氮含量-酶解前游離氨態(tài)氮含量)/原料總氮含量×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用spss軟件(spss19.0)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響北極甜蝦蝦殼多肽產(chǎn)率的因素[6-7]

2.1.1 不同酶解時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶提取多肽的影響

在5 g北極甜蝦蝦殼粉中放入體積為50 mL酶濃度為1.00%的木瓜蛋白酶，用磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH=7.0，置于55 ℃水浴條件下分別反應(yīng)0 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min。其結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從0 min到180 min時(shí)，多肽產(chǎn)率和水解度先上升后下降，后又稍稍上升，在40 min時(shí)達(dá)到最高。此變化規(guī)律原因可能是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生很多除多肽以外的其它雜質(zhì)，雜質(zhì)附著在底物四周從而降低酶反應(yīng)效率。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)多肽產(chǎn)率和水解度的影響

2.1.2 不同酶濃度對(duì)多肽產(chǎn)率和水解度的影響

在5 g北極甜蝦蝦殼粉中，分別加入酶濃度(酶的質(zhì)量(mg)/溶劑體積(mL))為0.12%、1.00%、2.50%、5.00%、7.50%、10.00%、12.5%、15.0%、17.5%的木瓜蛋白酶50 mL，用磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH=7.0，置于溫度為55 ℃的水浴條件下提取120 min。其結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出：酶濃度從0.12%升高到17.5%時(shí)，多肽產(chǎn)率和水解度逐漸升高，后又降低，在酶濃度為10%時(shí)多肽產(chǎn)率和水解度最高。分析原因可能是多肽產(chǎn)率和水解度達(dá)到最高點(diǎn)后繼續(xù)增加酶濃度導(dǎo)致酶飽和，酶解反應(yīng)趨于緩慢，導(dǎo)致多肽產(chǎn)率下降；并且北極甜蝦蝦殼粉相對(duì)比較堅(jiān)硬，水解度均偏低。

圖2 不同酶濃度對(duì)多肽產(chǎn)率和水解度的影響

2.1.3 酶解pH對(duì)木瓜蛋白酶提取多肽的影響

在5 g北極甜蝦蝦殼粉中放入體積為50 mL酶濃度為1.00%的木瓜蛋白酶，用磷酸二氫鈉分別調(diào)節(jié)pH=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，置于60 ℃水浴條件下反應(yīng)120 min。其結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出：當(dāng)反應(yīng)pH從1.0上升到9.0時(shí)，多肽產(chǎn)率和水解度先上升后下降，后又稍稍上升。這樣的變化規(guī)律原因可能是pH從1.0到3.0時(shí)，由于過(guò)酸導(dǎo)致酶變性失活，從7.0到9.0由于酸性減弱堿性增強(qiáng)，堿性過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致酶變性失活，pH為4.0時(shí)達(dá)到最高值；木瓜蛋白酶最適pH范圍是5.0～7.0，在綜合反應(yīng)條件下，會(huì)稍有變化，因此與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本符合。

圖3 pH對(duì)多肽產(chǎn)率和水解度的影響

2.1.4 酶解溫度對(duì)木瓜蛋白酶提取多肽的影響

在5 g北極甜蝦蝦殼粉中放入酶濃度為1.00%的木瓜蛋白酶50 mL，用磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH=7.0，分別置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的水浴條件下提取120 min。其結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出：當(dāng)溫度從30 ℃升高到70 ℃時(shí)，多肽產(chǎn)率和水解度先上升后緩慢下降，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高。分析原因可能是木瓜蛋白酶的有效溫度范圍為20～80 ℃，最適溫度范圍因反應(yīng)條件而稍有變化，一般為50～60 ℃，溫度高于60 ℃時(shí)，木瓜蛋白酶逐漸鈍化，反應(yīng)性能逐漸下降，但在較高溫度下也增加一些物質(zhì)的溶解度，從而多肽產(chǎn)率下降緩慢。

圖4 酶解溫度對(duì)多肽產(chǎn)率和水解度的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)A酶解時(shí)間(30 min、40 min、60 min)、B酶濃度(7.5%、10%、12.5%)、C 酶解pH(3、4、5)、D酶解溫度(45 ℃、50 ℃、55 ℃)在4因素3水平上進(jìn)行優(yōu)選，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，從極差R值看，B酶濃度>D酶解溫度>A酶解時(shí)間>C酶解pH，所以交酶濃度對(duì)多肽產(chǎn)率的影響效果是最顯著的。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)可知，最佳多肽的制備工藝為：A2B3C2D2，即酶解時(shí)間為40 min、酶濃度為12.5%、酶解pH為4、酶解溫度為50 ℃。

3 結(jié) 論

采用木瓜蛋白酶酶解技術(shù)從北極甜蝦蝦殼粉中制備活性多肽，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)可以得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此研究可以助力水產(chǎn)類企業(yè)綜合利用廢物，生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。通過(guò)研究，可得到以下結(jié)論：

(1)經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，酶解時(shí)間、酶濃度、酶解pH、酶解溫度過(guò)低和過(guò)高都會(huì)影響蝦殼多肽產(chǎn)率和水解度，隨著單因素的變化，多肽產(chǎn)率和水解度會(huì)先升高再降低，其峰值為最佳的多肽制備條件。而從各單因素來(lái)看，多肽產(chǎn)率和水解度最高時(shí)酶解時(shí)間為40 min、酶濃度為10%、酶解pH為4、酶解溫度為50 ℃。

(2)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，可以得出各因素水平的最佳組合為A2B3C2D2，即酶解時(shí)間為40 min、酶濃度為12.5%、酶解pH為4、酶解溫度為50 ℃。

(3)實(shí)驗(yàn)原材料北極甜蝦蝦殼粉比較堅(jiān)硬，在木瓜蛋白酶溶液進(jìn)行酶解制備多肽時(shí)，直接進(jìn)行酶解可能效果會(huì)差一些，因此需要在原材料預(yù)處理方面進(jìn)行研究探索。