董冰 李翠萍 徐瀟萌 王妍 李躍文 李興媚

在女性生殖系統(tǒng)疾病中，卵巢癌是一種最常見的惡性腫瘤，由于疾病早期缺乏明顯的影像學(xué)及生物學(xué)診斷指標(biāo)，大部分患者在確診時(shí)已進(jìn)入晚期，且有研究證實(shí)卵巢癌的5 年生存率低于30%[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中并且長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸的一組非編碼RNA，主要功能是協(xié)助調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。已有研究證明，lncRNA 的不同表達(dá)水平與各類腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移存在不同程度的相關(guān)性[2，3]。多項(xiàng)研究表明，不同的lncRNA 通過各自特定的信號(hào)通路參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲[4，5]。有研究指出，lncRNA 的異常表達(dá)可通過相關(guān)信號(hào)通路定向調(diào)控與其相關(guān)的靶基因，從而參與卵巢癌的發(fā)病過程[6]。lncRNA ARAP1 反義AS1（ARAP1-AS1）是lncRNA家族中的一員，并且多項(xiàng)研究證明，在多種惡性腫瘤患者的血清中檢測(cè)出ARAP1-AS1 表達(dá)水平異常，且與腫瘤惡性程度和病理分型均存在相關(guān)性[7，8]，因此本研究多種試驗(yàn)方法對(duì)卵巢癌的病理分型及治療預(yù)后進(jìn)行分析，為卵巢癌的臨床診斷及靶向治療提供參考。本研究自2019 年1 月開始，于2021 年7 月結(jié)束，所有實(shí)驗(yàn)均在我院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行并完成。

1 材料與方法

1.1 組織樣本獲得、培養(yǎng)及傳代購買人正常卵巢表面上皮系細(xì)胞（IOSE-80）和4 個(gè)人卵巢癌細(xì)胞系（A2780、OVCAR3、CP70 和SKOV3），將細(xì)胞接種于RPMI1640 培養(yǎng)基，將上述細(xì)胞系放置于特定培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后，再經(jīng)過消化、離心后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及MTT 測(cè)定使用特定試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步建立ARAP1-AS1 或多態(tài)腺瘤樣蛋白2（PLAGL2）敲除模型、miR-47353p 模擬物、抑制劑以及相應(yīng)的對(duì)照。轉(zhuǎn)染48h 后，完成細(xì)胞接種，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，添加MTT 試劑，用微孔板分光光度計(jì)在570nm 處測(cè)定其吸光度。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）完成RNA 分離后再將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR采用SYBR 高級(jí)ExTaq Ⅱ輕型Cycler480 儀器，比較基因表達(dá)。驗(yàn)證人卵巢癌腫瘤組織及人正常卵巢上皮組織中ARAP1-AS1 表達(dá)差異。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）實(shí)驗(yàn)完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行細(xì)胞同步接種，再行恒溫培養(yǎng)，加入CCK-8 后，測(cè)定各組細(xì)胞在450nm 處的吸光度值。

1.5 Transwell 遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)用20μL 吸管尖端進(jìn)行人工劃痕，細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行監(jiān)測(cè)，刮痕采用跨孔膜法評(píng)價(jià)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。將細(xì)胞轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，蘇木精染色，顯微鏡計(jì)數(shù)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）用緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，在4℃下加入抗PLAGL2 的一抗體處理膜孵育過夜，采用電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)條帶信號(hào)的灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次。使用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用矯正t檢驗(yàn)和單因素變量方差分析法分別對(duì)兩組內(nèi)或兩組間的結(jié)果進(jìn)行比較分析。采用Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARAP1-AS1 和PLAGL2 在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況為了探究 ARAP1-AS1 和PLAGL2 在正常卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)是否存在差異，我們采用 RT-qPCR 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE-80 相比，ARAP1-AS1 在多種卵巢癌細(xì)胞系（A2780、OVCAR3、CP70 和SKOV3）中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（見圖1A）。同樣，PLAGL2 也在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著上調(diào)（見圖1B）。

圖1 ARAP1-AS1 和PLAGL2 在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)注：與IOSE-80 比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 沉默ARAP1-AS1 抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)ARAP1-AS1 表達(dá)沉默成功（見圖2A）；MTT 實(shí)驗(yàn)表明，ARAP1-AS1 的沉默導(dǎo)致了A2780 和OVCAR3 細(xì)胞活力顯著下降（見圖2B）；集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制 ARAP1-AS1 可抑制A2780 和OVCAR3 細(xì)胞的增殖（見圖2C）；由于ARAP1-AS1 的敲除，A2780 和OVCAR3細(xì)胞的遷移能力受到了抑制（見圖2D）；侵襲實(shí)驗(yàn)表明，ARAP1-AS1 下調(diào)導(dǎo)致卵巢癌侵襲細(xì)胞數(shù)量減少（見圖2E）。

圖2 沉默ARAP1-AS1 抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

2.3 ARAP1-AS1 可 與miR-4735-3p/PLAGL2 相 互結(jié)合敲低ARAP1-AS1 后 PLAGL2 的表達(dá)水平明顯下調(diào)（見圖3A）。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，ARAP1-AS1在A2780 和 OVCAR3 兩種細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)（見圖3B），表明ARAP1-AS1 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。利用DIANA 和starbase 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ARAP1-AS1 和PLAGL2 與同一個(gè)miRNA 具有相互調(diào)節(jié)關(guān)系（見圖3C）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，ARAP1-AS1 可結(jié)合miR-4735-3p，同時(shí)miR-4735-3p 可與PLAGL2 相互結(jié)合（見圖 3D）。通過抗Ago2 和抗IgG RIP 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明上述結(jié)論（見圖3E）。

圖3 ARAP1-AS1 可與miR-4735-3p/PLAGL2 相互結(jié)合

2.4 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p 調(diào)節(jié)PLAGL2的表達(dá)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，抑制miR-4735-3p 的表達(dá)可以明顯上調(diào)PLAGL2 的表達(dá)，同時(shí)對(duì)ARAP1-AS1 進(jìn)行敲減發(fā)現(xiàn)可以抵消部分miR-4735-3p 抑制物的作用，下調(diào)PLAGL2 的表達(dá)（見圖4A）。進(jìn)一步通過Western blot 實(shí)驗(yàn)對(duì)PLAGL2 的蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與mRNA 水平保持一致。表明miR-4735-3p 可以調(diào)節(jié)PLAGL2 的表達(dá)，同時(shí) ARAP1-AS1 可進(jìn)一步對(duì)miR-4735-3p/PLAGL2 通路進(jìn)行調(diào)節(jié)（見圖4B）。

圖4 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p 調(diào)節(jié)PLAGL2 的表達(dá)

2.5 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p/PLAGL2 通路在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用我們敲低OVCAR3 細(xì)胞中ARAP1-AS1 的表達(dá)，抑制miR-4735-3p 的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)一步敲低PLAGL2，并通過RT-qPCR 分析驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染效率（見圖5A）。MTT 實(shí)驗(yàn)顯示，miR-4735-3p 抑制物逆轉(zhuǎn)了sh-ARAP1-AS1 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，并在PLAGL2 沉默后恢復(fù)（見圖5B）。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，抑制miR-4735-3p 的表達(dá)可以增強(qiáng)OVCAR3 細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)敲低 ARAP1-AS1 后OVCAR3 細(xì)胞的增殖能力下降（見圖5C）。同樣，抑制miR-4735-3p 的表達(dá)可以增強(qiáng)OVCAR3 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時(shí)敲低ARAP1-AS1 后OVCAR3細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降（見圖5D）。

圖5 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p/PLAGL2 軸在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，也是全球女性癌癥死亡的主要原因[9]。據(jù)報(bào)道，卵巢癌的死亡率在所有婦科癌癥中排名第一[10]。大多數(shù)卵巢癌患者由于術(shù)后復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差等因素，造成晚期卵巢癌療效不理想[11，12]。近年來，針對(duì)卵巢癌的發(fā)病情況及診療特點(diǎn)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)lncRNAs 在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)[13]，同時(shí)異常表達(dá)的lncRNAs 在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中扮演致癌基因或腫瘤抑制因子的角色[14]。lncRNAs 可以調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響許多重要的生理過程，可以作為染色質(zhì)修飾因子以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子等。本研究發(fā)現(xiàn)ARAP1-AS1 在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)。

經(jīng)過RT-qPCR 檢測(cè)ARAP1-AS1 在卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢內(nèi)皮細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，ARAP1-AS1 在卵巢癌中的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，提示ARAP1-AS1 可能在卵巢癌中扮演著促癌角色。前期有研究證實(shí)lncRNA ARAP1-AS1 被認(rèn)為是膀胱癌的促癌因子[15]。同時(shí)，TCGA數(shù)據(jù)庫和實(shí)驗(yàn)也證實(shí)lncRNA ARAP1-AS1 在宮頸癌和子宮癌中表達(dá)上調(diào)[16]。在泛癌種中的研究表明，ARAP1-AS1 可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要角色，基于此，靶向 ARAP1-AS1 可能是一種有效抑制腫瘤的治療策略。我們通過MTT 及Transwell 實(shí)驗(yàn)表明，敲低ARAP1-AS1 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。

PLAGL2 具有高度保守的結(jié)構(gòu)，可使轉(zhuǎn)錄因子PLAGL2 促進(jìn)特異性基因轉(zhuǎn)錄的激活[17]。多個(gè)學(xué)者研究也證明，PLAGL2 在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出致癌功能，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤和卵巢癌[18～20]。在此，本研究結(jié)果揭示了PLAGL2在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常卵巢內(nèi)皮細(xì)胞系。ARAP1-AS1 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，由于ARAP1-AS1 和PLAGL2 均在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，表明ARAP1-AS1 可能通過 ceRNA 機(jī)制在卵巢癌中發(fā)揮作用。結(jié)合生信分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示了ARAP1-AS1 通過受體化miR-4735-3p 來提高PLAGL2 水平，在卵巢癌中起致癌作用。具體為抑制miR-4735-3p 削弱了敲除ARAP1-AS1 所導(dǎo)致的增殖抑制作用，同時(shí)敲除PLAGL2 可以減弱上述效應(yīng)。敲除 ARAP1-AS1 可以減弱miR-4735-3p 抑制物導(dǎo)致的促增殖和遷移作用。同樣的調(diào)控關(guān)系也在膀胱癌中得到證實(shí)，即ARAP1-AS1 可以通過ceRNA 機(jī)制調(diào)節(jié)miR-4735-3p/NOTCH 軸的表達(dá)[15]。

綜上，通過本項(xiàng)研究我們闡明了ARAP1-AS1通過靶向miR-4735-3p/PLAGL2 通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的惡性行為，這為ARAP1-AS1 可能作為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。