李永偉 王春霞 劉心偉 費冰

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）引起的感染很常見，死亡率高，易引起院內(nèi)感染[1]。近年來，PA 耐藥問題愈發(fā)嚴(yán)重，而對碳青霉烯類藥物的耐藥率也在迅速上升[2，3]。因此，世衛(wèi)組織將耐碳青霉烯類PA 指定為三種關(guān)鍵重點病原體之一[4]。使PA 對碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥性的原因之一是金屬β-內(nèi)酰胺酶，簡稱金屬酶，其編碼的基因通過染色體編碼或者質(zhì)粒介導(dǎo)傳遞耐藥基因[5，6]。以質(zhì)粒為介導(dǎo)的耐藥以R 質(zhì)粒最常見，R 質(zhì)粒存在于革蘭氏陰性菌中，可攜帶耐藥基因，在細(xì)菌間移動[7]。通過消除R 質(zhì)粒，阻止耐藥基因傳遞，使PA恢復(fù)部分或者全部對抗生素的敏感性，對于臨床治療多重耐藥菌感染及防止耐藥菌傳播具有重要意義。目前已明確的金屬酶化學(xué)抑制劑主要有乙二胺四乙酸鹽、2-巰基丙酸、十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）等藥物，但上述藥物可廣泛與人體內(nèi)金屬離子結(jié)合，危害較大，因此尚無法應(yīng)用于臨床治療[8]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯“清熱”效果顯著，具有確切的抗炎癥反應(yīng)作用，對膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征和內(nèi)毒素血癥具有顯著的治療作用[9～11]。研究表明黃連解毒湯可以有效抑制PA 的生長[12]，但目前對黃連解毒湯是否能作為金屬酶抑制劑，消除R 質(zhì)粒，恢復(fù)細(xì)菌對抗生素敏感性的研究還較為缺乏。因此本研究首先從我院篩選出產(chǎn)金屬酶PA，然后通過產(chǎn)金屬酶PA 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗，確定菌株是否存在R 質(zhì)粒，最后觀察黃連解毒湯對R 質(zhì)粒的消除效果，為探究黃連解毒湯的抗菌機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株P(guān)A 均來自我院微生物室分離的各臨床標(biāo)本，通過藥敏試驗篩選出耐碳青霉烯類PA進(jìn)行后續(xù)試驗。質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗受體菌為對疊氮鈉耐藥、對亞胺培南敏感的J53 大腸埃希菌，由我院檢驗科保存。

1.2 主要儀器及設(shè)備CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）、隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海恒躍）、NS-100B 臺式空氣浴恒溫?fù)u床（上海皓莊）、黃連解毒湯（河南省中醫(yī)院中藥房）、LB 肉湯（上海生工）、亞胺培南（Imipenem，IPM）藥敏紙片（10μg）（英國Oxiod 公司）、亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉?。?、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2，BBI 生命科學(xué)有限公司）、Taq PCR Master Mix（2×dye blue，上海生工）、瓊脂糖凝膠粉（上海生工）、4s Red Plus 核酸染色劑（10000×，上海生工）、DNA Marker（100～2 000bp）（上海生工）、疊氮鈉（鄭州派尼）、十二烷基硫酸鈉（上海生工）、0.22μm 針頭式濾過器（上海生工）。

1.3 耐碳青霉烯類PA 金屬酶表型及基因篩選

1.3.1 耐碳青霉烯類PA 金屬酶表型篩選 平板接種按照紙片擴(kuò)散法（K-B 法）進(jìn)行，以亞胺培南藥敏紙片作為底物，滴加0.1M EDTA-Na2水溶液5mL，以濾紙為中心，在距濾紙25.00mm 左右的地方貼上亞胺培南藥敏紙片作為陰性對照，37℃孵育過夜。陽性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：EDTA 與亞胺培南復(fù)合紙片和單亞胺培南紙片抑菌圈直徑差7.00mm[13]。

1.3.2 金屬酶表型陽性PA 的金屬酶基因鑒定 取過夜培養(yǎng)的細(xì)菌單克隆菌落于500mL TE 緩沖液中，使用水浴鍋100℃加熱10min，以10 000r/min 離心1min，上清液即為PCR 反應(yīng)的DNA 模板。金屬酶基因委托上海生工生物設(shè)計PCR 引物（見表1），反應(yīng)體系為50μL，模板加入量為5μL。PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，退火30s，延伸60s，35 個循環(huán)后，72℃延伸10min 終止反應(yīng)。配制1%的瓊脂糖電泳膠，進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果。對PCR 陽性擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工進(jìn)行測序，將測序結(jié)果用NCBI Blast 工具與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對。

表1 PA 金屬酶基因檢測PCR 引物

1.4 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗用二倍稀釋法測定篩選出的金屬酶陽性菌株對疊氮鈉和大腸桿菌J53 對亞胺培南（Imipenem，IPM）的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC），疊氮鈉的起始濃度為3 200μg/mL，IPM 的起始濃度為16μg/mL。以金屬酶陽性PA 為供體菌，J53 為受體菌，在哥倫比亞血平板中進(jìn)行三區(qū)劃線，次日，挑取單克隆菌落，在10mL 的LB 肉湯（37℃，120rpm）中分別培養(yǎng)14h，然后100 倍稀釋，并于37℃，120rpm 條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h。參考王明貴等[14]的方法，將共受體菌按照體積比為4:1 的比例置于37℃孵育過夜后，轉(zhuǎn)移到添加2 000μg/mL 的疊氮鈉和0.5μg/mL 的IPM 的LB 瓊脂[11 株P(guān)A 對疊氮鈉的最高M(jìn)IC 為1 600μg/mL，平 均MIC 為（1 054.55±257.13）μg/mL，J53 對IPM的MIC＜0.25μg/mL]。培養(yǎng)基中若只有結(jié)合子生長則篩選成功，結(jié)合子驗證測定菌株對亞胺培南的MIC。

1.5 黃連解毒湯對PA 接合性質(zhì)粒消除試驗

1.5.1 黃連解毒湯的配制 委托我院中藥房制備黃連解毒湯。簡要程序如下：取黃連解毒湯組方諸藥30g（黃連9g，黃柏6g，黃芩6g，梔子9g，藥量比為3:2:2:3），加純凈水1 200mL，浸泡1h，煎煮保持微沸1h，濾出煎液，藥渣再各加920mL 純凈水，依次煎沸45min 和30min，合并3 次煎液濃縮至200mL，即得黃連解毒湯，以0.22μm 無菌濾器過濾。

1.5.2 產(chǎn)金屬酶PA 耐藥性逆轉(zhuǎn)試驗 準(zhǔn)備8 個無菌離心管，1～6 管為實驗組，第7 管為對照組，第8管為空白對照組。實驗組：黃連解毒湯起始濃度為1 280mg/mL，以LB 肉湯對黃連解毒湯二倍梯度稀釋至第6 管。對照組：第7 管加入5%的十二烷基硫酸鈉?？瞻讓φ战M：第8 管只加同等體積的LB液體培養(yǎng)基。1～8 管中各加入產(chǎn)金屬酶PA 使其終濃度為5×105CFU/mL，37℃共孵育72h。選擇24h，48h 和72h 這三個時間點亞抑菌濃度（即1/2 MIC）管里的菌液，分別進(jìn)行100 倍稀釋，用無菌槍頭吸取10μL 稀釋液，在LB 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)至次日。挑取300 個菌落進(jìn)行影印培養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)種到含8μg/mL（CLSI-2023 M100 中PA對亞胺培南耐藥折點）的IPM 平板和不含IPM 的平板中。消除子判定為在不含IPM 平板中生長，在含IPM 培養(yǎng)基中不生長，即不對亞胺培南耐藥。消除率為消除子/300，結(jié)果以百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 耐碳青霉烯類PA 金屬酶表型及基因篩選結(jié)果在68 株耐碳青霉烯類PA 中，通過表型篩選出陽性菌株23 株，陽性率為33.82%（23/68），從23 株菌株中篩選金屬酶基因陽性的有11 株（見圖1），占陽性菌株的47.83%（11/23），這11 株菌株基因型均為blaIMP基因型，無blaNDM型。

圖1 PA 金屬酶blaIMP 基因型篩選結(jié)果

2.2 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗從11 株blaIMP基因型為陽性的PA 中進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗，有3 株R 質(zhì)粒接合試驗陽性，占27.27%（3/11）。菌株編號分別為PA155、PA156、PA161。

2.3 黃連解毒湯對產(chǎn)金屬酶PA 的MIC 黃連解毒湯對菌株P(guān)A155、PA156 和PA161 的MIC 分別為320mg/mL、320mg/mL 和160mg/mL。

2.4 黃連解毒湯對產(chǎn)金屬酶PA 的質(zhì)粒消除試驗3株產(chǎn)金屬酶PA PA155、PA156 和PA161 使用黃連解毒湯（實驗組）處理24h 均無消除子產(chǎn)生；處理48h 產(chǎn)生消除子分別為2 株、3 株和2 株，平均消除率為0.78%；處理72h 產(chǎn)生消除子分別為5 株、5 株和4 株，平均消除率為1.56%。使用5%的SDS（對照組）處理24h 僅有PA161 產(chǎn)生1 株消除子，平均消除率為0.11%；處理48h PA155、PA156 和PA161產(chǎn)生消除子分別為10 株、4 株和8 株，平均消除率為2.44%；處理72h 產(chǎn)生消除子分別為8 株、4 株和5 株，平均消除率為1.89%（見表2）。

表2 黃連解毒湯和5%SDS 在不同時間下對產(chǎn)金屬酶PA質(zhì)粒的消除率（%）

3 討論

PA 是導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要病原菌，在革蘭氏陰性菌中的分離率僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，位列第三[15]。PA 屬于革蘭氏陰性非發(fā)酵菌，在各種環(huán)境中廣泛分布。由于該菌對多種抗菌藥物天然耐藥，加之易獲得性耐藥，可引發(fā)多種嚴(yán)重感染，甚至危及生命，因此多重耐藥PA 引起的感染性疾病已成為公共衛(wèi)生醫(yī)療面臨的巨大挑戰(zhàn)[16]。PA 的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，而金屬酶導(dǎo)致的PA 耐藥現(xiàn)象尤為嚴(yán)重[17～19]。產(chǎn)金屬酶PA 在世界范圍內(nèi)的流行蔓延大大增加了院內(nèi)感染患者數(shù)量，尤其是老年患者和免疫功能缺陷患者的發(fā)病率和死亡率上升，造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)，對人類健康造成嚴(yán)重威脅[20]。

中草藥在現(xiàn)代抗耐藥菌感染方面治療效果顯著，黃連解毒湯作為清熱解毒的經(jīng)典方劑，因其對革蘭氏陰性菌的主要致病物質(zhì)-脂多糖誘導(dǎo)的病理損傷有顯著的拮抗作用，因此證明其對耐藥菌的感染具有潛在治療作用[21]。本研究通過篩選出存在R 質(zhì)粒的產(chǎn)金屬酶PA，探究黃連解毒湯對產(chǎn)金屬酶PA 的R 質(zhì)粒的消除作用，證明黃連解毒湯可以消除R 質(zhì)粒，恢復(fù)細(xì)菌對抗生素的敏感性。黃連解毒湯與使用5% SDS 相比，消除率要比SDS 低，但是SDS 毒性較強(qiáng)，而黃連解毒湯安全無毒，在臨床應(yīng)用廣泛，與5% SDS 化學(xué)抑制劑相比，有更廣闊的研究前景。