胡 娟， 蔣世秋， 檀佳璐， 楊 嵐， 王 強， 李巖松

（1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院麻醉手術(shù)部和腦科學中心，西安 710061； 2.陜西中醫(yī)藥大學，咸陽 712046）

膿毒癥及膿毒癥休克的死亡率可達60%[1]。腸道動力障礙是膿毒癥的常見并發(fā)癥，可導致腸道菌群聚集和移位，加重多器官功能衰竭，往往導致患者預后較差[2]。恢復腸道動力可能是改善膿毒癥患者預后的重要手段之一，但尚無有效手段改善膿毒癥患者腸道動力。膿毒癥患者血小板呈活化狀態(tài)，其分子標志物CD40 配體（CD40 Ligand，CD40L）濃度與預后呈負相關(guān)[3]。既往研究[4]發(fā)現(xiàn)，使用西洛他唑抑制血小板活化可降低膿毒癥小鼠腸道黏膜屏障通透性，改善預后，且該作用與西洛他唑可能存在的增強心肌收縮力、擴張血管和降低炎性因子釋放作用無關(guān)。腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞（entericglial cell，EGC）是腸道組織中調(diào)控動力的關(guān)鍵細胞，已證實反應(yīng)性EGC 可損傷腸道神經(jīng)元并降低內(nèi)毒素血癥小鼠腸道動力[5]。然而，西洛他唑是否可以通過抑制血小板活化調(diào)控EGC 活性影響膿毒癥小鼠腸道動力尚未見報道。基于此，本研究擬探索西洛他唑?qū)δ摱景Y小鼠腸道動力的作用及其相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 無特定病原體（specific pathogen Free，SPF）級C57BL/6 雄性小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心。所有小鼠飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，模擬正常白天黑夜環(huán)境，食物和飼料可自由獲取。實驗前禁食8 h，不限制飲水。實驗過程遵循實驗動物保護及倫理規(guī)范，并取得西安交通大學生物醫(yī)學倫理委員會批準（2018-107）。將小鼠隨機分為ctrl+溶劑（cmc）組、ctrl+西洛他唑（cilo）組、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）+cmc 組、LPS+cilo 組，每組25～30只。其中8～10 只用于結(jié)腸排珠實驗和糞便性狀檢測，6～8 只用于血清提取和檢測，4～6 只用于結(jié)腸移行性復合運動（CMMC）監(jiān)測，6～8 只用于免疫印跡檢測。實驗中非必須處死的小鼠于實驗結(jié)束后采用脫頸法執(zhí)行安樂死。

1.1.2 主要試劑 西洛他唑購買自美國Med－ChemExpress 公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 試劑盒均購自深圳欣博盛生物科技有限公司；可溶性CD40 配體（soluble CD40L，sCD40L）ELISA 試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）兔抗購自GeneTex 公司；B 細胞表面抗原CD40 兔抗購自Abcam 公司；TNF 受體關(guān)聯(lián)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）鼠抗購自Santa Cruz Biotechnology 公司；三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗購自ABcolonal 公司；山羊抗兔及抗鼠二抗均購自笛醫(yī)生物科技有限公司。

1.2 膿毒癥模型構(gòu)建

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，按照前述分組及數(shù)量隨機分配。在LPS+cilo 組和LPS+cmc 組，采用腹腔注射5 mg·kg-1的LPS 建立內(nèi)毒素血癥模型，在ctrl+cilo 組和ctrl+cmc 組小鼠腹腔注射等體積鹽水作為對照。在ctrl+cilo 組和LPS+cilo組，用0.5%羧甲基纖維素鈉鹽（carboxymethyl cellulose sodium salt，CMC-Na）稀釋西洛他唑（cilo，10 mg·kg-1），并于腹腔注射LPS 或鹽水前2 h 和注射后12 h 灌胃給藥。ctrl+cmc 組和LPS+cmc組小鼠僅給予等體積cmc。LPS 或鹽水注射后48 h 進行后續(xù)實驗檢測。

1.3 腸道動力學觀察

1.3.1 結(jié)腸排珠實驗 實驗前對小鼠禁食8 h，不限制飲水。使用異氟烷對小鼠進行吸入麻醉，用帶刻度的軟質(zhì)塑料管將直徑2 mm 的塑料珠通過其肛門推入結(jié)腸至2 cm 處。退出軟質(zhì)塑料管，將小鼠擺成仰臥位，待其翻正反射恢復后開始計時，以塑料珠排出肛門時間作為截直點，這段時間記錄為結(jié)腸轉(zhuǎn)運時間。

1.3.2 糞便干重及含水量測定 將小鼠分籠單獨飼養(yǎng)，在早晨10～11 點禁食、禁水。收集每只小鼠該時間段的糞便并稱重，記錄為糞便濕重，然后將小鼠糞便放入60 ℃烘箱過夜，再次稱重并將該質(zhì)量記錄為糞便干重。

1.4 CMMC 監(jiān)測

實驗前禁食8 h，對小鼠實施頸椎脫位安樂死后，沿腹正中線打開腹腔，小心游離結(jié)腸，于回盲部及直腸最遠端離斷，去除多余的腸系膜，結(jié)腸近端為oral 端，遠端為anal 端。輕柔地擠出結(jié)腸內(nèi)容物后，用K 氏液（NaCl 118 mol·L-1，KCl 4.6 mol·L-1，CaCl22.5 mol·L-1，MgSO41.2 mol·L-1，NaH2PO41 mol·L-1，NaHCO325 mol·L-1，葡萄糖5.6 mol·L-1，pH7.4）沖洗腸腔后將其置于裝有K氏液的器官浴中。通過置于器官浴正上方7～8 cm高度的攝像頭記錄結(jié)腸的收縮活動。使用MATLAB R2018a 編寫的邊緣檢測系統(tǒng)對視頻記錄進行分析。構(gòu)建位于結(jié)腸近端-遠端的每個點所在腸截面直徑的時空地圖，并用于量化CMMC的頻率以及它們傳播的速度和長度。

1.5 Western blot 檢測小鼠結(jié)腸組織中GFAP、B細胞表面抗原CD40、TRAF6 蛋白表達量

取小鼠結(jié)腸組織，加入蛋白裂解液后充分研磨，超聲震蕩，離心后取上清，用BCA 法對結(jié)腸蛋白定量后將其煮沸變性備用。電泳并轉(zhuǎn)膜后，脫脂封閉2 h。然后加入GFAP（1∶5 000）、B 細胞表面抗原CD40（1∶1 000）、TRAF6（1∶1 000）一抗過夜。第2 天加入二抗孵育后顯色。使用上海勤翔ChemiScope 系列化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行成像并分析條帶灰度值。

1.6 ELISA 檢測小鼠血清sCD40L、TNF-α、IL-1β 及結(jié)腸勻漿TNF-α、IL-1β 濃度

小鼠腹腔注射5 mg·kg-1LPS 或等體積生理鹽水48 h 后，采用2%～3%異氟烷麻醉小鼠，摘取眼球取全血，室溫靜置1 h 后，2 000×g 離心10 min取上層血清，用于檢測sCD40L、TNF-α 和IL-1β水平。采集小鼠結(jié)腸組織勻漿用于檢測炎性因子TNF-α、IL-1β 水平。實驗流程按相應(yīng)ELISA 試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Graphpad Prizm 軟件完成，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（Turkey 事后檢驗）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對結(jié)腸動力的影響

與ctrl+cmc 組小鼠相比，LPS+cmc 組小鼠結(jié)腸排珠時間延長（P 均<0.05），糞球數(shù)量減少（P<0.05），糞便質(zhì)量和內(nèi)容物減少（P<0.05）；而服用西洛他唑抑制血小板活化的LPS+cilo 組小鼠與LPS+cmc 組相比結(jié)腸排珠時間縮短（P<0.05），糞球數(shù)量和糞便質(zhì)量及內(nèi)容物增加（P 均<0.05），見圖1。

圖1 西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對腸道動力的影響

2.2 西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對CMMC 的影響

與ctrl+cmc 組相比，膿毒癥LPS+cmc 組小鼠CMMC 的頻率減慢（P<0.05），范圍縮?。≒<0.05），速度減慢P<0.05）。服用西洛他唑抑制血小板活化的LPS+cilo 組小鼠較LPS+cmc 組CMMC 頻率增加（P<0.05），CMMC 范圍擴大（P<0.05），CMMC速度加快（P<0.05），改善了膿毒癥小鼠腸道運動模式，見圖2。

圖2 西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對CMMC 的影響

2.3 西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對血清sCD40L 水平的影響

與ctrl+cmc 組相比，LPS+cmc 組小鼠血清sCD40L 水平提高（P<0.05），服用西洛他唑抑制血小板活化的LPS+cilo 組小鼠sCD40L 水平降低（P<0.05），見圖3。

圖3 ELISA 法檢測西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對血清sCD40L 水平的影響

2.4 Western blot 檢測西洛他唑抑制血小板活化對膿毒癥小鼠結(jié)腸B 細胞表面抗原CD40、TRAF6和GFAP 表達的影響

與ctrl+cmc 組相比，膿毒癥LPS+cmc 組小鼠結(jié)腸組織勻漿B 細胞表面抗原CD40 表達增加（P<0.05），且TRAF6 及GFAP 水平均升高（P 均<0.05）。服用西洛他唑抑制血小板活化的LPS+cilo 組小鼠結(jié)腸勻漿中B 細胞表面抗原CD40、TRAF6 和GFAP 水平均較LPS+cmc 組均下降（P均<0.05），見圖4。

圖4 Western blot 檢測西洛他唑抑制血小板活化對膿毒癥小鼠結(jié)腸B 細胞表面抗原CD40、TRAF6 和GFAP 表達的影響

2.5 西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對血清及結(jié)腸組織IL-1β 和TNF-α 水平的影響

與ctrl+cmc 組相比，膿毒癥LPS+cmc 組小鼠結(jié)腸組織勻漿及血清中IL-1β 和TNF-α 水平均升高（P 均<0.05）；服用西洛他唑抑制血小板活化的LPS+cilo 組小鼠結(jié)腸IL-1β 和TNF-α 水平較LPS+cmc 組均降低（P 均<0.05），但血清炎性因子水平差異均無統(tǒng)計學意義（P 均>0.05），見圖5。

圖5 ELISA 檢測西洛他唑抑制膿毒癥小鼠血小板活化對結(jié)腸和血清炎性因子水平的影響

3 討論

腸道損傷往往出現(xiàn)在膿毒癥病程早期，是多器官功能障礙綜合征的重要表現(xiàn)[6]。腸道動力下降可致腸腔內(nèi)容物堆積、壓力增高、胃腸道供血供氧不足[6]，進而誘發(fā)腸腔黏膜屏障損傷，導致細菌和毒素向全身轉(zhuǎn)移，形成二次感染，加重或誘發(fā)多器官功能衰竭[7-8]。因此，改善腸道動力可能是改善膿毒癥預后的關(guān)鍵策略之一。

膿毒癥的動物模型一般分為3 類：細菌感染模型、內(nèi)毒素模型和腹膜炎模型。盲腸結(jié)扎穿刺是一種腹膜炎模型，被認為是膿毒癥研究的金標準。然而，該模型需要行腹部外科手術(shù)，可能會干擾胃腸道運動，誘導術(shù)后腸梗阻發(fā)生，進而膿毒癥患者術(shù)后腸梗阻可能會掩蓋鎮(zhèn)靜劑對胃腸蠕動的影響。此外，與使用細菌感染相比，LPS 誘導的內(nèi)毒素模型更穩(wěn)定，因此本研究對小鼠注射5 mg·kg－1的LPS 建立膿毒癥模型。

血小板不僅是凝血過程的主要參與者，更為重要的是其具有強大的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)能力，并參與天然免疫防御反應(yīng)。膿毒癥患者血小板往往處于活化狀態(tài)，抑制血小板活化可改善膿毒癥患者預后[9]?？赡苁腔谝种蒲“寤罨山档头闻菝氀芡ㄍ感浴⒕徑饧毙院粑狡染C合征[10]，也可能是由于抑制血小板活化可改善腸道屏障功能，降低菌血癥和毒血癥嚴重性[11]。氯吡格雷和阿司匹林雖然在眾多血小板激活抑制劑中脫穎而出被廣泛應(yīng)用于臨床，但通常具有明顯的胃腸道副作用和出血風險，而使用西洛他唑胃腸道出血風險低，抑制血小板的效果穩(wěn)定[12]。本研究結(jié)果顯示，抑制血小板活性可以增加CMMC 頻率、擴大CMMC 范圍、加快CMMC 速度，由此可縮短結(jié)腸排珠時間、增加糞便數(shù)量和糞球質(zhì)量、降低糞便含水量，可有效促進腸道細菌及腸道毒素排出，提示抑制血小板可能是改善膿毒癥腸道動力的重要策略，為后續(xù)臨床研究提供了實驗室依據(jù)和理論支持。

腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）是包埋在腸壁內(nèi)的復雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，有調(diào)控腸道的吸收、分泌、運動、屏障、免疫等功能[13]，主要由腸神經(jīng)元和EGC 構(gòu)成。在不同物種體內(nèi)，EGC 數(shù)量是腸神經(jīng)元的1 倍（小鼠）到7 倍（人類）[14]，并緊密包繞在神經(jīng)元周圍。鑒于EGC 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細胞在形態(tài)和功能上具有相似性，有研究[15]認為其對腸道功能調(diào)控具有重要作用。前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，IL-1β 和TNF-α 干預可誘導靜息態(tài)EGC 轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性EGC，其條件培養(yǎng)基可誘導腸道原代神經(jīng)元突起減少、凋亡增加。在LPS 誘導的膿毒血癥模型中，增加的反應(yīng)性EGC及其釋放的炎性因子可導致神經(jīng)元減少及腸道動力下降，提示反應(yīng)性EGC 可能通過釋放炎性因子損傷腸神經(jīng)元而抑制腸道動力[5]。因此，調(diào)控EGC可能是改善膿毒癥腸道動力的又一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

臨床證據(jù)表明，膿毒癥患者血清中sCD40L水平較高[16]，且其濃度與死亡率呈正相關(guān)[3]。血液中95%以上的sCD40L 源于活化血小板[17]，并可調(diào)節(jié)內(nèi)源性免疫[18]。因此，血漿中sCD40L 與CD62P 及PAC-1 一樣可作為血小板活化的生物標志物[19]。由于血小板源性CD40L 可以激活星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，誘導高血壓小鼠血腦屏障損傷[17]，推測CD40L 亦可誘導EGC 向反應(yīng)性EGC 轉(zhuǎn)變并發(fā)揮相應(yīng)作用。研究[4]證實，EGC 表達sCD40L 特異性配體CD40，也發(fā)現(xiàn)抑制血小板活化可降低血清sCD40L、下調(diào)CD40LCD40-TRAF6 信號通路，減少EGC 活化標志物GFAP 表達，提示抑制血小板活性可減少靜息態(tài)EGC 向反應(yīng)性EGC 轉(zhuǎn)化。基于前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性EGC 條件培養(yǎng)基可誘導腸道原代神經(jīng)元突起減少、凋亡增加，推測炎性因子可能是引起神經(jīng)元損傷的重要介質(zhì)，并最終導致腸道動力下降。本研究證實，抑制血小板活化可降低腸道組織TNF-α 和IL-1β 水平，但并不降低血清中這兩種炎性因子濃度，提示抑制血小板活化可能通過減少反應(yīng)性EGC 降低炎性因子釋放水平，進而改善腸道動力。

綜上所述，活化血小板通過CD40L-CD40-TRAF6 通路促進EGC 轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨疎GC，增加后者炎性因子釋放水平，最終引起膿毒癥腸道動力下降。抑制血小板活化可降低EGC 活化水平，緩解炎癥，為改善膿毒癥腸道動力提供了新的策略。