馬成鳳， 李 帆， 吳 曦， 馬秀慧， 張 靜， 楊夢怡， 馬占兵，陸 宏， 霍正浩， 黨 潔

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004）

指長比是指各指長度的比值，本研究指人類同一只手食指指長（2D）和無名指指長（4D）的比值，女性大于男性，是個體出生前宮內(nèi)性激素暴露水平的潛在生物學標記[1-2]。2D∶4D 與孕期母體宮內(nèi)雄激素和雌激素的比例密切相關，雄激素水平與指長比呈負相關[3]。研究[4-6]顯示，性激素代謝途徑相關基因多態(tài)性，如雄激素受體（androgen receptor，AR）基因、LIN28B 基因、CYP19A1 基因等與指長比存在關聯(lián)性。2018 年，全基因組關聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)11 個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點與指長比強相關，能夠解釋平均3.8%的指長比差異[7]。由于性激素代謝途徑復雜，作用區(qū)域廣泛，不僅可影響機體的許多表型，同時，也可能影響指長比的形成。因此，指長比成為個體發(fā)育和生理功能外在宏觀生物學的標記，受到生物人類學和臨床醫(yī)學的廣泛關注[8]。

2 型3α-羥基類固醇脫氫酶醛酮還原酶（AKR1C3）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）和睪酮5-α 還原酶Ⅱ（SRD5A2）基因在雄激素合成代謝過程中發(fā)揮重要作用。研究[9]證實，AKR1C3 可以促進雄激素、雌激素和孕激素與它們的同源無活性代謝物相互轉(zhuǎn)化，優(yōu)先將雄烯二酮轉(zhuǎn)化為睪丸激素，是細胞合成睪酮和二氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）的關鍵酶；SHBG 既可以調(diào)節(jié)體內(nèi)雄激素水平，也可以介導性激素的信號傳導并調(diào)節(jié)其生物利用度[10]；SRD5A2 是雄激素合成過程中將睪酮轉(zhuǎn)化為DHT 的關鍵酶，能夠增強DHT 的生物活性以及與AR 的親和力，在性別分化和雄激素代謝中起到核心作用[11]。目前，有關雄激素代謝相關基因參與指長比形成的研究鮮有報道。本研究旨在分析健康人群AKR1C3、SHBG、SRD5A2基因6 個SNP 位點與指長比的相關性，進一步探討雄激素對指長比形成的調(diào)控機制，為人類指長比發(fā)育的生物學基礎提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取寧夏醫(yī)科大學2019 級在校大學生799名為研究對象，男性396 名，女性403 名，平均年齡（19.18±0.76）歲。所有參與者均為寧夏籍大學生，三代祖居寧夏，彼此無血緣關系，無既往慢性疾病史及手術外傷史、無手部殘疾或手部精細結(jié)構缺失。本研究已通過寧夏醫(yī)科大學倫理審查委員會批準（寧醫(yī)大倫理第2022-G185 號），所有參與者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 指長比的測量及分析 通過數(shù)碼相機（Canon EOS M3，日本）提取雙手掌面照片。照片采集時，被測者雙手手掌向上，手指并攏，用力伸直放于桌面，由專門培訓的研究人員依據(jù)統(tǒng)一標準和要求［右側(cè)放置標準直尺（30 cm）作為標準，保持拍攝距離為垂直于手部正上方50 cm 處］進行拍攝，將照片（剔除手指有創(chuàng)傷的樣本）導入圖像分析軟件Image-Pro Plus（Media Cybernetics，Inc.），參考軟件操作手冊，對各研究對象左手和右手各指（拇指除外）長度，即從近體側(cè)手指折痕中點到指尖中點的直線距離進行測量。所有測量均經(jīng)過2 人分別重復3 次后完成，最終取測量均值完成雙手指長比的計算。

1.2.2 SNP 篩選 采用基因組SNP 在線數(shù)據(jù)庫SNPinfo Web Server（http：//snpinfo.niehs.nih.gov/）進行SNP 位點篩選。要求所選位點需滿足：1）涵蓋基因上下游1 000 kb 范圍，包括外顯子、內(nèi)含子、5’-UTR、3’-UTR 等區(qū)域；2）最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥0.05；3）有過文獻報道[12-15]的位點。最終選取rs12529、rs1937845、rs523349、rs727428、rs3760213 和rs6259共6 個SNP 位點進行研究，所有SNP 位點信息見表1。

表1 AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因6 個SNP 位點信息

1.2.3 DNA 提取及基因分型 使用一次性真空采血管（EDTAK2 抗凝管，5 mL）采集所有研究對象靜脈血5 mL，低溫（0～4 ℃）轉(zhuǎn)運，隨后快速置于-80 ℃冰箱凍存。所有DNA 樣本采用血液基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN）［天根生化科技（北京）有限公司］提取全血細胞DNA，采用多重聚合酶鏈反應技術（北京諾禾致源科技股份有限公司）進行基因分型，各位點引物信息見表1。PCR 反應分兩輪進行，第一輪：95°C 預變性15 min；94 °C 30 s，60 °C 10 min，72 °C 30 s，共4 個循環(huán)；94°C 30 s，60°C 1 min，72°C 30 s，共24 個循環(huán)。第二輪：95°C 預變性15 min；94°C 30 s，60°C 4 min，72°C 30 s，共5 個循環(huán)；94°C 30 s，65°C 1 min，72°C 30 s，共10 個循環(huán)。隨后，通過CA2 吸附柱純化PCR 產(chǎn)物后于Illumina X-10 測序平臺上機測序，并采用Illumina RTA 軟件進行質(zhì)量控制和原始數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

利用Haploview 4.2 軟件完成Hardy-Weinberg 遺傳平衡（HWE）檢驗，并進行單倍型的構建及連鎖不平衡分析。利用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。不同性別2D∶4D 比較采用t 檢驗。基因型及等位基因頻率采用Pearson 卡方檢驗。不同性別采用單因素方差分析方法比較目標基因不同基因型與人群間指長比分布的差異。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別2D∶4D 分布比較

女性左手2D∶4D（t=-2.903，P=0.004）及右手2D∶4D（t=-2.339，P=0.02）均高于男性，見表2。

表2 不同性別2D∶4D 分布比較

2.2 AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因6 個SNP 基因型及等位基因頻率分布

全部6 個SNP 位點基因型的分布符合HWE定律（P＞0.05），提示樣本具有較好的代表性。

AKR1C3 基因的rs12529 位點基因型頻率分布在性別間存在差異（χ2=7.806，P=0.02），但其等位基因頻率在性別間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SHBG 基因rs3760213（χ2=6.642，P=0.036；χ2=5.873，P=0.015）和rs6259（χ2=7.468，P=0.024；χ2=4.481，P=0.034）位點的基因型和等位基因型頻率在性別間差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因6 個SNP 位點基因型和等位基因頻率［例（%）］

單倍型分析結(jié)果顯示，AKR1C3 基因的rs12529-rs1937845 位點與 SHBG 基因的 rs727428 -rs3760213-rs6259 位點存在強連鎖（圖1），然而，只有后者構建得到的3 種單倍型在男女間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.354，P=0.042），見表4。

圖1 AKR1C3、SHBG 和SRD5A2 基因6 個SNP 位點連鎖不平衡分析

表4 AKR1C3 和SHBG 基因SNP 單倍型性別間差異分析［例（%）］

2.3 AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因6 個SNP 基因型頻率與不同2D∶4D 的關系

AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因的6 個SNP基因型頻率均與不同性別2D∶4D 無關（P 均＞0.05），見表5。

表5 AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因6 個SNP 位點基因型與不同性別2D∶4D 的關系（±s）

表5 AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因6 個SNP 位點基因型與不同性別2D∶4D 的關系（±s）

女性2D∶4DF 值P 值男性2D∶4DF 值P 值AKR1C3 rs12529LGG0.996±0.0330.5750.5630.961±0.0340.4040.668 CG0.968±0.0310.957±0.039 CC0.974±0.0270.962±0.022 RGG0.962±0.0340.8830.4140.959±0.0330.3640.695 CG0.965±0.0320.956±0.033 CC0.972±0.0360.959±0.018 rs1937845LGG0.966±0.0330.4150.6600.960±0.0340.3840.682 AG0.969±0.0310.957±0.039 AA0.971±0.0250.956±0.026 RGG0.962±0.0330.5280.5900.959±0.0340.2080.812 AG0.966±0.0330.957±0.032 AA0.967±0.0300.954±0.023 SRD5A2 rs523349LGG0.961±0.0302.7240.0670.961±0.0351.4280.241 CG0.968±0.0320.957±0.037 CC0.972±0.0330.964±0.033 RGG0.966±0.0340.8540.4260.955±0.0322.3850.093 CG0.961±0.0320.958±0.032 CC0.966±0.0360.965±0.034基因SNP類型 基因型

續(xù)表

表5 AKR1C3、SHBG、SRD5A2 基因6 個SNP 位點基因型與不同性別2D∶4D 的關系（±s）

L 為左手，R 為右手。

基因SNP類型基因型女性2D∶4DF 值P 值男性2D∶4DF 值P 值SHBGrs727428LTT0.970±0.0331.0940.3360.961±0.0340.2390.788 TC0.965±0.0330.960±0.034 CC0.969±0.0270.957±0.043 RTT0.962±0.0350.1560.8560.959±0.0340.4870.615 TC0.963±0.0330.959±0.033 CC0.965±0.0300.955±0.031 rs3760213LGG0.968±0.0320.7060.4940.961±0.0361.9220.148 AG0.964±0.0320.954±0.036 AA0.972±0.0300.965±0.029 RGG0.964±0.0340.2070.8130.959±0.0320.3650.695 AG0.962±0.0330.956±0.035 AA0.962±0.0280.962±0.034 rs6259LGG0.968±0.0320.8980.4080.961±0.0361.4890.227 AG0.964±0.0320.955±0.036 AA0.976±0.0310.965±0.029 RGG0.964±0.0340.2900.7480.959±0.0320.2060.814 AG0.961±0.0330.957±0.034 AA0.965±0.0310.962±0.034

3 討論

指長比常是判斷胚胎起源成人性疾?。╢etal origins of adult disease，F(xiàn)OAD）的宏觀生物學標記[1，8]。近年來，國內(nèi)外許多文獻報道，指長比與精神分裂癥[16]、不育癥[17]、冠心病[18]及多種腫瘤[19]的發(fā)生存在相關性，這也使得指長比的研究成為探討環(huán)境、遺傳和行為等因素相互作用對FOAD 影響的熱點之一。

2002 年，Manning 等[20]推測AR 基因可能會影響人類指長比的形成。AR 基因CAG 重復次數(shù)與男性右手2D∶4D 呈正相關[21]。之后，對基因多態(tài)性與指長比的關聯(lián)性進行了一系列的研究，包括3 個不同人群的GWAS，分別發(fā)現(xiàn)LIN28B、SMOC1、FLI1、HOXD11/12 等基因/位點與指長比存在關聯(lián)性，能解釋3.8%的指長比形成差異[7]。這些基因主要集中影響指骨發(fā)育和性激素代謝途徑。性激素代謝是非常復雜的過程，涉及許多關鍵酶，編碼這些酶的基因多態(tài)性往往與其酶活性有關，由此影響指骨的發(fā)育與分化，最終影響2D∶4D 的形成[22]。因此，以性激素代謝相關基因為核心探討指長比的形成成為目前的關注要點。

AKR1C3、SHBG 和SRD5A2 基因是雄激素合成代謝途徑的關鍵基因，其可能通過影響雄激素合成代謝及雌-雄激素的相互轉(zhuǎn)換，干擾胚胎期雌雄激素的比例，參與指長比的形成。本研究結(jié)果顯示，AKR1C3 基因的rs12529 位點基因型、SHBG 基因的rs3760213 和rs6259 位點基因型和等位基因型頻率雖然在不同性別間存在差異，但全部6 個SNP 位點基因型頻率與指長比（2D∶4D）無關。

AKR1C3 是醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）超家族成員中催化效率最高的酶，位于雄激素合成代謝通路的終末端，能夠促進雄烯二酮與睪酮的相互轉(zhuǎn)化，促使雌激素轉(zhuǎn)化為17β 雌二醇等[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌[23]、前列腺癌[9]、結(jié)腸癌[24]、膠質(zhì)瘤[25]等多種激素相關性腫瘤均與AKR1C3 的異常高表達密切相關。同時，有研究[26]發(fā)現(xiàn)，前列腺癌、胃癌和腦瘤患者的2D∶4D 降低，而乳腺癌患者的2D∶4D 增高，因此，探討AKR1C3表達與指長比的相關性，對于尋找腫瘤發(fā)生外在宏觀生物學標記具有重要臨床意義。rs12529 位于AKR1C3 基因第一外顯子，為C-G 的錯義突變。本研究發(fā)現(xiàn)，rs12529 各基因型頻率存在性別差異，攜帶CG 基因型的男性多于女性。多項研究已證實，該位點CG 基因型及G 等位基因型可能作為保護性因素參與前列腺癌[27]、結(jié)腸癌[28]等的發(fā)生發(fā)展，這可能與其能夠降低AKR1C3 表達水平進而抑制血清中前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）水平有關[29]。AKR1C3基因rs12529 與位于啟動子區(qū)的rs1937845 位點處于強連鎖不平衡狀態(tài)，二者可能通過協(xié)同作用影響機體雄激素的代謝水平。然而，本研究并未發(fā)現(xiàn)rs1937845 位點基因型在不同性別間存在差異，這可能是由于AKR1C3 主要影響成人睪丸外雄激素產(chǎn)生水平的差異，對指長比的形成并無影響。

SHBG 作為一種運輸類固醇激素的糖蛋白，對雄激素（如DHT）和睪酮的親和力比對雌激素高5 倍，是雄激素轉(zhuǎn)運的關鍵運輸載體，通過與血液循環(huán)中的性激素特異性結(jié)合，發(fā)揮動態(tài)調(diào)節(jié)血液中性激素水平的作用[10，30]。rs3760213 和rs6259位點基因多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)與血清SHBG 及TT 水平相關，攜帶rs3760213 A 等位基因及rs6259 A 等位基因的個體，血清SHBG 及TT 濃度上升[31]。rs6259 是SHBG 外顯子8 中的錯義SNP 位點，能導致第356 位密碼子中的天冬酰胺被天冬氨酸取代（D356N），從而增加了一個額外的N-連接糖基化位點，降低SHBG 的血漿清除率，延長SHBG 的半衰期[32]。rs3760213 位于SHBG 基因第一內(nèi)含子，可能通過影響SHBG 基因選擇性剪切調(diào)節(jié)SHBG 表達水平。雖然在本研究中并未發(fā)現(xiàn)rs727428 各基因型分布存在性別差異，但通過單倍型分析發(fā)現(xiàn)，SHBG rs727428-rs3760213-rs6259（T-A-A）單倍型在男性中的比例高于女性，提示三者可能通過協(xié)同作用促進SHBG 的表達。由于SHBG 能顯著調(diào)節(jié)機體雄激素代謝水平，而與SHBG 表達相關的多囊卵巢綜合征和前列腺癌患者也被發(fā)現(xiàn)存在2D∶4D 下降的趨勢[33]，或許二者有一定關聯(lián)。然而，本研究并未發(fā)現(xiàn)SHBG rs3760213 和rs6259 位點與指長比存在相關性。因此，本研究尚不足以認定SHBG 基因多態(tài)性與指長比無相關性，尚需在更大樣本中，通過增加檢測位點進一步驗證。

SRD5A2 基因在雄激素合成過程中能夠?qū)⒉G酮轉(zhuǎn)換為更具有活力的DHT，增強DHT 與AR的親和力[34]，是前列腺癌、尿道下裂、先天性腎上腺增生、小陰莖等男性化疾病的主要易感基因[35]。SRD5A2 基因rs523349（V89L）位點多態(tài)性可以導致第89 位密碼子發(fā)生錯義突變，由纈氨酸（Val）轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔↙eu），以此影響SRD5A2的表達活性。體外研究表明，rs523349 位點C 等位基因能夠降低約40%的SRD5A2活性，這可能是其與晚期流產(chǎn)、轉(zhuǎn)移性前列腺癌存在顯著關聯(lián)的原因[36-37]。然而，本研究并未發(fā)現(xiàn)該位點各基因型分布存在性別差異，同時與指長比無關。

綜上，AKR1C3、SHBG 和SRD5A2 基因是雄激素合成代謝途徑的關鍵基因，可能通過影響雄激素合成代謝及雌-雄激素的相互轉(zhuǎn)換，影響指長比的形成。但是，本研究并未發(fā)現(xiàn)AKR1C3、SHBG 和SRD5A2 基因多態(tài)性與指長比（2D∶4D）有關，提示這些多態(tài)性位點可能主要影響個體出生后的性激素水平，對胚胎發(fā)育期形成的指長比沒有貢獻。由于本研究樣本量較少且限于健康大學生群體，檢測位點僅限于3 個基因的6 個多態(tài)性位點，對于探究雄激素代謝相關基因與指長比的關聯(lián)性缺乏充足證據(jù)，尚需擴大樣本及多態(tài)性位點，在不同人群體中完成進一步研究，以期為進一步揭示人類指長比形成的遺傳學基礎提供更多的理論依據(jù)。