曹 雪， 楊金成， 李 媛， 趙夢(mèng)潮， 趙天琪， 苗冬青， 侯紹章

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004； 2.銀川市第一人民醫(yī)院，寧夏醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常見(jiàn)的腎癌類(lèi)型，約占所有腎癌的80%～90%[1]。腎癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居所有泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的第3 位，病死率居首位[2]，近年來(lái)，我國(guó)腎癌發(fā)病率及病死率逐年攀升[3]，由于ccRCC 早期無(wú)明顯臨床癥狀，呈高度惡性，易早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此，ccRCC 的診斷和治療是全世界共同面臨的醫(yī)學(xué)難題[4]。在ccRCC 發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，早期診斷和治療非常重要，識(shí)別ccRCC 患者有效的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)優(yōu)化ccRCC 患者的治療方案、延長(zhǎng)患者生存周期以及改善患者預(yù)后均有重要意義。研究[5]顯示，ccRCC中普遍存在缺氧情況，缺氧促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞的生存和適應(yīng)缺氧的能力依賴(lài)于缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）和缺氧誘導(dǎo)因子2（HIF-2），HIF-1α 及其下游基因的過(guò)度表達(dá)通過(guò)各種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括血管生成、細(xì)胞遷移、侵襲和增殖，癌癥干細(xì)胞維持、誘導(dǎo)遺傳不穩(wěn)定和治療耐藥性[6]。有研究[7]表明，HIF-1α 在ccRCC 的發(fā)展中起抑制作用。但也有研究[8]表明，HIF-1α 在ccRCC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可或缺的作用，降低HIF-1α 的表達(dá)可以減弱人腎癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。還有研究[10]表明，人ccRCC 組織中HIF-1α 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織。因此，可以通過(guò)靶向HIF-1α 及其下游信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)ccRCC 的發(fā)生和發(fā)展。

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積增加與腫瘤細(xì)胞的侵襲性有密切關(guān)系[11]。膠原蛋白是ECM 中最豐富的纖維蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，支持趨化性和遷移性，是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的“高速公路”。賴(lài)氨酸羥化酶2（LH2）由2-酮戊二酸5-雙加氧酶2（human procollagen lysine-2-ketoglutarate-5-dioxygenase 2，PLOD2）基因編碼，是影響膠原交聯(lián)穩(wěn)定性的關(guān)鍵酶，它催化賴(lài)氨酸羥化，賴(lài)氨酸羥化的模式和程度增強(qiáng)分子間膠原交聯(lián)的穩(wěn)定性[12]。PLOD2在宮頸癌[13]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[14]、胃癌[15]、結(jié)直腸癌[16]及ccRCC[17]等多種腫瘤組織中的表達(dá)都比正常組織高，且其表達(dá)水平與腫瘤分化、分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。還有研究[18-19]表明，在缺氧條件下，PLOD2 在HIF-1α 的誘導(dǎo)下表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在腎癌方面，通過(guò)下調(diào)PLOD2 基因可明顯抑制ccRCC 細(xì)胞的遷移與增殖[17]。因此，PLOD2 在ccRCC 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中意義重大。但PLOD2 與HIF-1α 在ccRCC 發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中是否存在關(guān)聯(lián)目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)調(diào)控ccRCC 細(xì)胞系中HIF-1α 的表達(dá)，探討缺氧條件下HIF-1α 通過(guò)調(diào)控PLOD2 對(duì)ccRCC 細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的影響，旨在為ccRCC的早期診斷和治療尋找潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人ccRCC 細(xì)胞株786-0 和ACHN 購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)于Viva Biosciences 公司；RPMI 1640 和MEM 培養(yǎng)基購(gòu)于Procell 公司；1%青霉素-鏈霉素溶液和胰蛋白酶EDTA 購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；兔抗HIF-1α、GAPDH 單克隆抗體和Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP 抗體購(gòu)于Affinity Biosciences 公司（中國(guó)），兔抗PLOD2 單抗購(gòu)于Proteintech 公司；Goat Anti-Rabbit IgG 和Goat Anti-Mouse IgG 購(gòu)于亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)于Invigentech 公司；BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒和ECL 檢測(cè)試劑盒（超敏型）購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；一步法PAGE 凝膠試劑盒（10%）購(gòu)于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人ccRCC 細(xì)胞株786-0 和ACHN 于37 ℃水浴鍋中解凍后復(fù)蘇，分別置于RPMI 1640 或MEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到約70%后，隨機(jī)將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（NG 組）、缺氧組（Hypoxia 組，1% O2）和缺氧+HIF-1α 抑制劑組（Hypoxia+PX-478 組，55 μmol·L-1/45 μmol·L-1）。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5 000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中，并培養(yǎng)約24 h。細(xì)胞穩(wěn)定后，根據(jù)不同濃度的PX-478 進(jìn)行細(xì)胞分組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔以減少誤差，然后放入培養(yǎng)箱中24 h 或48 h，去培養(yǎng)基后，將CCK-8 和培養(yǎng)基按1∶9 的比例加入96孔板中，繼續(xù)避光培養(yǎng)2 h 后，使用分光光度計(jì)讀取450 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn) 當(dāng)各組細(xì)胞在85%～90% 融合度時(shí)收集細(xì)胞，向其中加入適量裂解液放置于冰上，30 min 后在4 ℃條件下以12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，進(jìn)行蛋白定量后將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱使蛋白變性，每組蛋白取40 μg 進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳（80 V/120 V）。蛋白分離后，在4 ℃及200 mA 電流的條件下，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，隨后用10%脫脂奶粉溶液封閉2 h。封閉后分別加入一抗HIF-1α（1∶1 000）、PLOD2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），在冰箱中4 ℃孵育過(guò)夜。次日加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1.5～2 h，TBST 洗滌3 次后使用ECL 試劑盒顯影，用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白/GAPDH 灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將ACHN 和786-0 細(xì)胞接種到6 孔板中，待孔底鋪滿(mǎn)細(xì)胞后，用無(wú)菌移液器槍頭尖端在孔底劃痕，注意保持槍頭垂直，NG 組和Hypoxia 組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，Hypoxia+PX-478 組加入含PX-478 的無(wú)血清培養(yǎng)基，0 h和12 h 后在顯微鏡下觀察并拍照，保持劃痕居中垂直，在6 個(gè)隨機(jī)點(diǎn)測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算平均值。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕寬度-觀察時(shí)間劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目 將786-0和ACHN 細(xì)胞分組后，用無(wú)血清培養(yǎng)基處理，細(xì)胞懸浮液密度為3×105mL。在下室中加入含有20% FBS 的培養(yǎng)基（600 μL），每孔取100 μL 接種于有或沒(méi)有凝膠基質(zhì)層的上室，并用鑷子輕輕將上室放到24 孔板中，避免產(chǎn)生氣泡。培養(yǎng)24 h后，清洗小室內(nèi)培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛浸泡，15 min 后用結(jié)晶紫染色30 min，PBS 清洗染色劑，自然風(fēng)干后，于顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將786-0 和ACHN 細(xì)胞分組處理后，根據(jù)組別每孔取500～1 000 個(gè)細(xì)胞接種在6 孔板中，培養(yǎng)2 周，用PBS 洗3 次，用6 mL 4%多聚甲醛固定，20 min 后清洗6 孔板，然后加入結(jié)晶紫染色30 min，PBS 清洗染色劑，自然風(fēng)干后拍照并統(tǒng)計(jì)每組的克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和GraphPad Prism 8.0 軟件作圖，各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PX-478 對(duì)786-0 和ACHN 細(xì)胞活力的影響

CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，加入HIF-1α抑制劑（PX-478）后的細(xì)胞活力降低，且隨著藥物濃度的升高而降低，786-0 細(xì)胞系藥物作用24 h 后的IC50是56.60 μmol·L-1，藥物作用48 h后的IC50是46.48 μmol·L-1；ACHN 細(xì)胞系藥物作用24 h 后的IC50是46.47 μmol·L-1，藥物作用48 h 后的IC50是35.14 μmol·L-1，見(jiàn)圖1。

圖1 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度PX-478 對(duì)人ccRCC 細(xì)胞活力的影響

2.2 缺氧和PX-478 對(duì)ccRCC 細(xì)胞HIF-1α、PLOD2 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIF-1α、PLOD2 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，在腎癌細(xì)胞786-0 和ACHN 中，與NG 組相比，Hypoxia 組HIF-1α、PLOD2 蛋白表達(dá)量均增加（P 均＜0.05）；與Hypoxia 組相比，Hypoxia+PX-478 組HIF-1α、PLOD2 蛋白表達(dá)量均降低（P 均＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組ccRCC 細(xì)胞HIF-1α、PLOD2 蛋白表達(dá)水平

2.3 缺氧和PX-478 對(duì)ccRCC 細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)0 h、12 h 腎癌細(xì)胞786-0 和ACHN 遷移能力進(jìn)行測(cè)定結(jié)果顯示，與NG 組相比，Hypoxia 組ccRCC 細(xì)胞786-0 和ACHN 的遷移能力均提高（P 均＜0.01），與Hypoxia 組相比，Hypoxia+PX-478 組細(xì)胞的遷移能力均降低（P均＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ccRCC 細(xì)胞遷移能力（×40）

2.4 缺氧和PX-478 對(duì)ccRCC 細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)對(duì)各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果顯示，與NG 組相比，Hypoxia 組ccRCC 細(xì)胞786-0 的遷移和侵襲能力均升高（P均＜0.01）；與Hypoxia 組相比，Hypoxia+PX-478組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均降低（P 均＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ccRCC 細(xì)胞遷移、侵襲能力（結(jié)晶紫染色×100）

2.5 缺氧和PX-478 對(duì)ccRCC 細(xì)胞增殖能力的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ccRCC 細(xì)胞786-0 和ACHN 增殖能力結(jié)果顯示，Hypoxia 組ccRCC 細(xì)胞786-0 和ACHN 的細(xì)胞群落數(shù)目多于NG 組（P＜0.01），Hypoxia+PX-478 組細(xì)胞群落數(shù)目比Hypoxia 組少（P＜0.001），見(jiàn)圖5。

圖5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ccRCC 細(xì)胞增殖能力

3 討論

腫瘤缺氧微環(huán)境在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用[20]，缺氧通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞中的HIF-1α 及其下游因子的蛋白表達(dá)水平，加劇癌癥的發(fā)生和發(fā)展[6]，缺氧還可以通過(guò)上調(diào)PLOD2 的蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，如子宮內(nèi)膜癌[21]、胃癌[22]和膽管上皮癌等[23]。滋養(yǎng)細(xì)胞[24]、膠質(zhì)瘤細(xì)胞[18]、宮頸癌細(xì)胞[25]、乳腺癌細(xì)胞[19]和肉瘤細(xì)胞[26]在常氧和缺氧條件下，HIF-1α 均可通過(guò)上調(diào)PLOD2 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

研究[10，17]證實(shí)，HIF-1α 和PLOD2 在腎癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且HIF-1α 可通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)促進(jìn)ccRCC 的發(fā)生和發(fā)展[27]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，加入HIF-1α 抑制劑（PX-478）后，人ccRCC 細(xì)胞的活力隨PX-478濃度的增加而降低，HIF-1α 以及下游因子可能與ccRCC 細(xì)胞的生存密切相關(guān)；還發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下人ccRCC 細(xì)胞中HIF-1α 和PLOD2 蛋白表達(dá)均增加，加入PX-478 后缺氧環(huán)境中HIF-1α 和PLOD2 蛋白表達(dá)均降低。結(jié)果表明在缺氧條件下，通過(guò)抑制HIF-1α 的表達(dá)進(jìn)一步降低ccRCC細(xì)胞中PLOD2 的蛋白表達(dá)量。

研究[17]表明，PLOD2 在ccRCC 中呈現(xiàn)高表達(dá)且促進(jìn)ccRCC 細(xì)胞的增殖和遷移。為進(jìn)一步研究其在缺氧條件下對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的影響，本研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧時(shí)，ccRCC 細(xì)胞中的PLOD2 表達(dá)上調(diào)，且ccRCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力均增強(qiáng)，加入PX-478 后，PLOD2 表達(dá)下調(diào)且ccRCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力均減弱。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧時(shí)，腎癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，加入PX-478 后，ccRCC 細(xì)胞增殖能力減弱。上述結(jié)果表明，缺氧條件下，HIF-1α 可通過(guò)上調(diào)PLOD2 的表達(dá)增強(qiáng)ccRCC 細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的能力。

綜上所述，缺氧條件下HIF-1α 和PLOD2 在人ccRCC 細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且可以通過(guò)抑制HIF-1α/PLOD2 通路來(lái)抑制ccRCC 細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，提示HIF-1α/PLOD2 通路具有促進(jìn)ccRCC 發(fā)生和發(fā)展的作用。然而，對(duì)于PLOD2 通過(guò)何種信號(hào)通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖還需進(jìn)行更深入的研究。