劉文豪 余渝 王旭文 田琴 吳珂 馬麒 趙福相 孔憲輝

摘要

［目的］揭示W(wǎng)RKY29基因表達(dá)機(jī)理，為分子輔助育種創(chuàng)新種質(zhì)提供基因資源。［方法］以WRKY家族成員中的WRKY29為目標(biāo)，通過生物信息學(xué)方法分析陸地棉WRKY29轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞定位建模和染色體分布定位、基因的組織特異性表達(dá)。［結(jié)果］生物信息學(xué)分析表明，陸地棉WRKY29轉(zhuǎn)錄因子含有279個氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)為6.08，具有典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域，屬于不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)卷曲為主。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析得知WRKY29與同為錦葵目的物種聚類在同一進(jìn)化分支，亞細(xì)胞定位預(yù)測WRKY29轉(zhuǎn)錄因子分布在細(xì)胞核，而染色體定位發(fā)現(xiàn)WRKY29轉(zhuǎn)錄因子分布在A02染色體40～48 Mb區(qū)域內(nèi)。WRKY29轉(zhuǎn)錄因子具有正調(diào)控功能，組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)在根部具有顯著性表達(dá)。［結(jié)論］陸地棉轉(zhuǎn)錄因子WRKY29的鑒定及表達(dá)分析為棉花生長發(fā)育過程中的抗逆研究提供了重要線索。

關(guān)鍵詞 WRKY29；轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)；育種

中圖分類號 S 562? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）23-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.23.020

Identification and Expression Analysis of Transcription Factor WRKY29 in Gossypium hirsutum L.

LIU Wen-hao， YU Yu， WANG Xu-wen et al

（Cotton Research Institute， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science/Northwest Inland Region Key Laboratory of Cotton Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/State Key Laboratory of Cotton Biology， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract ［Objective］In the early stage， our research team identified a WRKY29 gene in upland cotton， and revealed the mechanism of gene expression through analysis， hoping to provide genetic resources for molecular-assisted breeding innovative germplasm.［Method］This study targeted WRKY29， a member of the WRKY family， and analyzed the physicochemical properties， phylogenetic relationships， subcellular location modeling and chromosome distribution location， and tissue specific expression of WRKY29 transcription factors in Gossypium hirsutum L. by bioinformatics methods.［Result］Bioinformatics analysis showed that the upland cotton WRKY29 transcription factor contains 279 amino acid residues， the theoretical isoelectric point is 6.08， and has a typical WRKY conserved domain， which is an unstable protein. The secondary structure of WRKY29 was mainly α-helix and random coil. Phylogenetic analysis showed that WRKY29 and mallow species clustered in the same evolutionary branch. Subcellular localization predicted that WRKY29 was located in the nucleus， chromosome mapping showed that WRKY29 transcription factor was distributed in the 40-48 mb region of A02 chromosome. WRKY29 transcription factor has a positive regulatory function， and the tissue expression pattern was found to be significantly expressed in the roots.［Conclusion］Identification and expression analysis of transcription factor WRKY29 in upland cotton provide important clues for the study of resistance to stress during the growth and development of cotton.

Key words WRKY29;Transcription factor;Bioinformatics;Breeding

基金項(xiàng)目 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“西北內(nèi)陸優(yōu)質(zhì)機(jī)采棉新品種培育-機(jī)采優(yōu)異育種資源的創(chuàng)制”（2017YFD0101601）；兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目“機(jī)采棉遺傳育種與高效栽培創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”（2017CB011）；棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題“縮節(jié)胺拌種對棉花生長發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析”（CB2022A27）。

作者簡介 劉文豪（1992—），男，安徽界首人，助理研究員，碩士，從事棉花育種研究。

*通信作者，研究員，從事棉花育種研究。

收稿日期 2022-07-15

WRKY基因家族是含有WRKY保守結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族，其廣泛存在于植物體中，并且在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答和代謝調(diào)控等一系列生理生化過程中發(fā)揮重要作用［1］?；谌蚪M的WRKY基因家族結(jié)構(gòu)和功能分析在許多已測序的物種中得到了廣泛應(yīng)用［2］。目前已完成擬南芥［3］、水稻［4］、蘿卜［5］、小麥［6］和毛果楊［7］等多個物種的WRKY基因家族分析。棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費(fèi)國，總產(chǎn)和單產(chǎn)均居世界首位［8］，2020年全國棉花播種面積為316.99萬hm2。因此，保持我國棉花產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，對于促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效，農(nóng)民增收及農(nóng)村經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定具有重要意義。但是，近年來棉花病害較為嚴(yán)重，危害日益增加，而且缺少抗逆的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)棉花主推品種。因此，對抗病、抗逆優(yōu)良品種的研究至關(guān)重要。優(yōu)質(zhì)棉的培育是解決問題的根本途徑，分析關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、差異表達(dá)及理化性狀具有重要意義。

有研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員不僅在植物的生物脅迫和非生物脅迫中起重要作用，還參與碳水化合物的合成、次生代謝產(chǎn)物的合成、植株的衰老和發(fā)育［9］。WRKY蛋白能與目標(biāo)基因啟動子中的W-box（TGACC（A/T））結(jié)合，激活或抑制下游基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)其應(yīng)激反應(yīng)。此外，WRKY蛋白可以與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)［10］。Chen等［11］的研究表明，擬南芥Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY46、WRKY54和WRKY70都參與植物甾體激素（BR）調(diào)控植物生長和干旱反應(yīng)。Duan等［12］研究發(fā)現(xiàn)，毛白楊PtrWRKY73在植物對生物營養(yǎng)型病原菌的抗性中起著積極作用，但在對壞死營養(yǎng)型病原菌的抗性中起著消極作用。目前很多研究都集中在WRKY基因的功能鑒定上，但是對WRKY基因生物學(xué)許多領(lǐng)域的認(rèn)識有限。如棉花中WRKY基因的系統(tǒng)發(fā)育特征、整體表達(dá)模式、調(diào)控表達(dá)的分子機(jī)制和途徑等都沒有得到很好的描述［13］。

迄今為止，很多陸地棉WRKY家族的成員被分析研究，但是陸地棉WRKY29轉(zhuǎn)錄因子尚未被綜合分析，其在陸地棉對生物和非生物脅迫的反應(yīng)過程中發(fā)揮著的作用尚未得知，其涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及差異表達(dá)尚不清楚。筆者以陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)庫［14］和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫PRJNA248163進(jìn)行WRKY29轉(zhuǎn)錄因子的序列獲取及差異表達(dá)分析，使用多類型生物信息學(xué)工具進(jìn)行理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等相關(guān)的分析，以期為基因功能研究及生物技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)棉花新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 GhWRKY29蛋白理化性質(zhì)分析

以擬南芥AtWRKY29（AT4G23550）為探針，從陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)庫獲取GhWRKY29基因的cds和蛋白序列，在NCBI網(wǎng)站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行比對，SMART網(wǎng)站（http：∥smart.embl.de/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析。使用ProtParam網(wǎng)站（https：∥web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點(diǎn)、帶正負(fù)電荷的氨基酸殘基、分子式、總原子數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)、親疏水性等。

1.2 GhWRKY29蛋白的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和序列比對分析

SOPMA網(wǎng)站（https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/）輸入氨基酸序列分析GhWRKY29蛋白的二級結(jié)構(gòu)，包括α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲。在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）分析GhWRKY29蛋白的三級結(jié)構(gòu)。NCBI獲取不同物種的WRKY29蛋白序列和登錄號，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，用EvolView（http：∥evolgenius.info/）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的編輯。

1.3 GhWRKY29蛋白亞細(xì)胞定位和染色體圖譜繪制

在線網(wǎng)站Predict Protein（https：∥www.predictprotein.org）進(jìn)行GhWRKY29蛋白的亞細(xì)胞定位分析。從陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)庫獲取GhWRKY29的基因信息，使用在線網(wǎng)站MG2C（http：∥mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）進(jìn)行染色體定位的圖譜繪制，chromosome，chromosome id，gene lines，gene id等指標(biāo)僅變動字體格式，其他均為默認(rèn)參數(shù)。

1.4 GhWRKY29基因的表達(dá)模式分析

從NCBI網(wǎng)站下載陸地棉TM-1標(biāo)準(zhǔn)系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包（PRJNA248163），結(jié)合

陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對數(shù)據(jù)進(jìn)行矩陣轉(zhuǎn)換，獲取GhWRKY29

基因在不同組織表達(dá)的FPKM值，進(jìn)一步分析

GhWRKY29基因

的特異表達(dá)情況。使用TB-Tools軟件的Super HeatMap

Browser功能進(jìn)行繪制基因差異表達(dá)熱圖，Adobe Illustrator 2019軟件對圖片進(jìn)行完善。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhWRKY29蛋白理化性質(zhì)

以擬南芥AtWRKY29（AT4G23550）為探針，在陸地棉TM-1標(biāo)準(zhǔn)系基因組數(shù)據(jù)庫中搜索得到相對應(yīng)的Gh_A04G1042的蛋白序列和CDS序列。SMART網(wǎng)站結(jié)構(gòu)分析該序列含有分布在第133～193氨基酸區(qū)域的WRKY結(jié)構(gòu)域（圖1），該結(jié)構(gòu)域是一個含有60個氨基酸的區(qū)域，由一個保守的氨基酸序列WRKYGQK在其N端定義，并帶有一個新穎的鋅指狀基序［15］。根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫注釋信息和NCBI的Blast比對數(shù)據(jù)確定為GhWRKY29。ProtParam分析結(jié)果表明，氨基酸數(shù)為279個，分子量為31 899.58，理論等電點(diǎn)為6.08，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）有41個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）有36個。分子式為：C1413H2168N398O434S7，總原子數(shù)是4 420，不穩(wěn)定系數(shù)為51.41，是不穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)是60.07，親水性的平均值（GRAVY）是-0.814。

2.2 GhWRKY29蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

SOPMA分析發(fā)現(xiàn)（圖2），GhWRKY29的蛋白質(zhì)序列含有279個氨基酸，而在這些氨基酸的分布排列中α螺旋68個，占比為24.37%；β轉(zhuǎn)角15個，占比為5.38%；延伸鏈27個，占比為9.68%；無規(guī)卷曲169個，占比為60.57%。基于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，把WRKY29的蛋白序列輸入在線網(wǎng)站SWISS-MODEL，通過搜索序列結(jié)構(gòu)模型相同的模板建立骨架，優(yōu)化模型，得到該蛋白的三級結(jié)構(gòu)的Cartoon模型，而這個模型的氨基酸排列順序與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測基本相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了WRKY29蛋白結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性（圖3）。

2.3 GhWRKY29蛋白進(jìn)化關(guān)系及序列結(jié)構(gòu)

從NCBI網(wǎng)站獲取不同物種WRKY29蛋白的氨基酸序列和登錄號，分別是甘草GgWRKY29（QFI57424.1）、擬南芥AtWRKY29（OAO99222.1）、岷江百合LrWRKY29（QRX38926.1）、核桃JrWRKY29（ALU11217.1）、蕪青BrWRKY29（AHB33835.1）、麻風(fēng)樹JcWRKY29（AGQ04217.1）、煙草NaWRKY29（OIT33212.1）、甜櫻桃PaWRKY29（XP_021820806.1）、木槿HsWRKY29（XP_039015885.1）、榴蓮DzWRKY29（XP_022737617.1）和梨PuWRKY29（KAB2632799.1）。通過系統(tǒng)

發(fā)育進(jìn)化樹對陸地棉WRKY29蛋白進(jìn)行聚類分析（圖4），結(jié)果顯示，該聚類分析分為Group A和Group B兩部分，Group A包括陸地棉GhWRKY29、木槿HsWRKY29和榴蓮DzWRKY29 3個物種，Group B包括甘草GgWRKY29、擬南芥AtWRKY29、岷江百合LrWRKY29、核桃JrWRKY29、蕪青BrWRKY29、麻風(fēng)樹JcWRKY29、煙草NaWRKY29、甜櫻桃PaWRKY29和梨PuWRKY29 5個物種。

通過DNAMAN軟件對不同物種的蛋白序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，陸地棉WRKY29與同屬錦葵科的木槿序列一致性最高，為65.56%；與錦葵目木棉科的榴蓮序列一致性次之，為58.18%；與大戟科的麻風(fēng)樹序列一致性最低，為15.12%。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，在N端含有WRKYGQK七肽段序列的結(jié)構(gòu)域，而在C端含有1個C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)

2.4 GhWRKY29蛋白的亞細(xì)胞和染色體定位

亞細(xì)胞定位是研究基因功能的一種重要技術(shù)手段。為準(zhǔn)確了解GhWRKY29蛋白在表達(dá)調(diào)控中所具有的功能，該研究使用GhWRKY29蛋白的氨基酸序列，在網(wǎng)站Plant-mPLoc進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白定位在細(xì)胞核。PredictProtein網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果同樣表明該蛋白定位在細(xì)胞核中（圖6A）。從基因組數(shù)據(jù)庫查詢到該基因位于A02染色體上，依據(jù)該基因的序列起始位置和終止位置信息，用MG2C網(wǎng)站預(yù)測在染色體上的具體分布情況（圖6B）。這將有助于了解GhWRKY29基因在染色體上的位置和所具有生理功能之間的關(guān)系。

2.5 GhWRKY29基因的表達(dá)模式

利用陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫PRJNA248163對GhWRKY29基因進(jìn)行表達(dá)模式分析（圖7），轉(zhuǎn)錄組檢測組織分別為根、莖、葉。根據(jù)FPKM值分析GhWRKY29基因的表達(dá)模式，圖7a為對照植株，圖7b是該基因在根、莖、葉中的表達(dá)情況。GhWRKY29基因在陸地棉植株的根、莖、葉的表達(dá)模式存在顯著差異，在根中的表達(dá)量最高，其次是葉片，在莖中的表達(dá)量相對最低。陸地棉根系具有吸收養(yǎng)分、水分及固定地上部分的功能，而且還具有向土壤輸入有機(jī)質(zhì)和感知根部周邊環(huán)境變化的作用。GhWRKY29基因在根部具有高表達(dá)量，推測其可能在根系響應(yīng)逆境脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要功能。

3 討論

植物在長期進(jìn)化過程中形成了生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄因子家族在該過程中起到重要作用［16］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與干旱、鹽漬、高溫、冷凍、枯黃萎病和蟲害等多種環(huán)境脅迫的響應(yīng)。Gu等［17］研究發(fā)現(xiàn)，棉花GhWRKY27通過減少葉綠素含量及提高衰老相關(guān)基因的過表達(dá)促進(jìn)了葉片的衰老；Wang等［18］研究表明，棉花GhWRKY33介導(dǎo)植物對干旱脅迫的反應(yīng)，并參與ABA信號通路；Chu等［19］推測GhWRKY41通過調(diào)節(jié)活性氧（ROS）清除和抗氧化劑基因的表達(dá)來增強(qiáng)植物對逆境的耐受性。陸地棉WRKY家族的部分成員被分析研究，而WRKY29基因的綜合研究報(bào)道較少。早期的系統(tǒng)發(fā)育研究主要基于生物的表型特征，通過表型比較來研究物種之間的進(jìn)化關(guān)系。然而，利用表型特征進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析存在很大的局限性。該研究以生物信息學(xué)方法從基因組數(shù)據(jù)庫獲得GhWRKY29轉(zhuǎn)錄因子的cds序列和蛋白序列，經(jīng)過Blast比對、數(shù)據(jù)庫篩選及SMART網(wǎng)站結(jié)構(gòu)分析確定了基因身份。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GhWRKY29的蛋白質(zhì)序列含有279個氨基酸，屬于不穩(wěn)定蛋白。對該蛋白的二級序列和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測有助于了解蛋白質(zhì)的生物功能。從NCBI獲取其他11個物種的WRKY蛋白序列及登錄號與GhWRKY29蛋白進(jìn)行聚類分析，得知陸地棉GhWRKY29蛋白與同為錦葵目的木槿HsWRKY29和榴蓮DzWRKY29在同一進(jìn)化分支，而非錦葵目的其余9個物種的WRKY29蛋白聚類在Group B的其他分支。在Group A中發(fā)現(xiàn)，陸地棉GhWRKY29蛋白與同為錦葵科的木槿HsWRKY29親緣關(guān)系更近，與木棉科榴蓮的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，說明物種的進(jìn)化具有保守性，這些分析增強(qiáng)了對自然選擇在不同物種WRKY29進(jìn)化過程中所起作用的了解。亞細(xì)胞定位預(yù)測GhWRKY29定位在細(xì)胞核，參與核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由染色體位置圖譜可知，GhWRKY29基因分布在基因組A亞組的第2條染色體的40～48 Mb，有助于了解GhWRKY29基因在染色體上的位置和生理功能之間的關(guān)系，也可用于判斷其在遺傳圖譜上的相對距離。GhWRKY29基因的表達(dá)模式分析了其在根、莖、葉中的差異表達(dá)，結(jié)果表現(xiàn)為根部的表達(dá)量>葉部的表達(dá)量>莖部的表達(dá)量。轉(zhuǎn)錄因子和植物激素在控制根發(fā)育的根基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［20］。GhWRKY29基因在根部大量表達(dá)可能涉及蛋白質(zhì)運(yùn)動和基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥細(xì)胞核AtWRKY29與AtBAG7相互作用有助于應(yīng)對脅迫及增加錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累，最終維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)［21］。WRKY29在小麥中的異位表達(dá)導(dǎo)致矮小和抽穗早，增強(qiáng)了對鐮刀菌赤霉病的抗病性［22］。該研究結(jié)果為進(jìn)一步GhWRKY29基因克隆提供了必要的條件，為后續(xù)研究GhWRKY29基因在生物和非生物脅迫應(yīng)答過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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