王玉榮，侯強(qiáng)川，田龍新，劉菊珍，周加平，郭 壯,*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.襄陽(yáng)市醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；3.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng) 441614）

白酒（又稱高粱酒）是我國(guó)一種傳統(tǒng)的蒸餾酒，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。其主要以谷物等為原料，經(jīng)純糧固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵而成，這也是與其他蒸餾酒的主要差異之一[2]。白酒按香型劃分為醬香型、濃香型和清香型等十二種香型[3]，其中醬香型的釀造工藝最為復(fù)雜和獨(dú)特，其糧曲原料在長(zhǎng)達(dá)一年的生產(chǎn)周期中，需經(jīng)過(guò)多次發(fā)酵和多輪取酒[4-5]。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，不同輪次所獲得的白酒品質(zhì)存在較大的差異，且基酒品質(zhì)以第3、4、5輪次較好，亦被人稱為“大輪回”[6]。基酒經(jīng)過(guò)陳釀和精心勾調(diào)后方可獲得醬香型成品白酒，具有醬香、醇厚、細(xì)膩和回味悠長(zhǎng)等特點(diǎn)[7]。

醬香型白酒作為傳統(tǒng)的發(fā)酵酒，其品質(zhì)與發(fā)酵微生物的組成和多樣性具有密切的聯(lián)系[8]，Hou Qiangchuan等[9]已經(jīng)證實(shí)3 種低溫大曲中微生物的結(jié)構(gòu)和功能存在較大差異，且大曲的品質(zhì)直接或間接影響成品酒的香氣和質(zhì)量。醬香型白酒的發(fā)酵屬于開放式發(fā)酵，使得酒醅作為一個(gè)天然的培養(yǎng)基，不僅包含大曲中的微生物，還可以富集生產(chǎn)環(huán)境中的微生物進(jìn)行發(fā)酵[10]，而不同產(chǎn)地的白酒即使工藝相同，其品質(zhì)也存在細(xì)微的差異[11]。因此，研究人員針對(duì)酒醅中的微生物展開了大量卓有成效的研究。崔守瑜等[10]基于純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)貴州醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的不同輪次發(fā)酵過(guò)程酒醅中微生物構(gòu)成進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)不同輪次酒醅中微生物構(gòu)成存在較大差異；張春林等[12]對(duì)第2輪次酒醅中微生物多樣性及其理化特性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示許多微生物對(duì)酒醅的理化性質(zhì)具有較大的影響。在白酒基酒取酒過(guò)程中采用“分層起槽”的方式[13]，王玉榮等[14]對(duì)第4輪次不同分層酒醅的理化性質(zhì)和微生物多樣性進(jìn)行了研究，并證實(shí)不同分層中酒醅的理化指標(biāo)和微生物構(gòu)成存在明顯差異，且差異主要是由溫度導(dǎo)致。

湖北作為醬香型白酒生產(chǎn)的重要省份，目前少有科研人員針對(duì)該地區(qū)醬香型白酒酒醅展開系統(tǒng)的研究，特別是不同輪次酒醅中微生物在白酒發(fā)酵過(guò)程中的影響尚不明確。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)第5輪次不同分層酒醅中微生物構(gòu)成和多樣性進(jìn)行解析，并通過(guò)多組學(xué)手段對(duì)酒醅的理化和感官指標(biāo)進(jìn)行分析，探究微生物在第5輪次白酒發(fā)酵過(guò)程中的作用，為后續(xù)發(fā)酵工藝的改良提供必要的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SA 402B電子舌 日本Insent公司；PEN3電子鼻德國(guó)Airsense公司；CN-KT001電子天平 深圳千確電子有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華（常州）儀器制造有限公司；LRH-150數(shù)顯生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；K1100凱氏定氮儀 海能未來(lái)技術(shù)集團(tuán)股份有限公司；DG250型厭氧工作站 英國(guó)Don Whitley公司；R930機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)Dell公司；MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與前處理

本研究所有醬香型酒醅樣本均采集自湖北省襄陽(yáng)市某酒廠，采用時(shí)間為2021年7月。本研究所涉及的窖池長(zhǎng)寬高分別為4.8、2.3 m和1.8 m，并按照由低到高分為下層（距池底60 cm，溫度32 ℃）、中層（距池底120 cm，溫度33～35 ℃）和上層（距池底180 cm，溫度37 ℃）。分別對(duì)窖池第5輪次不同分層酒醅樣本進(jìn)行采集（所有酒醅樣本在池中的發(fā)酵時(shí)間為28 d），每層采集5 份樣本（對(duì)角線交點(diǎn)和4 個(gè)角落）。上層酒醅編號(hào)分別為F5S1～F5S5；中層酒醅編號(hào)分別為F5Z1～F5Z5；下層酒醅編號(hào)分別為F5X1～F5X5。每份酒醅樣本分別采集600 g，并一式兩份至于無(wú)菌無(wú)酶的自封袋中低溫運(yùn)回鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，一份立即用于活菌計(jì)數(shù)，一份于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 理化特征分析

參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法對(duì)酒醅中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定[15]；參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》中滴定法對(duì)酒醅酸度進(jìn)行測(cè)定，并采用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定法對(duì)酒醅中還原糖和淀粉含量進(jìn)行測(cè)定[16]；準(zhǔn)確稱取4 g酒醅樣本于專用樣品盤中，并使用鹵素水分測(cè)定儀對(duì)其水分含量進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.3.3 活菌計(jì)數(shù)

參照GB 4789.35—2016《乳酸菌檢驗(yàn)》方法對(duì)酒醅中細(xì)菌和乳酸菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)[17]；參照GB 789.15—2016《霉菌和酵母計(jì)數(shù)》方法對(duì)酒醅中霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)[18]。

1.3.4 酒醅滋味品質(zhì)分析

準(zhǔn)確稱取20 g酒醅樣本于100 g蒸餾水中攪拌均勻后12 000 r/min離心10 min，取上清液抽濾后置于4 ℃冰箱中24 h，取下清液備用。使用電子舌對(duì)濾液的酸味、苦味、澀味、咸味和咸味等基本味，以及后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）等基本味的回味進(jìn)行數(shù)字化測(cè)定，并均以F5S1為對(duì)照，每份樣品重復(fù)測(cè)定4 次，取后3 次數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)試數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析[19]。

1.3.5 酒醅風(fēng)味品質(zhì)分析

準(zhǔn)確稱取15 g酒醅樣本于電子鼻樣品瓶中封口，置于60 ℃水浴鍋中保溫20 min，并于室溫平衡20 min。樣品采用頂空進(jìn)樣，平行測(cè)定3 次。使用電子鼻對(duì)酒醅樣本的風(fēng)味特征進(jìn)行采集，電極響應(yīng)曲線在50 s后達(dá)到平臺(tái)期，選用59、60 s和61 s所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值進(jìn)行后續(xù)分析[20]。

1.3.6 微生物多樣性分析

使用微生物基因組提取試劑盒對(duì)酒醅樣本中微生物的宏基因組DNA進(jìn)行提取，并使用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提取物的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的DNA提取物置于－80 ℃?zhèn)溆?。分別使用帶有核苷酸標(biāo)簽（Barcode）的338F/806R和ITS1F/ITS2R引物對(duì)酒醅中細(xì)菌的16S rRNA和真菌的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增[21-22]。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并將檢驗(yàn)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

參照Yang Chengcong等[23]的方法對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控，基于QIIME（v1.7.1）平臺(tái)對(duì)酒醅樣本中微生物的構(gòu)成和多樣性進(jìn)行分析[24]。首先，本研究參照崔夢(mèng)君等[25]對(duì)莽椒中細(xì)菌中微生物的多樣性分析的主要步驟對(duì)酒醅中微生物構(gòu)成和多樣性進(jìn)行解析。同時(shí)，參照Wang Yurong等[20]對(duì)豆豉中真菌多樣性的主要分析步驟對(duì)酒醅中真菌微生物的構(gòu)成和多樣性進(jìn)行解析。進(jìn)一步將獲得的代表性序列與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，通過(guò)4 種α多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)）對(duì)酒醅中微生物多樣性和豐富度進(jìn)行分析，并通過(guò)加權(quán)/非加權(quán)的Uni-Frac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析。本研究下載了醬香白酒第4輪次窖池不同分層酒醅微生物序列數(shù)據(jù)與本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行了合并分析[14]。

1.3.7 下載數(shù)據(jù)的核酸登錄號(hào)

本研究下載醬香白酒第4輪次窖池不同分層酒醅微生物序列數(shù)據(jù)納入分析，該數(shù)據(jù)在MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)為mgp102959。

1.4 數(shù)據(jù)分析及可視化

本研究使用Wilcoxon test對(duì)不同分層和輪次酒醅中微生物相對(duì)豐度、α多樣性指數(shù)和酒醅的理化指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析；使用R軟件對(duì)酒醅中的潛在關(guān)鍵物種進(jìn)行識(shí)別；使用Spearman秩相關(guān)性分析對(duì)酒醅中部分菌屬和其理化指標(biāo)及感官品質(zhì)進(jìn)行分析，并使用Gephi軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖繪制。其他數(shù)據(jù)的可視化均使用R（V 4.2.2）軟件和Origin 2021完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分層酒醅理化指標(biāo)和活菌計(jì)數(shù)分析

酒醅作為重要的發(fā)酵基質(zhì)，其理化特性不僅直接影響著白酒的品質(zhì)，還通過(guò)影響微生物生長(zhǎng)間接影響白酒的品質(zhì)。本研究首先對(duì)酒醅的酸度、水分含量和淀粉含量等理化指標(biāo)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如表1所示。

表1 不同分層酒醅理化特性和活菌計(jì)數(shù)Table 1 Physicochemical properties and viable microbial counts of different layers of alcoholic fermentative material

由表1可知，在檢測(cè)的6 個(gè)指標(biāo)中，僅蛋白質(zhì)含量在不同分層中差異不顯著（P＞0.05）；中層酒醅的酸度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、淀粉含量和還原糖含量均顯著高于下層（P＜0.05），其中淀粉含量和還原糖含量亦顯著高于上層（P＜0.05）；而上層的水分含量和還原糖顯著高于下層（P＜0.05）。由此可見，不同分層酒醅中的理化指標(biāo)存在較大差異。為此，本研究使用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)酒醅中的乳酸菌、菌落總數(shù)、酵母菌和霉菌進(jìn)行計(jì)數(shù)以初步估計(jì)酒醅中的微生物數(shù)量。結(jié)果顯示，乳酸菌在上中下層中的乳酸菌數(shù)分別為4.07、4.00（lg（CFU/g））和4.08（lg（CFU/g））；菌落總數(shù)分別為5.34、5.67（lg（CFU/g））和5.63（lg（CFU/g））；而酵母菌和霉菌數(shù)分別為5.50、5.61（lg（CFU/g））和5.20（lg（CFU/g））。而經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同分層酒醅中菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)、酵母菌和霉菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同分層酒醅感官品質(zhì)差異分析

通過(guò)酒醅風(fēng)味在一定程度上可以反映成品酒的品質(zhì)，在前期通過(guò)對(duì)酒醅滋味和風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析，對(duì)于控制成品酒的質(zhì)量十分重要。因此，本研究通過(guò)仿生設(shè)備對(duì)不同分層酒醅的感官品質(zhì)進(jìn)行了數(shù)字化分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同分層酒醅滋味（A）和風(fēng)味（B）比較分析Fig.1 Comparative analysis of taste (A) and flavor (B) of different layers of alcoholic fermentative material

由圖1A可知，在5 個(gè)基本味中，上中下層的澀味和咸味均不存在顯著差異（P＞0.05），而酸味強(qiáng)度在上層酒醅中顯著高于中層和下層（P＜0.05），苦味強(qiáng)度在上層酒醅中顯著低于中層（P＜0.05），而鮮味在上層酒醅中顯著低于中層和下層（P＜0.05）；在3 個(gè)基本味的回味中，上中下層的后味-A差異不顯著（P＞0.05），而上層酒醅的后味-B和豐度顯著低于中層和下層（P＜0.05）。由圖2B可知，第5輪次不同分層酒醅在W1C、W3C、W5C、W2S、W2W和W3S上均差異不顯著（P＞0.05），但下層酒醅在W5S、W6S、W1S和W1W均顯著高于中層（P＜0.05），而與上層無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同分層酒醅中微生物屬水平構(gòu)成Fig.2 Genus-level composition of microbial communities in different layers of alcoholic fermentative material

2.3 不同分層和輪次微生物群落差異分析

微生物在白酒發(fā)酵過(guò)程中十分重要，而酒醅作為微生物發(fā)酵的主要載體，對(duì)酒醅中微生物多樣性進(jìn)行解析十分必要。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酒醅中微生物的構(gòu)成進(jìn)行解析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2a可知，不同分層酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（平均相對(duì)含量大于1.00%）共有8 個(gè)，分別為Acetilactobacillus、Lactobacillus和Thermoactinomyces等，其平均相對(duì)含量分別為50.23%、9.65%和8.46%。由圖2b可知，不同分層酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌屬（平均相對(duì)含量大于1.00%）共有7 個(gè)，分別為Sarocladium、Thermoascus和Rasamsonia，其平均相對(duì)含量分別為74.18%、10.43%和3.55%。值得注意的是，不同分層酒醅中微生物的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌構(gòu)成存在較大的差異，而優(yōu)勢(shì)真菌構(gòu)成的差異較小。因此，本研究對(duì)不同分層和輪次酒醅中優(yōu)勢(shì)菌屬的差異進(jìn)行了分析，結(jié)果表2所示。

表2 不同輪次和分層酒醅屬水平的比較分析Table 2 Comparative analysis of bacterial and fungal communities at genus level in different rounds and layers of alcoholic fermentative material

由表2可知，酒醅的15 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬中有10 個(gè)菌屬在不同輪次或分層中存在顯著差異（P＜0.05），其中8 個(gè)為細(xì)菌屬，2 個(gè)為真菌屬。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)菌屬在第4輪次的不同分層中存在較大差異，在第5輪次的不同分層中差異較小。同時(shí)，本研究亦發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度在酒醅的上層均差異不顯著（P＞0.05），差異主要集中在酒醅中層和下層，而優(yōu)勢(shì)真菌屬的差異則主要集中在酒醅上層和中層。

2.4 不同分層和輪次微生物多樣性差異分析

在解析第5輪次酒醅中微生物構(gòu)成的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)微生物的多樣性進(jìn)行比較分析，以進(jìn)一步解析不同輪次和分層中微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異，其比較結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同輪次和分層酒醅微生物α多樣性指數(shù)比較分析Fig.3 Comparative analysis of bacterial and fungal α-diversity indexes in different rounds and layers of alcoholic fermentative material

由圖3A、B可知，第5輪次上層酒醅細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)顯著低于中層和下層（P＜0.05）；而Chao1指數(shù)顯著高于下層（P＜0.05），但與中層無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由圖3C、D亦可知，第5輪次不同分層酒醅中真菌群落的Shannon指數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），而上層真菌微生物的Chao1指數(shù)顯著高于中層和下層（P＜0.05）。值得注意的是，本研究在第4輪次上并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的規(guī)律，且第4輪次不同分層酒醅細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)比第4、5輪次中微生物的多樣性發(fā)現(xiàn)，不同分層的微生物群落的Shannon和Chao1指數(shù)亦存在較大差異。本研究進(jìn)一步基于加權(quán)Uni-Frac距離對(duì)不同輪次和分層的酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于Uni-Frac距離的不同輪次和分層酒醅微生物主坐標(biāo)分析Fig.4 PCoA plots of microorganisms in different rounds and layers of alcoholic fermentative material based on Uni-Frac distance

由圖4A可知，第4輪次酒醅樣本幾乎全部位于X軸負(fù)半軸，而第5輪次酒醅樣本則幾乎全部位于X軸正方向，兩者在二維空間上呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)。對(duì)比不同分層酒醅發(fā)現(xiàn)，第4輪次不同分層酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)較為相似，而第5輪次則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。由圖4B可知，第4、5輪次酒醅樣本分別位于X軸的負(fù)方向和正方向，兩者呈完全分離趨勢(shì)。但與圖4A所不同，第4輪不同分層酒醅樣本較為分散，而第5輪不同分層酒醅樣本較為集中。由此可見，不同輪次酒醅中微生物結(jié)構(gòu)存在較大的差異。

2.5 微生物群落與理化指標(biāo)間關(guān)聯(lián)分析

為探究酒醅微生物對(duì)其品質(zhì)的影響，本研究采用Spearman秩相關(guān)性分析對(duì)酒醅中優(yōu)勢(shì)菌屬與理化特性及感官品質(zhì)進(jìn)行了解析，相關(guān)性分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同分層酒醅中理化指標(biāo)、感官品質(zhì)與優(yōu)勢(shì)菌屬的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of physicochemical and sensory quality and dominant microbial genera in different layers of alcoholic fermentative material

由圖5可知，第5輪次酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌屬與其各品質(zhì)指標(biāo)間存在這較為復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系。水分含量與Bacillus顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與Zygosaccharomyces顯著正相關(guān)（P＜0.05）；酸度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和淀粉含量均與Lactobacillus及Levilactobacillus顯著正相關(guān)（P＜0.05）；酒醅中還原糖含量與微生物的相關(guān)關(guān)系較為復(fù)雜，其與Lactobacillus及Levilactobacillus顯著正相關(guān)（P＜0.05），而與Lentibacillus、Kroppenstedtia和Thermoactinomyces、Candida和Zygosaccharomyces顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus與W1S、W5S、W1W、W6S和W2W顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與W5C顯著正相關(guān)（P＜0.05）；Acetilactobacillus、Thermoascus和Rasamsonia與苦味顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而Lentibacillus、Bacillus、Kroppenstedtia和Thermoactinomyces與后味-B顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

酒醅作為醬香型白酒發(fā)酵的重要基質(zhì)，對(duì)其品質(zhì)的好壞具有決定作用[26]。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)第4、5輪次酒醅所發(fā)酵的基酒品質(zhì)最佳[6]。本研究團(tuán)隊(duì)在前期針對(duì)同一窖池第4輪次不同分層酒醅中的微生物和感官理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)同一窖池不同空間分布酒中下層酒醅微生物及風(fēng)味組成更為獨(dú)特[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究針對(duì)醬香白酒第5輪次窖池不同分層酒醅展開了進(jìn)一步研究。

盡管同一窖池不同分層酒醅中的溫度和水分等環(huán)境因素存在較大差異[10]，但菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)、酵母菌和霉菌數(shù)均無(wú)明顯差異，這與第4輪次檢測(cè)結(jié)果存在較大的差異[14]，這可能與窖池深度和發(fā)酵輪次有關(guān)[27]。在理化指標(biāo)上，第5輪次中層和下層的差異較大，中層酒醅的酸度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、淀粉含量和還原糖等指標(biāo)均高于下層，而上述指標(biāo)均與微生物的生長(zhǎng)存在密切的關(guān)系，且微生物亦可通過(guò)自身代謝影響其含量。因此，許多經(jīng)驗(yàn)豐富的釀酒師可以通過(guò)上層指標(biāo)判斷發(fā)酵進(jìn)程和基酒的品質(zhì)[28]。隨著窖池深度的增加，酒醅的水分含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，這與酒醅的發(fā)酵溫度密切相關(guān)。酒醅下層的溫度較高，上層溫度較低，這使得水分向上遷移，而水分含量和溫度的差異可能直接導(dǎo)致酒醅菌群結(jié)構(gòu)存在較大的差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)中層和下層酒醅的滋味品質(zhì)較為相似，而上層酒醅較為獨(dú)特，而值得注意的是，上層酒醅的苦味和苦的回味較淡。在風(fēng)味方面，上層和中層酒醅整體較為接近，與下層差異較大，但不同分層在芳香味上均無(wú)明顯關(guān)系，而有研究表明白酒的芳香味的陳釀?dòng)嘘P(guān)[29]。由此可見，第5輪次不同分層酒醅中理化和感官品質(zhì)之間均存在較大差異。

測(cè)序結(jié)果顯示第5 輪次酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為Acetilactobacillus、Lactobacillus、Sarocladium和Thermoascus等，與前人的研究一致[30]。相關(guān)研究證實(shí)Acetilactobacillus、Lactobacillus和Thermoascus可積極參與白酒的發(fā)酵進(jìn)程，且Acetilactobacillus和Lactobacillus對(duì)于白酒的香味形成具有積極作用[30]。通過(guò)對(duì)不同輪次和分層酒醅中的差異菌屬進(jìn)行甄別發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬在第4輪次的不同分層酒醅中存在較大差異，但在第5輪次酒醅中差異較小。值得注意的是，大部分優(yōu)勢(shì)菌屬在第5輪次的酒醅中富集，其相對(duì)豐度明顯高于第4輪次。在α多樣性方面，不同輪次之間亦存在較大差異，但第4輪次不同分層之間差異較小，而第5輪次不同分層之間差異較大。同時(shí)，在β多樣性亦發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律。由此可見，不同輪次中微生物構(gòu)成和分布規(guī)律存在較大的差異，而上述差異可能導(dǎo)致基酒的品質(zhì)的不穩(wěn)定。因此，為保證基酒品質(zhì)的穩(wěn)定，針對(duì)不同輪次對(duì)工藝進(jìn)行調(diào)整十分必要。

相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí)了微生物在生態(tài)中存在的積極作用，由于不同發(fā)酵條件的差異使得微生物的構(gòu)成存在明顯的差異。相關(guān)研究證實(shí)，復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中大部分微生物功能會(huì)存在“冗余”現(xiàn)象[31]，這也導(dǎo)致盡管不同酒醅中微生物結(jié)構(gòu)存在一定差異，但酒醅的已知可測(cè)諸多屬性基本相同。本研究中第5輪次不同分層酒醅理化感官品質(zhì)之間存在較大差異，這可能是由部分微生物的特殊功能相關(guān)[9]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，第5輪次酒醅發(fā)酵的白酒品質(zhì)較佳，不同分層酒醅的理化指標(biāo)、微生物生長(zhǎng)等存在差異。在后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大酒醅的采樣范圍和數(shù)量，并結(jié)合純培養(yǎng)、宏基因組學(xué)和全基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步解析微生物在醬香型白酒多輪次發(fā)酵過(guò)程中的積極作用，以持續(xù)揭示傳統(tǒng)工藝、功能微生物群落演替、原酒品質(zhì)之間的內(nèi)在規(guī)律，為工藝創(chuàng)新和原酒品質(zhì)提升奠定必要基礎(chǔ)。