鄭 杰，譚小麗，胡近近，陶能國，歐陽秋麗，李茂慧，李 路

（湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

柑橘作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一，其風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。但柑橘在采后極易受到指狀青霉（Penicillium digitatum）、意大利青霉（P.italicum）、酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）等采后致病真菌的侵染[2-3]。近年，柑橘酸腐病的發(fā)生呈上升趨勢，在潮濕多雨季節(jié)尤為嚴(yán)重[4-5]?；瘜W(xué)防治是防控柑橘酸腐病的主要方法，但常用于柑橘病害防控的殺菌劑如抑霉唑、咪鮮胺等對(duì)酸腐病的防控均沒有顯著效果，目前只有雙胍鹽類藥物對(duì)酸腐病菌具有一定的抑制作用[6-7]。因此，深入研究酸腐病菌與柑橘果實(shí)在采后貯藏期的互作關(guān)系對(duì)于酸腐病的防控具有重要意義[8]。

環(huán)境pH值對(duì)病原真菌的生長發(fā)育和代謝具有一定調(diào)控作用，而病原真菌對(duì)環(huán)境pH值也具有一定的適應(yīng)和調(diào)節(jié)能力。其中，由轉(zhuǎn)錄因子PacC介導(dǎo)的pH值信號(hào)響應(yīng)途徑在微生物中廣泛存在，調(diào)控多種植物病原真菌的環(huán)境適應(yīng)性、次級(jí)代謝和致病性[9]。例如，PacC的缺失可以影響果生刺盤孢（Colletotrichum fructicola）的菌絲生長、孢子萌發(fā)、附著胞形成及致病力[7]；擴(kuò)展青霉（P.expansum）PacC缺失突變體的生長與分生速率及其對(duì)蘋果和梨果實(shí)的致病力均顯著下降，且在pH＞6.0時(shí)不能產(chǎn)生棒曲霉毒素[10]。目前，酸腐病菌對(duì)環(huán)境pH值的適應(yīng)性以及PacC的調(diào)控作用還未完全揭示。因此，本研究首先研究不同pH值對(duì)酸腐病菌生長的影響，在全基因組水平篩選酸腐病菌PacC序列的信息，對(duì)其親緣關(guān)系、基因及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，隨后測定其在不同pH值以及果實(shí)侵染過程中的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步研究柑橘酸腐病菌的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸腐病菌菌株從湘潭大學(xué)附近果園中自然腐爛的柑橘果實(shí)表面分離純化得到[11]，現(xiàn)保存于湘潭大學(xué)生物與食品工程系菌種保藏室。

總RNA提取試劑盒 福州飛凈生物科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR SYBR Green Master Mix、PhyZolTMTotal RNA Extraction Reagent、Hifair?III 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒 翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-W型pH計(jì) 上海班特儀器有限公司；ABI 2720型PCR儀 美國ABI公司；OSE-260-03型超微量定量儀 天根生化科技（北京）有限公司；LightCycler96型熒光定量儀 瑞士Roche公司；FA1004N型分析天平 上海精密科學(xué)儀器廠；SW-CJ-1D型垂直凈化工作臺(tái) 濟(jì)南啟科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柑橘酸腐病菌PacC候選基因的篩選

本課題組前期送樣至北京諾禾致源生物信息技術(shù)有限公司使用SMRT技術(shù)，結(jié)合Illumina Hiseq-PE150測序和Pacific Biosciences RSII測序?qū)λ岣【蚪M進(jìn)行測序[12]。根據(jù)基因注釋信息篩選出PacC候選基因，并對(duì)其進(jìn)行分析。

1.3.2 不同物種間PacC基因編碼氨基酸序列比對(duì)與保守基序分析

在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中查找并下載其他采后致病菌PacC編碼的氨基酸序列，利用軟件ClustalX和GeneDoc將不同物種間同源基因的氨基酸序列比對(duì)，利用在線網(wǎng)站MEME Suite 5.4.1（https://memesuite.org/meme/）并結(jié)合MEGA7.0軟件與TBtools軟件預(yù)測該基因的保守基序[13-14]。

1.3.3 不同物種間的PacC系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000 次重新采樣評(píng)估，其他參數(shù)均為標(biāo)準(zhǔn)值[15]。

1.3.4 柑橘酸腐病菌PacC結(jié)構(gòu)特征及染色體分布

利用在線網(wǎng)站GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab.org/）對(duì)PacC轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用在線網(wǎng)站MG2Cv2.1（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）對(duì)其家族成員所在染色體位置進(jìn)行分析[16]。

1.3.5 酸腐病菌PacC編碼蛋白結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)分析

利用NCBI ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)PacC開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測，利用在線分析網(wǎng)站ExPASy中的在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)PacC編碼蛋白產(chǎn)物的相關(guān)理化性質(zhì)預(yù)測[17]，利用在線分析網(wǎng)站ExPASy ProtScal（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）程序，對(duì)PacC編碼產(chǎn)物的疏水性和親水性進(jìn)行分析；利用在線網(wǎng)站TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）對(duì)PacC相關(guān)跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行生物學(xué)特性分析；利用SignalP 5.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）工具對(duì)PacC信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測[18]；利用NetPhos3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）在線分析工具對(duì)PacC磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析；利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）對(duì)PacC蛋白的功能進(jìn)行亞細(xì)胞定位[19]；通過在線網(wǎng)站Swiss-Modeling（https://swissmodel.expasy.org）對(duì)PacC的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模，獲得其氨基酸序列，預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)[20]。

1.3.6 不同pH值下酸腐病菌菌絲生長量的測定

參考Tan Xiaoli等[21]的方法，略有修改，于pH 1.0、2.0、2.2、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDB培養(yǎng)基中加入1 mL終濃度為106spores/mL酸腐病菌孢子懸浮液，每個(gè)處理3 瓶，置于28 ℃搖床（160 r/min）振蕩培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束，離心收集沉淀，沉淀用無菌水重懸兩次，最后將沉淀置于－80 ℃超低溫冰箱冷凍，第2天進(jìn)行真空冷凍干燥，分別稱量菌絲干質(zhì)量。

1.3.7 果實(shí)接種

選用成熟度、大小一致的宮川蜜橘（Citrus unshiuMarc.，pH＞3.0）和尤力克檸檬（Citrus limon(L.) Burm.F.，pH＜3.0）作為材料，參考Li Lu等[22]的方法進(jìn)行接種。蒸餾水清洗后在2% NaClO溶液中浸泡2 min，蒸餾水清洗3 次并自然晾干。用無菌手術(shù)刀在果實(shí)赤道部位劃2 個(gè)3 mm×3 mm×2 mm的傷口，放置1 h后，在傷口處接種10 μL酸腐病菌孢子懸浮液（1×107spores/mL），貯藏于28 ℃、相對(duì)濕度85%～90%的密閉培養(yǎng)箱中，每2 d測量果實(shí)發(fā)病部位pH值，每組樣品3 個(gè)平行，并將樣品用液氮速凍，保存于－80 ℃超低溫冰箱[23]，用于后續(xù)RNA的提取。

1.3.8 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析

離體條件下菌絲的收集參考Yuan Xingxing等[24]的方法，略有修改，過濾收集在pH 3.0 PDB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)24 h的柑橘酸腐病菌菌絲，取等量分別轉(zhuǎn)移至pH 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的PDB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)1 h后，收集菌絲，于－80 ℃保存，用于后續(xù)RNA的提取。

使用PhyZolTMTotal RNA Extraction Reagent提取離體條件培養(yǎng)以及腐爛果實(shí)的酸腐病菌菌絲總RNA，利用Hifair?III 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈。用cDNA模板檢測各基因表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量引物，引物序列見表1，送至擎科（長沙）生物科技有限公司合成。使用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)體系：10.0 μL Blue qPCR SYBR Green Master Mix，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），1.0 μL模板，8.2 μL ddH2O。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)，離體培養(yǎng)的樣品以pH 3.0處理為對(duì)照，果實(shí)樣品以發(fā)病2 d組織中病原菌基因轉(zhuǎn)錄水平作為對(duì)照，采用2－ΔΔCt法計(jì)算PacC在不同處理中的相對(duì)表達(dá)量[25]。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)所得3 個(gè)平行數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，采用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖，利用SPSS 25.0采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05認(rèn)為存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘酸腐病菌PacC生物信息學(xué)分析

2.1.1 柑橘酸腐病菌PacC候選基因的篩選結(jié)果

根據(jù)柑橘酸腐病菌全基因組基因注釋信息篩選到2 個(gè)PacC候選基因PacC1和PacC2。它們與白地霉PacC基因同源性分別高達(dá)76.7%和74.7%，可能具備PacC相似功能，因此，后續(xù)對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析。

2.1.2 不同物種間PacC基因編碼氨基酸序列比對(duì)與保守基序分析

通過與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、指狀青霉（P.digitatum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等其他真菌的PacC基因編碼氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)酸腐病菌PacC與上述比對(duì)真菌的蛋白結(jié)構(gòu)相似，均含有3 個(gè)保守的Cys2His2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于C2H2蛋白家族（圖1）。利用在線網(wǎng)站MEME并結(jié)合MEGA7.0和TBtools軟件預(yù)測上述真菌PacC的保守基序，共鑒定出10 個(gè)保守基序，其中Motif1、Motif2、Motif3、Motif7、Motif9高度保守。酸腐病菌PacC1與PacC2結(jié)構(gòu)相似，具有相同的保守基序（Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6、Motif7、Motif9）（圖2）。

圖1 酸腐病菌PacC與其他真菌PacC的蛋白氨基酸比對(duì)Fig.1 Alignment of predicted amino acid sequence of PacC between G.citri-aurantii and other fungi

圖2 酸腐病菌PacC與其他真菌PacC保守基序分析Fig.2 Alignment of predicted conserve motif of PacC between G.citri-aurantii and other fungi

2.1.3 不同物種間的PacC系統(tǒng)進(jìn)化分析

由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，酸腐病菌的PacC1和PacC2親緣關(guān)系最近。測試物種中，與指狀青霉（P.digitatum）、產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum）以及黑曲霉（A.niger）的親緣關(guān)系較近，與釀酒酵母（S.cerevisiae）、白色念珠菌（C.albicans）等物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

圖3 酸腐病菌PacC與其他真菌PacC的親緣關(guān)系Fig.3 Phylogenetic tree showing genetic relationship between G.citri-aurantii and fungi based on PacC

2.1.4 柑橘酸腐病菌PacC結(jié)構(gòu)特征及染色體分布

利用在線網(wǎng)站GSDS 2.0與MG2C v2.1對(duì)PacC1與PacC2的結(jié)構(gòu)與染色體分布進(jìn)行分析。由圖4可知，PacC1與PacC2均只有外顯子結(jié)構(gòu)，外顯子長度分別為1 872 bp和1 779 bp，均無內(nèi)含子與UTR區(qū)域。根據(jù)圖5可知，PacC1與PacC2分別位于第3號(hào)染色體和第10號(hào)染色體上，第3號(hào)染色體長度為2 879 209 bp，PacC1位于1 832 639～1 834 510 bp之間。第10號(hào)染色體長度為1 531 806 bp，PacC2位于877 315～879 093 bp之間。

圖4 柑橘酸腐病菌PacC結(jié)構(gòu)特征Fig.4 Structural characterization of PacC of G.citri-aurantii

圖5 柑橘酸腐病菌PacC染色體分布Fig.5 Chromosome distribution of PacC of G.citri-aurantii

2.1.5 酸腐病菌PacC蛋白結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)分析

由圖6可知，PacC1與PacC2的蛋白結(jié)構(gòu)具有一定差異。對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PacC1與PacC2均為親水性的不穩(wěn)定蛋白[26]，沒有跨膜位點(diǎn)與信號(hào)肽，WoLF PSORT亞細(xì)胞定位顯示二者均在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能調(diào)控作用。它們?cè)诜肿淤|(zhì)量、等電點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)等方面存在一定差異。其中，PacC1蛋白對(duì)應(yīng)堿基數(shù)為1 872 bp，編碼623 個(gè)氨基酸，PacC1分子質(zhì)量為67.80 kDa，等電點(diǎn)為6.71，可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有Ser56、Thr18、Tyr8；PacC2蛋白對(duì)應(yīng)含1 779 個(gè)堿基，編碼592 個(gè)氨基酸，PacC2分子質(zhì)量為64.32 kDa，等電點(diǎn)為8.50，Ser72、Thr18、Tyr13位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化（表2）。PacC1和PacC2蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測見圖6。

圖6 PacC1（A）與PacC2蛋白（B）高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of protein structure of PacC1 (A) and PacC2 (B) of G.citri-aurantii

表2 酸腐病菌PacC1與PacC2理化性質(zhì)比較Table 2 Comparison of physicochemical properties between G.citri-aurantii PacC1 and PacC2

2.2 不同pH值對(duì)酸腐病菌菌絲生長量和PacC表達(dá)量的影響

2.2.1 不同pH值對(duì)酸腐病菌菌絲生長量的影響

如圖7所示，酸腐病菌在pH 2.0～11.0范圍內(nèi)均能生長，其中pH 3.0菌絲生長量顯著高于其他pH值，其次是pH 4.0。在pH 2.5和pH 5.0～10.0范圍內(nèi)菌絲生長量沒有顯著差異。pH 2.2和11.0菌絲生長受到顯著抑制，在pH＜2.2時(shí)幾乎不生長。由此可知，pH值對(duì)酸腐病菌的生長具有調(diào)控作用，酸腐病菌具有廣泛的pH值適應(yīng)性，但其最適生長pH值約為3.0，這與許多柑橘品種果實(shí)pH值接近[27]。

圖7 不同pH值對(duì)培養(yǎng)2 d酸腐病菌菌絲生長量的影響Fig.7 Effect of different pH on the growth of G.citri-aurantii mycelium cultured for two days

2.2.2 離體條件下不同pH值對(duì)PacC表達(dá)量的影響

以酸腐病菌最適生長pH值（pH 3.0）為對(duì)照，比較PacC1和PacC2在不同pH值的表達(dá)情況。結(jié)果表明，PacC1和PacC2的表達(dá)均受pH值調(diào)控，且兩個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢具有一定相似性。處理1 h時(shí)，PacC1和PacC2表達(dá)均在pH 11.0顯著上調(diào)（P＜0.05），相對(duì)表達(dá)量分別約為對(duì)照的2.24 倍和1.62 倍；PacC1表達(dá)量在其他pH值條件下沒有顯著差異，但PacC2在pH 1.0時(shí)幾乎不表達(dá)（圖8）。處理24 h時(shí)，PacC1和PacC2表達(dá)量在pH 9.0和pH 11.0均顯著上調(diào)，其中pH 9.0處理中的兩個(gè)基因表達(dá)量均約為對(duì)照的4.8 倍，PacC1在pH 11.0的表達(dá)量約為對(duì)照的8.5 倍，而PacC2的上調(diào)倍數(shù)更高，約為對(duì)照的13 倍，兩個(gè)基因在其他pH值的表達(dá)水平相似，但pH 1.0時(shí)PacC2的表達(dá)量顯著上調(diào)。

圖8 不同pH值對(duì)酸腐病菌PacC1與PacC2表達(dá)的影響Fig.8 Effects of different pH on the expression levels of PacC1 and PacC2 in G.citri-aurantii

2.3 PacC在酸腐病菌侵染柑橘果實(shí)侵染過程中的表達(dá)情況

宮川蜜橘果實(shí)人工接種酸腐病菌2 d時(shí)，果實(shí)傷口處可見明顯軟腐癥狀，病斑直徑為（1.97±0.13）cm，4 d出現(xiàn)白色霉層，病斑直徑達(dá)到（3.88±0.06）cm，至發(fā)病6 d時(shí)，果實(shí)幾乎完全腐爛（圖9A、B）。果實(shí)發(fā)病過程中腐爛部位的pH值呈下降趨勢，在6 d時(shí)下降約0.2，顯著低于對(duì)照（圖9C）。酸腐病菌兩個(gè)PacC的表達(dá)總體呈上調(diào)趨勢，但PacC1對(duì)pH值變化的響應(yīng)更快，侵染4 d時(shí)表達(dá)量即顯著高于2 d，侵染6 d時(shí)表達(dá)量上調(diào)至2 d的3.9 倍，而PacC2的表達(dá)量在6 d才有顯著上調(diào)（圖9C）。尤力克檸檬果實(shí)人工接種酸腐病菌2 d時(shí)，果實(shí)傷口處也可見明顯軟腐癥狀，病斑直徑為（1.92±0.14）cm，4 d時(shí)軟腐面積加大，病斑直徑為（3.80±0.05）cm，至發(fā)病6 d時(shí)果實(shí)幾乎被白色霉層覆蓋，完全腐爛（圖10A、B），發(fā)病過程中腐爛部位的pH值呈上升趨勢，至接種6 d時(shí)上升約0.4，顯著高于對(duì)照（圖10C）。酸腐病菌兩個(gè)PacC的表達(dá)量均在侵染6 d時(shí)發(fā)生顯著上調(diào)（圖10C）。

圖9 酸腐病菌侵染過程中PacC的表達(dá)量與蜜橘果實(shí)發(fā)病部位pH值的關(guān)系Fig.9 Relationship between PacC expression and pH change of mandarin wounds infected with G.citri-aurantii

圖10 酸腐病菌侵染過程中PacC的表達(dá)量與檸檬果實(shí)發(fā)病部位pH值的關(guān)系Fig.10 Relationship between PacC expression and pH change of lemon fruit wounds infectedwith G.citri-aurantii

3 討論

采后病原真菌的侵染能力受寄主傷口、溫度、濕度和環(huán)境pH值等因素的影響，其中環(huán)境pH值對(duì)病原真菌的生長和致病力有重要調(diào)控作用[28]。許多病原真菌通過調(diào)整對(duì)微量元素的利用和體內(nèi)一些蛋白質(zhì)的功能應(yīng)對(duì)環(huán)境pH值的變化，因此具有廣泛pH值適應(yīng)性。目前，絲狀真菌中報(bào)道較多的pH值響應(yīng)機(jī)制為pal途徑，該途徑包含7 個(gè)基因：pacC/pacl、palA、palB、palC、palF、palH和palI，其中，PacC作為重要的環(huán)境pH值調(diào)節(jié)因子，在微生物調(diào)節(jié)、適應(yīng)環(huán)境的過程中發(fā)揮重要作用[9]。PacC的結(jié)構(gòu)高度保守，PacC蛋白屬于C2H2蛋白家族，含有3 個(gè)保守的Cys2His2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域[29-31]。采后致病真菌中，意大利青霉和指狀青霉PacC均具有此結(jié)構(gòu)[9]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸腐病菌候選PacC的氨基酸序列和保守基序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)候選基因均具有PacC的保守結(jié)構(gòu)，且系統(tǒng)發(fā)育樹也表明其親緣關(guān)系與柑橘采后致病菌指狀青霉較近，說明其可能與指狀青霉PacC具有類似功能。指狀青霉同樣是嗜酸真菌，在侵染柑橘果實(shí)過程中PacC表達(dá)水平呈顯著上調(diào)，且可能參與酸分泌過程改變環(huán)境pH值，PacC功能的缺失可導(dǎo)致病菌致病性顯著下降[9,32]。此外，指狀青霉PacC在離體堿性條件下有高水平表達(dá)，對(duì)指狀青霉的環(huán)境適應(yīng)性有重要意義[32]。因此，推測酸腐病菌PacC在柑橘果實(shí)致病性和病原菌環(huán)境適應(yīng)性中可能具有重要調(diào)控作用。進(jìn)一步對(duì)酸腐病菌兩個(gè)PacC的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PacC1與PacC2位于不同染色體（圖5），在等電點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)等方面有較大差異（表2），推測這兩個(gè)基因在功能上也存在一定差異。

不同的寄主組織存在顯著性的pH值差異，不同病原菌生長的適宜pH值及耐受范圍也存在較大差異[28]。陳彥等[33]研究發(fā)現(xiàn)葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）菌絲在pH 3.0～5.0條件下生長較為迅速，且最適pH值約為4.0；而王宏等[34]研究發(fā)現(xiàn)梨鏈格孢菌（Alternaria alternata）可在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)生長，最適pH值約為7.0～8.0。本實(shí)驗(yàn)中，離體條件下，柑橘酸腐病菌具有較廣的pH值適應(yīng)能力，但pH 3.0～4.0范圍的生長量顯著高于其他pH值（圖7），而其寄主pH值范圍大多約為2.0～6.0，其中檸檬類果實(shí)pH值約為2.2，寬皮柑橘類果實(shí)pH值約為3.0，甜橙類果實(shí)pH值約為5.0[35]。因此，推測酸腐病菌在寬皮柑橘類果實(shí)中具有更強(qiáng)的生長能力，而實(shí)際上，酸腐病菌對(duì)pH值極低的檸檬果實(shí)也有較強(qiáng)侵染力，這可能與其pH值調(diào)節(jié)能力有關(guān)。

大量研究表明，中性到堿性條件下，PacC在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，這些基因參與病原真菌的細(xì)胞壁合成、跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、真菌毒力、菌絲生長、離子脅迫等方面[36-38]。如指狀青霉PacC在堿性條件下處理48 h時(shí)的表達(dá)量即上升為對(duì)照的8.4 倍；指狀青霉PacC缺失突變體在堿性環(huán)境中無法生長，對(duì)果膠的利用能力和柑橘的致病性也大幅下降[9]。但是PacC在酸性條件下的表達(dá)模式不盡相同。馮越等[39]研究發(fā)現(xiàn)，意大利青霉PacC在酸性環(huán)境中的表達(dá)量顯著下調(diào)。而指狀青霉PacC的表達(dá)不受果皮酸性環(huán)境的影響[9]。同樣，灰霉病菌PacC缺失突變體的致病性在組織pH值為酸性的寄主中也沒有變化[40]。本實(shí)驗(yàn)中，離體條件下培養(yǎng)的酸腐病菌從最適生長pH 3.0培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到不同pH值培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1 h時(shí)，PacC1和PacC2均能對(duì)環(huán)境pH值進(jìn)行迅速響應(yīng)，在顯著抑制菌絲生長的pH 11.0處理中表達(dá)迅速上調(diào)（圖8），培養(yǎng)24 h時(shí)，兩個(gè)PacC的表達(dá)量在pH 9.0和pH 11.0的處理中均顯著上調(diào)，且pH 11.0處理中表達(dá)量更高（圖8），說明堿性環(huán)境能誘導(dǎo)酸腐病菌PacC的高水平表達(dá)，這與上述采后致病菌PacC的表達(dá)情況一致。值得注意的是，PacC1和PacC2在某些酸性條件下的表達(dá)趨勢有顯著差異，如pH 1.0處理1 h，PacC2的表達(dá)被顯著抑制，同樣，PacC2的表達(dá)水平在pH 3.0處理24 h也顯著下降，而PacC1的表達(dá)未發(fā)生顯著變化（圖8），說明酸腐病菌PacC的表達(dá)也受酸性環(huán)境調(diào)控，可能在侵染柑橘果實(shí)過程中也有類似情況，而這兩個(gè)基因呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式可能與其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異相關(guān)。

在侵染初期，采后病原真菌通常分泌酸或堿以調(diào)節(jié)侵染位點(diǎn)pH值以加速侵染進(jìn)程，這一過程可能與PacC的調(diào)控有關(guān)[41-43]。如炭黑曲霉（A.carbonarius）PacC缺失株侵染葡萄時(shí)不再分泌葡萄糖酸和檸檬酸[42]；核盤病菌（Sclerotinia sclerotiorum）PacC直接調(diào)控草酸的分泌降低侵染位點(diǎn)pH 值[10]。膠胞炭疽菌（C.gloeosporioides）可在鱷梨組織中分泌氨，進(jìn)而導(dǎo)致侵染位點(diǎn)pH值升高[44]。本實(shí)驗(yàn)中，人工接種酸腐病菌的宮川蜜橘和尤力克檸檬果實(shí)侵染位點(diǎn)pH值的變化呈相反趨勢。宮川蜜橘果實(shí)初始pH值約為3.30，隨著病斑面積的擴(kuò)大，發(fā)病部位的pH值逐漸下降至3.11，說明酸腐病菌與宮川蜜橘果實(shí)互作過程中的產(chǎn)物可導(dǎo)致果實(shí)腐爛部位pH值的下降，有利于病原菌的擴(kuò)繁。接種后4～6 d果實(shí)病斑面積急劇增大，同時(shí)酸腐病菌PacC的表達(dá)量也上調(diào)，說明酸腐病菌PacC很可能參與對(duì)環(huán)境pH值的調(diào)控，從而促進(jìn)侵染進(jìn)程。PacC在酸腐病菌侵染尤力克檸檬果實(shí)過程中也發(fā)揮類似作用，但侵染位點(diǎn)pH值呈上升趨勢。雖然不同品種果實(shí)發(fā)病部位pH值的變化趨勢不同，但發(fā)病后期的組織pH值均更接近酸腐病菌生長的最適pH值。王哲[45]的研究發(fā)現(xiàn)，酸腐病菌侵染柑橘果實(shí)時(shí)分泌葡萄糖酸和另一種有機(jī)酸使侵染位點(diǎn)pH值下降，但酸腐病菌是否能通過分泌氨上調(diào)侵染位點(diǎn)pH值還有待證實(shí)。

4 結(jié)論

環(huán)境pH值對(duì)柑橘酸腐病菌的生長具有調(diào)控作用，同時(shí)，酸腐病菌也可以一定程度的調(diào)節(jié)環(huán)境pH值。酸腐病菌的2 個(gè)PacC均能在堿性條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，但由于基因結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的差異，它們對(duì)pH值的響應(yīng)程度和方式也有一定差別。兩個(gè)PacC對(duì)于酸腐病菌廣泛的pH值適應(yīng)性以及柑橘果實(shí)侵染進(jìn)程具有重要作用。