任昕淼，肖夢(mèng)詩(shī)，南世豪，陳偉苗，李 蓉，付曉丹,*，牟海津,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)，中國(guó)-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西省生物活性多糖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；3.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003；4.青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266003）

嬰兒腸道菌群與嬰兒早期發(fā)育和后天疾病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。新生兒腸道內(nèi)最初由需氧和兼性厭氧的腸球菌屬（Enterococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）定植，隨后嚴(yán)格厭氧的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、梭菌屬（Clostridium）和擬桿菌屬（Bacteroides）開(kāi)始定植，并逐步成為腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群[1]。在嬰兒0～2 歲間腸道菌群發(fā)育的窗口期，嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)受到分娩方式[2]、喂養(yǎng)方式[3]、抗生素的使用[4]、母乳寡糖分泌類(lèi)型[5]以及各種生存環(huán)境因素的影響。不同腸道微生物譜對(duì)嬰幼兒腸道發(fā)育和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用不同，并且影響后天過(guò)敏反應(yīng)，肥胖，炎癥性腸病、腸易激綜合征等代謝紊亂疾病的發(fā)生概率[6]。因此，生命早期有益腸道微生物群的構(gòu)建非常重要。

巖藻糖基寡糖有益生[7]、抗癌[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]等多種生理活性，在食品和藥品的開(kāi)發(fā)中受到高度關(guān)注。盡管巖藻糖基化是自然界中最常見(jiàn)的糖基化形式之一，但巖藻糖基寡糖的天然豐度非常低[10]。母乳是巖藻糖基寡糖的來(lái)源之一，母乳中大于50%母乳寡糖是巖藻糖基化的，包括2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosylactose，2’-FL）、3-巖藻糖基乳糖等，其中2’-FL在母乳寡糖中占比近30%，是母乳中含量最豐富的寡糖之一[11]。作為嬰兒營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域新興的功能性成分，2’-FL在構(gòu)建腸道微生物群的重要作用受到廣泛認(rèn)同。研究表明，配方奶粉中添加2’-FL能夠選擇性增殖嬰兒腸道中雙歧桿菌等有益菌的豐度，與母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群特征相同[12]。腸道有益菌利用益生元產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，尤其是短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），是嬰兒腸道重要的營(yíng)養(yǎng)素。

除了母乳來(lái)源，巖藻糖基寡糖還可以從富含巖藻糖的動(dòng)物、植物和微生物多糖中獲得，例如含巖藻糖的微生物胞外多糖（fucose-containing microbial exopolysaccharides，F(xiàn)cEPS）[13]。細(xì)菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）由于其新穎特殊的組成結(jié)構(gòu)和高效便捷的生產(chǎn)工藝，受到不少研究人員的關(guān)注。近幾十年來(lái)，不同細(xì)菌產(chǎn)生的EPS組成、結(jié)構(gòu)和功能特性也得到了廣泛研究。其中，產(chǎn)FcEPS的細(xì)菌有上百余種，克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）、克拉維桿菌（Clavibactersp.）和腸桿菌（Enterobactersp.）是產(chǎn)FcEPS菌種的豐富來(lái)源[14]?？死S桿菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的EPS中，巖藻糖含量超過(guò)30%，是比較理想的巖藻糖基寡糖來(lái)源之一[15-16]。

商業(yè)化的2’-F L 在嬰幼兒配方食品中應(yīng)用有限。目前，嬰幼兒配方食品中以低聚果糖（fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）和低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）等普遍商用益生元作為替代母乳寡糖功能的添加物，但GOS和FOS與母乳寡糖的結(jié)構(gòu)差異大，存在功能的局限性。EPS酸解獲得的巖藻糖基寡糖，與巖藻糖基化母乳寡糖具有相似的單糖組成，本研究在體外發(fā)酵過(guò)程中，比較3 株雙歧桿菌和2 株乳酸菌對(duì)EPS制備的巖藻糖基化胞外多糖降解產(chǎn)物（degradation products of fucosylated exopolysaccharide，DFcP）的利用和代謝偏好，分析DFcP對(duì)嬰兒糞便菌群組成和代謝產(chǎn)物SCFAs的影響，旨在為發(fā)掘EPS來(lái)源巖藻糖基化碳水化合物作為嬰兒腸道益生元的功能活性及其未來(lái)開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697（Bifidobacterium longumsubsp.infantisATCC 15697，后稱為嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697）、短雙歧桿菌ATCC 15700（B.breveATCC 15700）、長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種ATCC BAA-999（B.longumsubsp.longumBAA-999）美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；干酪乳桿菌ZX147（Lactobacillus caseiZX147）、植物乳桿菌CGMCC 1.19（Lactobacillus plantarumCGMCC 1.19）、乳酸乳球菌M1（Lactococcus lactisM1）和坂崎腸桿菌M1（Enterobacter sakazakiiM1）由中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。2～6 月齡嬰兒糞便由青島婦女兒童醫(yī)院捐贈(zèng)提供，樣品收集過(guò)程符合醫(yī)院倫理要求（審批號(hào)QFELL-YJ-2020-27）。

FcEPS由本實(shí)驗(yàn)室提供；2’-FL 美國(guó)Layer Origin Nutrition公司；Silica gel 60 F254薄層層析色譜（thin-layer chromatography，TLC）板 德國(guó)Merck公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（甲酸、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸（異丁酸和正丁酸））、內(nèi)標(biāo)異己酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50＋真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LAI-3T-N厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；1260高效液相色譜系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器）美國(guó)Agilent公司；PacBio Sequel II單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（single molecule real time sequencing，SMRT）系統(tǒng)美國(guó)Pacific Biosciences公司；QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Applied Biosystems公司；1510型酶標(biāo)儀、Sorvall Legend Micro 17低溫冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 FcEPS的制備

將接種坂崎腸桿菌M1菌株制備的5 L發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，上清液于55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/4體積，加入4 倍體積的無(wú)水乙醇過(guò)夜醇沉后4 000 r/min離心20 min，沉淀用超純水復(fù)溶，加入1/5體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V），充分振蕩30 min后置于分液漏斗中靜置分層，取水相層再加入1/5體積的Sevag試劑，重復(fù)操作3 次。上層水相進(jìn)一步冷凍干燥，獲得FcEPS。

1.3.2 DFcP的制備純化和單糖組成測(cè)定

10 g FcEPS用1 L 0.2 mol/L HCl溶液溶解，于80 ℃振蕩反應(yīng)4 h后，冷卻后加入6 mol/L NaOH溶液中止酸解反應(yīng)。酸解中和液（pH 6.5）于55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/4體積，加入3 倍體積的95%乙醇溶液，4 ℃醇沉過(guò)夜，4 000×g離心20 min收集醇沉上清液，旋蒸濃縮后冷凍干燥獲得粗DFcP。使用乳酸乳球菌M1發(fā)酵脫除可消化性單糖（葡萄糖和半乳糖），發(fā)酵條件如下：粗DFcP質(zhì)量濃度為20 g/L，接菌量為1%，37 ℃培養(yǎng)24 h，獲得脫除半乳糖和葡萄糖的DFcP。

FcEPS和DFcP的單糖組成通過(guò)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-4H-pyrazol-3-one，PMP）柱前衍生法測(cè)定。2 mg樣品溶于2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液中，于110 ℃水解6 h后，按照范斌等[17]的PMP衍生方法和高效液相色譜參數(shù)進(jìn)行單糖組成測(cè)定。

1.3.3 益生菌的體外純培養(yǎng)

MRS肉湯培養(yǎng)基（含有0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽）用于體外培養(yǎng)3 株雙歧桿菌（嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700、長(zhǎng)雙歧桿菌BB536）和2 株乳桿菌（干酪乳桿菌ZX147和植物乳桿菌CGMCC 1.19）。無(wú)糖MRS培養(yǎng)基為空白組（CK組），其中酵母提取物和蛋白胨質(zhì)量濃度分別調(diào)整為2.5 g/L和5 g/L。將DFcP和2’-FL以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%分別添加到無(wú)糖MRS培養(yǎng)基中作為DFcP組和2’-FL組，每組設(shè)置3 個(gè)平行（n=3）。各菌株接種上述培養(yǎng)基，37 ℃體外培養(yǎng)48 h。在體外純培養(yǎng)的0、12、24、36 h和48 h收集發(fā)酵樣品。樣品冷凍離心后，上清液用于測(cè)定DFcP消耗量和SCFAs產(chǎn)量，沉淀用磷酸鹽緩沖液渦旋復(fù)溶，酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm評(píng)價(jià)菌株生長(zhǎng)情況。

1.3.4 糞便菌群的體外厭氧發(fā)酵

用無(wú)菌的糞便收集管收集4 名健康嬰兒（2～6 月齡）的糞便，于－80 ℃保存。糞便菌群活化和體外發(fā)酵的模擬腸道培養(yǎng)基根據(jù)Fu Xiaodan等[18]的方法配制。發(fā)酵前，嬰兒糞便用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液混勻稀釋?zhuān)? ℃靜置15 min，上清液用模擬腸道培養(yǎng)基進(jìn)行一次活化。體外發(fā)酵時(shí)，將DFcP、2’-FL以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%添加到裝有50 mL模擬腸道培養(yǎng)基的厭氧瓶中，無(wú)糖模擬腸道培養(yǎng)基為空白組（CK組）。4 名嬰兒的活化糞便菌液以體積分?jǐn)?shù)2.5%接種到以上培養(yǎng)基中，37 ℃體外發(fā)酵72 h。在0、12、36 h和72 h收集所有組的發(fā)酵產(chǎn)物，樣品冷凍離心后，上清液用于測(cè)定寡糖的消耗量和SCFAs產(chǎn)量，沉淀用于DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增。

1.3.5 SMRT

36 h糞便發(fā)酵液冷凍離心，用DNA提取試劑盒提取菌體沉淀的DNA，利用PacBio公司的sequel II平臺(tái)進(jìn)行全長(zhǎng)16S rRNA基因測(cè)序（北京百邁客生物科技有限公司）。用于擴(kuò)增16S rRNA 全長(zhǎng)V1～V9區(qū)的引物為27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量并均一化形成測(cè)序文庫(kù)（SMRT Bell），用PacBio Sequel測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。PacBio Sequel的下機(jī)數(shù)據(jù)通過(guò)subreads進(jìn)行校正得到循環(huán)共識(shí)測(cè)序（circular consensus sequencing，CCS）序列（SMRT Link,version8.0），然后使用lima（v1.7.0）軟件，通過(guò)barcode序列識(shí)別不同樣品的CCS并去除嵌合體，得到高質(zhì)量的CCS。Uparse（v7.0.1001）將具有大于97%相似性的序列修剪分配給相同的操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）。Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.arb-silva.de/）基于mothur算法用于注釋生物分類(lèi)信息。

使用實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）對(duì)CK組、DFcP組、2’-FL組36 h糞便發(fā)酵液（n=4）中雙歧桿菌和乳桿菌進(jìn)行絕對(duì)定量。標(biāo)準(zhǔn)品為短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的基因組DNA。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（lg（copies/μL））作為橫坐標(biāo)，以real-time PCR過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct值）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對(duì)定量計(jì)算。反應(yīng)條件、引物序列和計(jì)算方法如Gopalsamy等[19]所述。

1.3.6 TLC

純培養(yǎng)和糞便發(fā)酵過(guò)程中碳水化合物利用TLC進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用正丁醇-乙酸-水（3∶2∶1，V/V）溶液作為流動(dòng)相，苯胺-二苯胺試劑（4 mL苯胺、4 g二苯胺、200 mL丙酮和30 mL 85%磷酸溶液）作為顯色劑。

1.3.7 SCFAs的測(cè)定

使用配備紫外檢測(cè)器（G1314F，210 nm）的1260高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定純培養(yǎng)和糞便發(fā)酵過(guò)程中SCFAs產(chǎn)量。色譜柱為Shodex RSpak KC-811色譜柱（8.0 mm×300 mm，6 μm）。流動(dòng)相為HClO4溶液（pH 2.1），流速為0.8 mL/min。乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，異己酸作為內(nèi)標(biāo)，所有標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 mmol/L。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 FcEPS和DFcP的單糖組成

如圖1 所示，從阪崎腸桿菌中提取的FcEPS由巖藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖組成（（32.81±0.01）%、（32.14±0.01）%、（17.91±0.04）%、（12.49±0.04）%、（4.64±0.03）%），巖藻糖含量豐富。DFcP由巖藻糖（（36.64±0.02）%）、葡萄糖（（35.84±0.02）%）和半乳糖（（21.88±0.01）%）組成，比例約為3∶3∶2，同時(shí)含有少量的甘露糖（（3.57±0.01）%）和鼠李糖（（2.08±0.00）%）。與FcEPS單糖組成相比，DFcP中巖藻糖的物質(zhì)的量占比增加。購(gòu)買(mǎi)的母乳來(lái)源巖藻寡糖2’-FL是一種由乳糖和巖藻糖通過(guò)α-(1,2)-鍵形成的三糖（Fucα1-2Galβ1-4Glc），由葡萄糖、半乳糖和巖藻糖以1∶1∶1的比例組成。2’-FL作為母乳中含量最豐富的巖藻糖基寡糖，目前已經(jīng)作為食品添加劑應(yīng)用于嬰幼兒配方食品中。DFcP的單糖組成結(jié)果顯示，從細(xì)菌EPS酸解獲得DFcP與2’-FL單糖組成相似，是獲得巖藻糖基化碳水化合物的新型來(lái)源。

圖1 FcEPS和DFcP的單糖組成液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of monosaccharide composition of FcEPS and DFcP

2.2 DFcP對(duì)典型益生菌增殖和SCFAs水平的調(diào)控

2.2.1 益生菌對(duì)DFcP的利用水平

圖2顯示各菌株以DFcP為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng)情況（OD600nm）和碳源的消耗利用情況（TLC）。DFcP促進(jìn)嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的增殖，純培養(yǎng)12～48 h內(nèi)OD600nm值均顯著高于CK組（P＜0.05）。TLC顯示2 株雙歧桿菌能夠快速利用DFcP糖組分，而植物乳桿菌CGMCC 1.19對(duì)DFcP的利用率較低。長(zhǎng)雙歧桿菌BB536和干酪乳桿菌ZX147基本不利用DFcP。所有利用DFcP的菌株中，僅嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697表現(xiàn)出對(duì)巖藻糖的快速利用，而其余菌株均無(wú)法有效利用巖藻糖。2’-FL于發(fā)酵48 h被嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697完全利用，OD600nm值顯著高于CK組和DFcP組，接近葡萄糖的促生長(zhǎng)能力，但其余4 株益生菌基本不利用2’-FL生長(zhǎng)增殖，TLC圖譜中2’-FL點(diǎn)基本沒(méi)有變化。已有體外純培養(yǎng)驗(yàn)證了2’-FL不增殖大部分乳桿菌和雙歧桿菌，但選擇性促進(jìn)嬰兒雙歧桿菌增殖的能力，與本研究單菌體外厭氧發(fā)酵的結(jié)果相同[7]。Matsuki等[20]發(fā)現(xiàn)，能夠利用母乳寡糖強(qiáng)烈增殖的菌株中存在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和巖藻糖苷酶基因，表明不同菌株間識(shí)別轉(zhuǎn)運(yùn)含巖藻糖基化碳水化合物的基因和巖藻糖苷酶基因的差異，導(dǎo)致菌株對(duì)DFcP不同的利用偏好，使母乳巖藻糖基寡糖表現(xiàn)出特殊的益生活性。DFcP表現(xiàn)出與2’-FL類(lèi)似的選擇性益生效果，有更廣譜的益生活性。

圖2 DFcP或2’-FL作為唯一碳源對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of DFcP and 2’-FL as sole carbon source on the growth of probiotics

2.2.2 菌株SCFAs產(chǎn)生水平

在體外發(fā)酵48 h后，各菌株SCFAs的產(chǎn)生情況如表1所示。益生菌代謝產(chǎn)物SCFAs積累量與寡糖底物的消耗利用度密切相關(guān)。DFcP 顯著增加了嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的產(chǎn)酸量，總酸濃度分別為（49.23±0.12）、（69.32±3.82）mmol/L和（51.99±6.22）mmol/L，但不能促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌BB536和干酪乳桿菌ZX147產(chǎn)酸，2 株菌的總酸產(chǎn)量均低于10 mmol/L。與DFcP組相比，2’-FL顯著促進(jìn)嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697產(chǎn)生乳酸（（20.22±0.10）mmol/L）（P＜0.05），表明乳酸鹽是嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697代謝2’-FL和DFcP的差異SCFAs。SCFAs的產(chǎn)生水平進(jìn)一步驗(yàn)證了短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19對(duì)DFcP的偏好利用。另外，DFcP促進(jìn)2 株益生菌產(chǎn)丁酸（（2.15±0.19）mmol/L和（3.81±0.45）mmol/L），丁酸鹽主要為腸上皮細(xì)胞提供能量，是維持腸屏障功能完整和健康的關(guān)鍵物質(zhì)[21]。觀察到乙酸是益生菌利用DFcP和2’-FL的主要產(chǎn)物，在總SCFAs中占比最高，大于40%。據(jù)報(bào)道，乙酸鹽是降低腸道內(nèi)的pH值，抑制特定病原菌的繁殖重要貢獻(xiàn)者，是嬰兒腸道早期最重要的SCFAs之一[22]。綜合5 株益生菌底物利用和代謝產(chǎn)酸的結(jié)果，DFcP促進(jìn)嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697，短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的增殖和SCFAs的產(chǎn)生，具有與2’-FL相似的選擇性益生活性。

表1 益生菌SCFAs的產(chǎn)生濃度Table 1 Concentrations of SCFAs produced by probiotics cultured in MRS medium with DFcP and 2’-FL as sole carbon sourcemmol/L

2.3 DFcP對(duì)嬰兒糞便菌群的調(diào)控作用

2.3.1 嬰兒糞便菌群對(duì)DFcP的利用水平

通過(guò)體外厭氧發(fā)酵，探究DFcP對(duì)2～6 月齡嬰兒腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響。通過(guò)TLC法評(píng)價(jià)體外嬰兒4 個(gè)糞便菌群樣本發(fā)酵過(guò)程中DFcP的消耗情況。如圖3所示，36 h后DFcP中巖藻糖和小分子糖組分被充分利用，僅剩余少量大分子質(zhì)量糖點(diǎn)，而2’-FL的利用程度略低于DFcP，在TLC圖譜中觀察到2’-FL點(diǎn)顏色明顯轉(zhuǎn)淺，但36 h未被菌群完全利用，比較單菌和糞便菌群的TLC結(jié)果，DFcP的益生選擇性弱于2’-FL，因此在相同底物濃度下，菌群表現(xiàn)出對(duì)DFcP的偏好利用。根據(jù)TLC圖中2’-FL和DFcP的位置，推測(cè)DFcP位于2’-FL上方的兩個(gè)寡糖點(diǎn)聚合度≤3，而位于2’-FL下方的寡糖點(diǎn)聚合度≥3，表明DFcP聚合度小，容易被菌群攝取利用。

圖3 體外嬰兒糞便菌群發(fā)酵中DFcP和2’-FL的消耗利用情況Fig.3 Consumption and utilization of DFcP and 2’-FL by in vitro infant fecal flora

2.3.2 嬰兒糞便菌群SCFAs的產(chǎn)生情況

如圖4所示，DFcP組的總SCFAs濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且產(chǎn)酸量顯著高于2’-FL組（P＜0.05）（圖4A）。母乳喂養(yǎng)的嬰兒中，琥珀酸鹽、甲酸鹽、乳酸鹽和乙酸鹽是生命早期（0～6 月齡）腸道主要的SCFAs，其中腸道甲酸鹽的增加和菌群對(duì)巖藻糖的代謝利用有關(guān)，乳酸鹽是各種SCFAs的中間代謝產(chǎn)物，乙酸鹽在嬰兒腸道中占比最高，而丙酸鹽和丁酸鹽則在嬰兒8 個(gè)月大后才開(kāi)始增加[23]。DFcP組總SCFAs濃度為（34.57±5.99）mmol/L，其中，乳酸鹽、甲酸鹽和乙酸鹽分別占比27.4%、33.1%和39.5%（圖4B～D）。在2’-FL組中也觀察到高水平的甲酸鹽和乙酸鹽（41.8%和36.8%）含量，表明巖藻糖的代謝提高了菌群甲酸的產(chǎn)量。兩種巖藻糖基化碳水化合物能夠促進(jìn)嬰兒腸道菌群產(chǎn)生與母乳喂養(yǎng)嬰兒（2～6 月齡）腸道類(lèi)似的SCFAs譜，且由于菌群對(duì)DFcP的消耗利用度更高，DFcP對(duì)菌群產(chǎn)酸促進(jìn)作用優(yōu)于2’-FL。

圖4 DFcP和2’-FL對(duì)糞便菌群SCFAs產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of DFcP and 2’-FL on the production of SCFAs by infant fecal flora in vitro

2.3.3 DFcP對(duì)嬰兒糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)16S rRNA測(cè)序檢測(cè)36 h發(fā)酵過(guò)程中糞便菌群組成的變化，α和β多樣性分析結(jié)果如圖5所示。在嬰兒糞便體外發(fā)酵36 h后，與CK組相比，DFcP組和2’-FL組均未觀察到Chao指數(shù)的顯著差異（P＞0.05），但2’-FL組的Chao指數(shù)顯著高于DFcP組，表明2’-FL組物種豐富度更高（P＜0.05）（圖5A）。與CK組和DFcP組相比，2’-FL組Shannon指數(shù)顯著升高（P＜0.05），表明2’-FL組微生物多樣性有所降低（圖5B）。主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示CK組、2’-FL組和DFcP組的菌群組成存在顯著差異（ANOSIM檢驗(yàn)，R2=0.845，P=0.001）。β多樣性分析結(jié)果表明，2’-FL和DFcP顯著改變了糞便菌群組成，與2’-FL相比，DFcP組與CK組間距離更遠(yuǎn)，兩組間菌群組成的差異更大。

圖5 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群多樣性分析Fig.5 Chao index,Shannon index and PCA plot of infant fecal flora at 36 h of in vitro fermentation

門(mén)水平上（圖6A），嬰兒糞便菌群發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是變形菌門(mén)（Proteobacteria），其次為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），放線菌門(mén)（Actinobacteria）的相對(duì)豐度小于1%。變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在嬰兒腸道中占主導(dǎo)地位，厚壁菌門(mén)在母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中的比例更高，變形菌門(mén)在配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒中占比更高[24]。與CK組和2’-FL組相比，DFcP組中變形菌門(mén)顯著降低（P＜0.001），厚壁菌門(mén)豐度顯著增加（P＜0.001），而2’-FL和CK組間無(wú)顯著差異。

圖6 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群組成分析Fig.6 Compositional analysis of infant fecal flora at 36 h of in vitro fermentation

如圖6B所示，屬水平上，菌群具有高豐度的兼性厭氧菌，腸桿菌屬（Escherichia）和腸球菌屬的相對(duì)豐度和大于81%，乳桿菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬豐度較低。與CK組相比，乳桿菌屬和腸球菌屬的豐度在DFcP組中顯著增加（P＜0.05），腸桿菌屬的豐度顯著降低（P＜0.001）。與2’-FL組相比，DFcP組中腸桿菌屬和梭菌屬的豐度顯著降低（P＜0.001），腸球菌屬的豐度顯著增加（P＜0.001），乳桿菌屬的豐度上調(diào)（圖6C）。雙歧桿菌屬在CK組中檢測(cè)不到，但在2’-FL和DFcP組中以較低豐度存在。Kuang等[25]比較了中國(guó)和其他5 個(gè)國(guó)家的嬰兒糞便菌群組成，美國(guó)、加拿大等國(guó)家的嬰兒主要腸型是A型（放線菌門(mén)優(yōu)勢(shì)），以雙歧桿菌為代表的放線菌門(mén)豐度極高，而中國(guó)嬰兒的腸型均為P型（變形菌門(mén)優(yōu)勢(shì)）。同時(shí)，與新生兒相比，2 月齡中國(guó)嬰兒的腸道微生物群顯著富集了韋榮氏球菌屬（Veillonella）、梭菌屬、鏈球菌屬、糞桿菌屬和乳桿菌屬等微生物，而雙歧桿菌僅在兩月齡嬰兒腸道中初步定植（相對(duì)豐度＜2%）。雙歧桿菌的豐度與嬰兒腸型有關(guān)，本研究4 個(gè)嬰兒糞便樣本中變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，以雙歧桿菌為代表的放線菌門(mén)占比較低。表2顯示2’-FL和DFcP組中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的絕對(duì)定量結(jié)果，與CK組相比，2’-FL和DFcP組顯著增加了雙歧桿菌和乳桿菌屬的絕對(duì)豐度，與菌群相對(duì)豐度的分析結(jié)果相符。DFcP顯著改變了嬰兒糞便菌群組成，上調(diào)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬等有益菌屬的豐度，表明DFcP顯著改變了糞便菌群組成。

表2 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的16S rDNA拷貝數(shù)Table 2 Number of 16S rDNA copies from Lactobacillus and Bifidobaterium in infant fecal flora at 36 h of in vitro fermentation

通過(guò)線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）effect size（LEfSe）比較CK組、2’-FL組和DFcP組的菌群組成，并顯示了物種的LDA評(píng)分（圖6D）。DFcP組和2’-FL組中均有2 個(gè)物種豐度差異大（P＜0.05）。相比于2’-FL組，DFcP組腸球菌屬和乳桿菌屬豐度較高，菌群中高豐度的腸球菌屬主要由共生菌糞腸球菌組成，乳桿菌屬主要由發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌組成，糞腸球菌和乳桿菌作為乳酸菌，其代謝產(chǎn)生的乳酸、乙酸等SCFAs能夠降低糞便的pH值，促進(jìn)嬰兒腸道鈣、鎂、鐵和銅等離子吸收并抑制腸道病原體的生長(zhǎng)定植[26-27]。腸桿菌屬和梭菌屬在2’-FL組中顯示出更高的豐度。梭菌屬在嬰兒腸道中與腸球菌科、乳桿菌科共生，其代謝產(chǎn)物，例如丁酸、膽汁酸、吲哚乙酸等有利于腸道健康和免疫[28]。

發(fā)酵上清液中SCFAs含量與微生物菌群組成的相關(guān)性如圖7所示，腸球菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬與SCFAs的產(chǎn)生呈正相關(guān)（圖7A）。Spearman相關(guān)性系數(shù)證實(shí)所有SCFAs與乳桿菌屬的豐度均呈顯著正相關(guān)，與腸桿菌屬的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），且雙歧桿菌屬和腸球菌屬的豐度與SCFAs的產(chǎn)生呈正相關(guān)（圖7B）。其中，乳酸的產(chǎn)生與腸球菌屬的增加呈顯著正相關(guān)（R=0.503，P=0.03）。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是腸道中的代表性有益菌，而腸球菌屬則屬于典型的乳酸菌，其代謝寡糖產(chǎn)生的乳酸等SCFAs，降低了嬰兒腸道pH值，提高了嬰兒腸道病原體的定植抗性[29]。

圖7 體外發(fā)酵36 h SCFAs含量與嬰兒糞便菌群的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation between SCFA concentration and infant gut microbiota at 36 h of in vitro fermentation

通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路功能預(yù)測(cè)分析了DFcP組和CK組之間腸道菌群在功能上的差異（圖8）。DFcP組和CK組之間豐度前20的功能基因差異主要富集在代謝通路、環(huán)境信息處理和遺傳信息處理中。在KEGG代謝通路代謝二級(jí)水平上，DFcP組和CK組之間腸道菌群的功能存在顯著差異，DFcP組中碳水化合物代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、萜類(lèi)和聚酮類(lèi)代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成等功能基因的相對(duì)豐度顯著高于CK組（P＜0.05）。DFcP顯著增加了菌群中與碳水化合物吸收和代謝相關(guān)的功能基因豐度，從而影響了其他輔因子和維生素代謝、氨基酸代謝和能量代謝等功能基因的豐度變化，表明DFcP對(duì)嬰兒糞便菌群功能基因的顯著調(diào)節(jié)。

圖8 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群代謝通路富集分析Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis of functional differences in infant fecal microbiota between DFcP and control groups at 36 h of in vitro fermentation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外模擬發(fā)酵體系評(píng)估EPS來(lái)源的DFcP對(duì)嬰兒糞便來(lái)源菌群的益生活性。DFcP與母乳寡糖2’-FL單糖組成相似，對(duì)嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19具有顯著的益生作用，并促進(jìn)3 株益生菌SCFAs積累（（49.23±0.12）、（69.32±3.82）mmol/L和（51.99±6.22）mmol/L ）。2’-FL對(duì)嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697的顯著增殖效果也再次得到驗(yàn)證。在嬰兒糞便菌群體外發(fā)酵過(guò)程（0～72 h）中，DFcP組產(chǎn)生的SCFAs主要是甲酸、乙酸和乳酸。2’-FL和DFcP組中與巖藻糖代謝相關(guān)的甲酸鹽占比大于30%，表明巖藻糖基化碳水化合物的代謝促進(jìn)了甲酸的產(chǎn)生。TLC表明DFcP被菌群快速利用，總SCFAs產(chǎn)量顯著高于2’-FL組（P＜0.05）。DFcP和2’-FL組的菌群組成變化表明兩者對(duì)嬰兒腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，DFcP提高了菌群厚壁菌門(mén)的豐度，顯著上調(diào)乳酸菌腸球菌屬和乳桿菌屬的相對(duì)豐度，并增加了雙歧桿菌屬的豐度。與商業(yè)化的嬰兒益生元2’-FL相比，EPS制備的DFcP也顯示出對(duì)嬰兒腸道菌群的調(diào)控作用和作為新型益生元的潛力，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型巖藻寡糖資源提供了新的落腳點(diǎn)，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同結(jié)構(gòu)巖藻糖基化碳水化合物在調(diào)節(jié)生命早期腸道菌群建立及腸道健康發(fā)展過(guò)程中的作用提供了新的理論基礎(chǔ)。