姚艷婷，楊小兵，陳旭潔，陳忠正，林曉蓉，張媛媛，向 杰，陳少丹，焦春偉，李 斌,*，高 雄,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；3.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；4.廣東粵微生物科技有限公司，廣東 肇慶 526000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草、北蟲草，屬于真菌界、子囊菌門、肉座菌目、麥角菌科，為蟲草屬的模式種[1]。據(jù)報(bào)道，蛹蟲草含有蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸等多種活性成分[2]，其中，多糖是蛹蟲草的重要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化以及降血糖等功能活性，備受研究者的關(guān)注[3-6]。多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，但因結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)等原因，有些多糖的生物學(xué)活性難以發(fā)揮，因此，采取一些方法對(duì)蛹蟲草多糖結(jié)構(gòu)適當(dāng)修飾，改變多糖理化特性，增加其生物活性。

硒（Se）是人體必需的微量元素之一，參與維持機(jī)體的健康與生長(zhǎng)發(fā)育，具有抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防克山病等生理功能[7]。但硒不能在人體內(nèi)合成，必須從食物中獲取，而全球多個(gè)地區(qū)屬于缺硒區(qū)，至少有1億人缺硒[8-9]。且亞硒酸鈉等傳統(tǒng)硒補(bǔ)充劑的安全劑量范圍較窄（60～400 μg/d）[10]，攝入過(guò)量容易引起神經(jīng)系統(tǒng)和心血管等方面的疾病[11]，因此，開(kāi)發(fā)安全健康的富硒產(chǎn)品對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)健康等具有重要意義。

前人研究證明，利用灰樹(shù)花、平菇等食用菌，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化的方式富集硒，可獲得有生物價(jià)值的富硒多糖[12-14]。富硒蛹蟲草已實(shí)現(xiàn)人工培育，且開(kāi)展了富硒蛹蟲草多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)特性、生物活性等研究[15-17]，但對(duì)其免疫調(diào)節(jié)活性的研究仍鮮有報(bào)道，活性作用的機(jī)制更有待闡明。為此，本研究從富硒蛹蟲草子實(shí)體中分離純化出一種多糖組分SeCMP0.2，對(duì)其結(jié)構(gòu)特性表征，并利用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7模型探究其體外免疫調(diào)節(jié)活性，以期為富硒蛹蟲草多糖資源的綜合利用和新型健康的硒源產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，提供前期的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒蛹蟲草子實(shí)體 廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；杜氏改良高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）美國(guó)HyClone公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司。

BCA蛋白定量試劑盒、RIPA緩沖液、Bis-Tris預(yù)制膠、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；剛果紅 北京索萊寶科技有限公司；MOPS電泳緩沖液（20×）、5×蛋白上樣緩沖液、10×Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（tris buffered saline with Tween-20，TBST）生工生物工程（上海）股份有限公司；N,N-二羥乙基甘氨酸、二(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷、乙二胺四乙酸 上海麥克林生化科技有限公司；CCK-8試劑盒、蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑美國(guó)MedChemExpress公司；抗體p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα、p-p38、p38、GAPDH 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；抗體p-ERK、ERK 美國(guó)Affinity Biosciences公司；抗體p-JNK、JNK 美國(guó)Abcam公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、鹽酸氨基半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、古羅糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸）揚(yáng)州市博睿糖生物科技有限公司；臺(tái)盼藍(lán)、磺胺、牛血清蛋白、N-(1-萘基)乙二胺二鹽堿、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、乙酸酐、硼氘化鈉 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BT 25s電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；OmegaLum G化學(xué)發(fā)光儀 美國(guó)Aplegen公司；7890A-5977B氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；BG-Power 600電泳儀北京百晶生物技術(shù)有限公司；VersaMax酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；UV-2102C紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯（上海）有限公司；HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo Scientific公司；Vertex 70紅外光譜儀、Avance II 600 MHz核磁共振波譜儀 德國(guó)Bruck公司；Milipore-Q超純水機(jī) 德國(guó)Milipore公司；100 kDa截留分子質(zhì)量超濾膜 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 富硒蛹蟲草多糖的制備

參考Gao Xiong等[18]的方法，并略作修改。將富硒蛹蟲草子實(shí)體粉碎過(guò)40 目篩，按料液比（1∶20，g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，75 ℃水浴提取2 h，重復(fù)2 次。濾渣干燥后，加入超純水（1∶20，g/mL），80 ℃水浴提取3 h，重復(fù)2 次。合并2 次濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃條件下減壓濃縮，濃縮液用4 倍體積的無(wú)水乙醇溶液混勻，4 ℃靜置16 h，6 000 r/min、25 ℃離心10 min，沉淀用超純水復(fù)溶，Sevag試劑（三氯甲烷∶正丁醇，4∶1）除蛋白，將上層多糖溶液用3 500 Da透析袋透析72 h，冷凍干燥，獲得富硒蛹蟲草粗多糖。

1.3.2 富硒蛹蟲草多糖的分離純化

將富硒蛹蟲草粗多糖重新溶解于超純水中，經(jīng)100 kDa截留分子質(zhì)量超濾膜處理，獲得分子質(zhì)量大于100 kDa的超濾組分。取180 mg分子質(zhì)量大于100 kDa的超濾組分溶解于6 mL超純水，過(guò)DEAE-52離子交換柱（3.5 cm×30 cm），采用0～0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，流速為2.5 mL/min，苯酚-硫酸法檢測(cè)洗脫液多糖含量。將0.2 mol/L NaCl溶液洗脫得到的多糖組分透析、凍干，得到富硒蛹蟲草純化單一多糖組分，命名為SeCMP0.2。

1.3.3 富硒蛹蟲草多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 重均分子質(zhì)量（mw）測(cè)定

參考Zhou Ning等[19]的方法，稍作修改。利用高效滲透凝膠色譜（high performance gel filtration chromato graphy，HPGPC）儀測(cè)定SeCMP0.2的重均分子質(zhì)量。利用Waters ACQUITY APC AQ 900和ACQUITY AQ 450柱（4.6 mm×150 mm，2.5 μm），柱溫為35 ℃，流速為0.4 mL/min，流動(dòng)相為100 mmol/L NaNO3溶液。將SeCMP0.2與葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品（5.2、11.6、23.8、48.6、148.0、273.0、410.0 kDa和668.0 kDa）用100 mmol/L NaNO3溶液溶解，過(guò)膜進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SeCMP0.2的mw。

1.3.3.2 硒含量測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1 mL SeCMP0.2（質(zhì)量濃度2 mg/mL）水溶液于消解管中，加入0.5 mL硝酸和0.5 mL鹽酸，室溫放置約15 min，將樣品消解管放入電熱消解儀中加熱消解，樣品完全消解后，冷卻至室溫，用超純水定容至10 mL，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定硒含量。

1.3.3.3 紫外-可見(jiàn)光譜分析

將富硒多糖粉末用超純水配成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的溶液。在紫外-可見(jiàn)光分光度計(jì)190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄紫外-可見(jiàn)光譜圖。

1.3.3.4 單糖組成分析

參考Wang Shiqiang等[20]的方法，取5 mg富硒多糖，加入2 mL的3 mol/L三氟乙酸溶液，120 ℃水解3 h，轉(zhuǎn)移至氮吹管中吹干，加入5 mL超純水渦旋混勻，取50 μL用超純水稀釋20 倍，12 000 r/min離心5 min。取上清液檢測(cè)單糖組成。

采用離子色譜系統(tǒng)（ICS 5000），DionexTMCarboPacTMPA20（150 mm×3.0 mm）液相色譜柱，流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：15 mmol/L NaOH、100 mmol/L NaOAc；進(jìn)樣體積為5 μL；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃，用電化學(xué)檢測(cè)器分析檢測(cè)。

1.3.3.5 紅外光譜分析

取適量富硒多糖凍干粉與溴化鉀粉末混合研磨壓片，在Vertex 70紅外光譜儀中進(jìn)行掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.3.6 甲基化分析

參考Zhu Minqian等[21]的方法，取3 mg富硒多糖，加入二甲基亞砜和氫氧化鈉粉末，孵育30 min，避光加入1 mL碘甲烷，甲基化反應(yīng)1 h，121 ℃用2 mol/L三氟乙酸水解1.5 h，經(jīng)硼氘化鈉還原，并用乙酸酐乙?；?。將乙?；a(chǎn)物溶解在二氯甲烷中，GC-MS上機(jī)檢測(cè)。

采用氣相色譜系統(tǒng)，BPX70（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱。進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，載氣為氦氣，流速1.5 mL/min；柱溫箱的初始溫度為140 ℃保持2 min，以3 ℃/min程序升溫至230 ℃，保持3 min。采用四極桿質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，用電子電離源，在全掃描模式下分析檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍m/z50～350。

1.3.3.7 核磁共振波譜分析

取50 mg富硒多糖溶解于0.5 mL氘代水中，充分溶解后凍干，重復(fù)1 次，使用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜儀掃描記錄一維圖譜（1H-NMR和13C-NMR）。

1.3.3.8 三螺旋結(jié)構(gòu)分析

參考Xiong Feng等[22]的方法，取0.25 mL富硒多糖溶液（質(zhì)量濃度1 mg/mL）與0.5 mL剛果紅試劑（濃度80 μmol/L）混合，逐滴加入NaOH溶液，使其終濃度依次為0～0.5 mol/L，反應(yīng)體系避光放置10 min后，用分光光度計(jì)掃描反應(yīng)溶液在450～550 nm范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)λmax，對(duì)照組以超純水替代富硒多糖溶液。

1.3.3.9 原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）觀察分子形貌

將富硒多糖溶于超純水中，配制成質(zhì)量濃度為5 μg/mL溶液，吸取5 μL樣液滴入云母片，用玻璃瓶固定，風(fēng)干1.5 h，在AFM下觀察形貌。

1.3.4 SeCMP0.2免疫調(diào)節(jié)活性評(píng)價(jià)

1.3.4.1 細(xì)胞存活率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以5×105個(gè)/mL的濃度接種到96 孔板中，每孔200 μL，在37 ℃、含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，加入不同濃度的富硒多糖樣品或陽(yáng)性對(duì)照LPS，以正常培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，培養(yǎng)24 h，棄去上清液，每孔加入含有1.5% CCK-8的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，細(xì)胞存活率按下式計(jì)算：

式中：Ai為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；A0為對(duì)照組的吸光度。

1.3.4.2 NO含量測(cè)定

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)、接種、加樣方式同1.3.4.1節(jié)，處理24 h后，采用Griess試劑測(cè)定NO含量。步驟如下：樣品處理24 h后，每孔取100 μL細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至新96 孔板中，加入等體積的Griess試劑，混勻，避光靜置10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定在542 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以NaNO2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（6.25～100 μmol/L）。

1.3.4.3 mRNA表達(dá)量測(cè)定

以5×105個(gè)/mL的濃度接種RAW264.7細(xì)胞到60 mm2的培養(yǎng)皿中，每皿4 mL，在37 ℃、含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，加入不同濃度的富硒多糖樣品或陽(yáng)性對(duì)照LPS，以正常培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，培養(yǎng)24 h后，吸去上清液，4 ℃加入杜氏磷酸緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS）洗細(xì)胞2 遍，加入1 mL Trizol試劑。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）測(cè)定誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的mRNA表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。反轉(zhuǎn)錄及real-time PCR參數(shù)設(shè)置參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.4.4 Western blot檢測(cè)激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、核因子-κB（nuclear facter-κB，NF-κB）信號(hào)通路相關(guān)蛋白

以5×105個(gè)/mL的濃度接種RAW264.7細(xì)胞到60 mm2的培養(yǎng)皿中，每皿6 mL，在37 ℃、含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入不同濃度的富硒多糖樣品或陽(yáng)性對(duì)照LPS，以正常培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，繼續(xù)孵育30 min，加入2 mL預(yù)冷的DPBS洗2 遍培養(yǎng)皿，然后每皿加入300 μL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分裂解后，4 ℃、16 000×g離心1 min，吸取上清液，即為細(xì)胞總蛋白，蛋白含量采用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒進(jìn)行測(cè)定。將細(xì)胞總蛋白與上樣緩沖液按4∶1體積比混合，95 ℃金屬浴5 min。冷卻后，取40 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，TBST溶液洗膜3 次，每次5 min，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉（TBST溶液配制）中室溫封閉1 h，一抗（p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα、GAPDH）4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜4 次，每次5 min后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜4 次，每次5 min后，以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，在OmegaLum G化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SeCMP0.2結(jié)構(gòu)特性分析

2.1.1 SeCMP0.2分子質(zhì)量及純度分析

通過(guò)水提醇沉、除蛋白，結(jié)合陰離子交換層析柱法分離純化，從富硒蛹蟲草子實(shí)體中獲得多糖組分SeCMP0.2，經(jīng)HPGPC儀測(cè)得的分子質(zhì)量分布如圖1所示。SeCMP0.2的mw為440.7 kDa，分子質(zhì)量分散指數(shù)為1.4，表明SeCMP0.2為均一多糖。由電感耦合等離子體質(zhì)譜儀分析測(cè)定可知，SeCMP0.2的硒含量為49.1 μg/g。由圖2可知，SeCMP0.2在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)明顯特征吸收峰，說(shuō)明其幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，純度較高。

圖1 SeCMP0.2的HPGPC圖Fig.1 HPGPC chromatogram of SeCMP0.2

圖2 SeCMP0.2的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.2 UV-visible spectrum of SeCMP0.2

2.1.2 SeCMP0.2的單糖組成分析

采用離子色譜分析SeCMP0.2的單糖組成，結(jié)果如圖3所示。SeCMP0.2主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖組成，這3 種單糖的含量依次為53.1%、8.2%、37.1%。另外，SeCMP0.2的半乳糖醛酸和古羅糖醛酸含量分別為1.1%和0.5%，表明該糖為雜多糖。

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和SeCMP0.2的離子交換色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatograms of monosaccharide standards and SeCMP0.2

2.1.3 SeCMP0.2的紅外光譜分析

如圖4 所示，SeCMP 0.2 在3370.61 cm－1處的特征吸收峰為O—H伸縮振動(dòng)，2 923.67 cm－1和2 853.18 cm－1處的吸收峰分別由—CH2的對(duì)稱伸縮振動(dòng)和C—H的伸縮振動(dòng)所致[23]，這是糖類物質(zhì)的2 個(gè)特征吸收峰[24]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，1 656.36 cm－1處是C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 541.35 cm－1處可能為N—H彎曲振動(dòng)吸收峰[25]，1 457.46 cm－1處為C—H變角振動(dòng)吸收峰[26]，1 412.46 cm－1處為C—H彎曲振動(dòng)吸收峰[27]，1 221.23 cm－1處由C—O不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起[28]，1 000～1 200 cm－1范圍內(nèi)為C—O—C和C—O—H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，表明SeCMP0.2存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[29]，在892.51 cm－1處的吸收峰說(shuō)明存在β-糖苷鍵和呋喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)，在814.60 cm－1和577.91 cm－1處的吸收峰說(shuō)明存在α-糖苷鍵[30]，表明SeCMP0.2同時(shí)含有α和β構(gòu)型糖基。

圖4 SeCMP0.2的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of SeCMP0.2

2.1.4 SeCMP0.2的甲基化分析

為進(jìn)一步獲得SeCMP0.2的結(jié)構(gòu)信息，采用GC-MS分析SeCMP0.2的糖苷鍵類型，結(jié)果如表2所示。SeCMP0.2中末端殘基、分支殘基和線性殘基的種類分別有3、6 種和6 種。SeCMP0.2的優(yōu)勢(shì)殘基T-Galp-(1→、→2)-Galp-(1→、→6)-Manp-(1→分別占16.6%、29.4%、26.9%。其他殘基占比較小，均低于10%。說(shuō)明SeCMP0.2主要以半乳糖和甘露糖糖苷鍵連接，少量以葡萄糖糖苷鍵連接，與單糖組成的分析結(jié)果一致。

表2 SeCMP0.2的甲基化分析數(shù)據(jù)Table 2 Methylation analysis data of SeCMP0.2

2.1.5 SeCMP0.2的NMR波譜分析

SeCMP0.2的1H-NMR和13C-NMR波譜分析結(jié)果如圖5所示?；瘜W(xué)位移主要集中在δ（H）3.0～5.3和δ（C）50.0～110.0，屬于多糖信號(hào)峰。在δ（H）4.3～5.3和δ（C）98.0～108.0出現(xiàn)的異頭信號(hào)表明，SeCMP0.2存在α和β構(gòu)型糖基[31-32]。一般異頭氫信號(hào)高于5.0，在α構(gòu)型中有化學(xué)置換，而異頭氫信號(hào)低于5.0，在β構(gòu)型中有化學(xué)置換[33]。從圖5A可以看出，SeCMP0.2在δ（H）5.0～5.3處的異頭氫信號(hào)較強(qiáng)，而在δ（H）4.3～5.0處的異頭氫信號(hào)相對(duì)較弱，說(shuō)明SeCMP0.2以α構(gòu)型糖基為主。從圖5B可見(jiàn)，SeCMP0.2的糖苷鍵異頭碳信號(hào)出現(xiàn)在δ（C）98.3～108.1，δ（C）170.0～175.0范圍內(nèi)有2 個(gè)微弱的糖醛酸特征信號(hào)吸收峰，說(shuō)明SeCMP0.2是酸性多糖[34]。這些結(jié)果與上述紅外光譜、單糖組成的分析結(jié)果一致。

圖5 SeCMP0.2的核磁共振波譜圖Fig.5 NMR spectra of SeCMP0.2

2.1.6 SeCMP0.2的三螺旋結(jié)構(gòu)分析

剛果紅是一種酸性試劑，在一定NaOH濃度范圍內(nèi)，可與具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖形成絡(luò)合物，其最大吸收波長(zhǎng)λmax與剛果紅對(duì)照組相比發(fā)生紅移，以此鑒定多糖中是否存在三螺旋結(jié)構(gòu)[35]。如圖6所示，與剛果紅對(duì)照組相比，SeCMP0.2-剛果紅溶液在NaOH濃度0.05～0.4 mol/L范圍內(nèi)發(fā)生紅移，在NaOH濃度為0.3 mol/L時(shí)，其λmax發(fā)生位移最大，達(dá)到7.5 nm。已有研究表明，食用菌來(lái)源的香菇多糖[36]、靈芝多糖[37]及猴頭菇多糖[38]也具有三螺旋結(jié)構(gòu)，在剛果紅溶液中發(fā)生類似的紅移現(xiàn)象。由此說(shuō)明，SeCMP0.2存在三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖6 不同濃度NaOH下剛果紅及其多糖復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)Fig.6 Maximum absorption wavelengths of Congo red-polysaccharide complex and Congo red at different concentrations of NaOH

2.1.7 SeCMP0.2的分子形貌觀察

采用AFM觀測(cè)SeCMP0.2在水溶液中的糖鏈形貌和尺寸。從圖7A平面圖可見(jiàn)，SeCMP0.2在水溶液中呈現(xiàn)大量不規(guī)則球形顆粒。圖7B顯示出許多山狀突起，部分糖鏈高度在1.0～2.5 nm之間，而單個(gè)糖鏈高度介于0.1～1.0 nm之間[39]，表明SeCMP0.2在水溶液中會(huì)發(fā)生聚集，并不是都以單個(gè)糖鏈分子存在。類似現(xiàn)象在蛹蟲草多糖[40]、白肉靈芝多糖[18]中也有發(fā)現(xiàn)，可能是由于多糖通過(guò)分子間氫鍵及范德華力發(fā)生相互纏繞[32]，形成不規(guī)則的聚集體所致。

圖7 SeCMP0.2的AFM圖Fig.7 AFM spectra of SeCMP0.2

2.2 SeCMP0.2的免疫調(diào)節(jié)活性

2.2.1 SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖和NO產(chǎn)生的影響

由圖8A可知，與對(duì)照組相比，SeCMP0.2質(zhì)量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率分別為104.5%和102.8%，對(duì)細(xì)胞有一定的促進(jìn)增殖作用；當(dāng)質(zhì)量濃度為400 μg/mL和800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率分別為95.4%和94.8%，但與對(duì)照組均無(wú)顯著差異。NO作為一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，參與免疫應(yīng)答相關(guān)的生理過(guò)程[41]，因此本研究進(jìn)而采用Griess試劑法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO2－含量，以反映NO產(chǎn)生量，結(jié)果如圖8B所示。與對(duì)照組（2.7 μmol/L）相比，SeCMP0.2質(zhì)量濃度在200、400、800 μg/mL時(shí)，可顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO，產(chǎn)生量依次為6.9、12.4、15.9 μmol/L，而在100 μg/mL時(shí)無(wú)顯著促進(jìn)作用。因此，為更好地研究SeCMP0.2的免疫活性機(jī)理，選擇400～800 μg/mL開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8 SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率和NO產(chǎn)生的影響Fig.8 Effect of SeCMP0.2 on cell viability and NO production in RAW264.7 cells

2.2.2 SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響

為探究SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，本研究采用real-time PCR檢測(cè)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖9所示。與對(duì)照組相比，用400 μg/mL和800 μg/mL的SeCMP0.2處理后，顯著提高RAW264.7細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表達(dá)水平。在質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，上述4 種細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá)量依次為對(duì)照組的2.1、2.0、12.8、83.2 倍。巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生各種炎癥因子，如NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等發(fā)揮其免疫功能。NO的產(chǎn)生受誘導(dǎo)型iNOS調(diào)控，是巨噬細(xì)胞被激活的重要標(biāo)志[42]。TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子的產(chǎn)生可有效激活其他免疫細(xì)胞，刺激先天免疫應(yīng)答從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[43]。結(jié)果表明，SeCMP0.2可在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)。

圖9 SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥介質(zhì)mRNA表達(dá)水平的影響Fig.9 Effect of SeCMP0.2 on the mRNA expression levels of inflammatory mediators in RAW264.7 cells

2.2.3 SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞MAPKs和NF-κB信號(hào)通路的影響

為探究SeCMP0.2的免疫調(diào)節(jié)活性是否受MAPKs、NF-κB信號(hào)通路調(diào)控，本研究采用Western blot技術(shù)檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。由圖10可知，與對(duì)照組相比，以400、800 μg/mL的SeCMP0.2處理RAW264.7細(xì)胞后，能顯著提高JNK、ERK、p38蛋白的磷酸化水平，當(dāng)質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.3、1.6、1.2 倍。由圖11可知，與對(duì)照組相比，400、800 μg/mL的SeCMP0.2處理能夠顯著提高NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，降低IκBα蛋白的表達(dá)量，當(dāng)質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，p-NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.6 倍和0.3 倍。NF-κB是巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫活性的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在未激活狀態(tài)下，其以二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與IκB蛋白形成復(fù)合物而受到抑制[34]。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活時(shí)，NF-κB或IκB蛋白磷酸化而導(dǎo)致復(fù)合物解體，IκB蛋白進(jìn)一步被泛素化而降解，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥因子轉(zhuǎn)錄[44]。MAPKs是一種具有絲氨酸/蘇氨酸特異性的蛋白激酶家族，主要包含JNK、ERK和p38三條信號(hào)途徑[45]。Ren Daoyuan等[46]研究發(fā)現(xiàn)從草本絞股藍(lán)茶中提取得到的酸性多糖GPTP-3可激活巨噬細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路，引起NF-κB蛋白磷酸化而促進(jìn)其入核表達(dá)。Chen Qian等[47]從野生大紅菇中分離得到多糖組分PRG1-1可通過(guò)MAPKs、NF-κB信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞而起到免疫增強(qiáng)作用。通過(guò)上述結(jié)果分析可知，SeCMP0.2可通過(guò)激活MAPKs和NF-κB信號(hào)途徑，促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

圖10 SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.10 Effect of SeCMP0.2 on the expression levels of proteins associated with the MAPK signaling pathway in RAW264.7 cells

圖11 SeCMP0.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.11 Effect of SeCMP0.2 on the expression levels of proteins associated with the NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cells

3 結(jié)論

本研究從富硒蛹蟲草子實(shí)體中成功分離出純度高、均一性好的多糖組分SeCMP0.2，其重均分子質(zhì)量為440.7 kDa，分子質(zhì)量分散指數(shù)為1.4，硒含量為49.1 μg/g，具有典型的多糖官能團(tuán)和三螺旋結(jié)構(gòu)，在水溶液中會(huì)發(fā)生聚集。SeCMP0.2是一種以半乳糖（53.1%）、葡萄糖（8.2%）、甘露糖（37.1%）為主的雜多糖，其優(yōu)勢(shì)殘基為T-Galp-(1→、→2)-Galp-(1→、→6)-Manp-(1→，且同時(shí)含有α和β構(gòu)型糖基，且以α構(gòu)型糖基為主。免疫活性研究表明，SeCMP0.2可激活RAW264.7細(xì)胞中的MAPKs、NF-κB信號(hào)途徑，促進(jìn)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA等炎癥因子表達(dá)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究為富硒蛹蟲草資源開(kāi)發(fā)成功能性食品，作為缺硒和免疫力低下人群的免疫調(diào)節(jié)劑，拓展健康硒源產(chǎn)品提供一定的科學(xué)依據(jù)。