池婷 劉愛紅 范彧 陰欣

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是一種早產(chǎn)兒慢性肺部疾病[1],由補充供氧或機械通氣治療呼吸窘迫綜合征引起[2]。肺泡簡化是肺中與BPD相關(guān)的主要病理改變,影響有效氣體交換和肺功能[3-4]。BPD不僅會降低新生兒的肺功能[5],還會增加兒童后期患哮喘的可能性[6]。因此,預防或改善BPD對新生兒來說很重要?？缒蛋白偶聯(lián)受體-5(takeda G protein-coupled receptor-5,TGR5)是一種血漿膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體,在人體各器官中廣泛表達[7]。研究表明,TGR5可以改善肝臟損傷中的炎癥反應[8],也有利于預防高糖誘導的心肌細胞損傷[9]。盡管在肺中也發(fā)現(xiàn)了TGR5的表達,然而TGR5對高氧(hyperoxia,HO)誘導的BPD的保護作用尚未見報道。本研究旨在確定TGR5對新生小鼠BPD炎癥和肺損傷影響,并評估潛在的分子機制。

資料與方法

一、材料

1 主要試劑 慢病毒(LV-TGR5、LV-NC、si-TGR5和si-NC)購自上海生工生物公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性分析試劑盒購自南京建成生物公司;ELISA試劑盒購自武漢云克隆生物公司;抗體購自英國Abcam公司。

2 實驗動物 C57BL/6小鼠(6～8周齡,20～24 g)購自山西醫(yī)科大學(生理動物實驗室)。許可證號:SYXK(晉)2019-0008。所有動物實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院的實驗動物護理和使用指南進行,并得到了山西省兒童醫(yī)院動物倫理委員會的批準(NO.2022056)。所有小鼠飼養(yǎng)在20℃～24℃的單個籠子中,在12h/12h的光/暗循環(huán)中自由獲取食物和水。

二、方法

1 動物模型及分組 將成年小鼠雜交并在足月(妊娠第21～22 天)自然分娩,幼崽被匯集,并在6小時內(nèi)返回母鼠。將36只幼鼠分為6個實驗組(n=6):對照組(常氧組);高氧組(HO組);HO+LV-NC組;HO+LV-TGR5組;HO+si-NC組;HO+si-TGR5組。在整個實驗過程中,HO+LV-TGR5組和HO+si-TGR5組小鼠以25 mg/kg的劑量分別靜脈注射[10]慢病毒感染載體,每兩天一次。對照組和HO組注射等體積的生理鹽水。對照組的新生小鼠被放置在含21%氧氣的室內(nèi)空氣中,HO組的新生小鼠被放置在含75%氧氣的一個密封的有機玻璃室內(nèi)14天[11],濕度和環(huán)境溫度分別保持在50%和24℃。對照組與HO組母鼠每24 h在高氧和常氧窩之間輪轉(zhuǎn),以防止O2毒性。房間每天打開一次,持續(xù)0.5 h,以替換食物和水。實驗期間每天觀察各組新生小鼠的存活情況。每組小鼠分別于出生后14天腹腔注射1%戊巴比妥(50 mg/kg)處死。收集肺組織、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和血清進行形態(tài)學測定和生化分析。

2 蘇木精-伊紅(hematoxylin&eosin,H&E)染色 處死小鼠并結(jié)扎右支氣管。左肺通過靜脈注射針插入氣管在20 cm H2O壓力下灌注4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)。左肺用4% PFA固定48 h后,切片用石蠟包埋并切片成4 μm厚度。切片用蘇木精和伊紅(H&E)染色,用光學顯微鏡(日本Nikon公司)進行形態(tài)測量分析。

3 肺濕/干(W/D)比測量 從小鼠體內(nèi)對濕肺組織進行分離,記錄肺組織的濕重,在80℃下干燥48 h并重新稱重,直到達到穩(wěn)定的干重。然后計算肺W/D重量比。

4 支氣管肺泡灌洗液分析 出生14天后處死幼鼠,在H&E染色處理左肺之前,通過氣管插管用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次,收集洗滌液,在4℃下12000 rpm離心15 min。收集上清液,使用BCA蛋白檢測試劑盒(北京碧云天公司)測定蛋白濃度。使用Countstar 自動細胞計數(shù)器(上海瑞宇生物公司)計數(shù)總細胞。用瑞氏吉姆薩染色的離心制劑進行差異細胞計數(shù),每只幼鼠至少計數(shù)200個細胞。

5 髓過氧化物酶活性分析 取新鮮肺組織,濾紙吸干污血滲液后,在適當比例的生理鹽水中均質(zhì)。將樣品在4℃下12000 rpm離心20 min,使用指定的MPO活性比色分析試劑盒在460 nm下測定上清液中的MPO活性。

6 血清細胞因子水平 按方法4處理收集上清液。根據(jù)制造商的說明,使用細胞因子特異性ELISA試劑盒測量腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-10的水平;使用微孔板讀數(shù)器在450 nm處對結(jié)果進行定量。

7 SOD,GSH和MDA測定 按方法4處理收集上清液。按照制造商說明,使用市售的診斷試劑盒(北京碧云天公司)評估丙二醛(malondialdehyde,MDA)濃度,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性。

8 qRT-PCR實驗 使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從組織提取總細胞RNA,并用于合成cDNA(日本Takara公司)。使用Fast Start Universal SYBR Green Master(日本Takara公司)和7900實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)按照94℃ 25 s,94℃ 7 s和58℃ 25 s循環(huán)38次進行定量PCR。使用2-△△Ct方法計算基因水平。小鼠TGR5正向引物 5′-CCTGGCAAGCCTCATCGTC-3′,TGR5反向引物5′-AGCAGCCCGGCTAGTAGTAG-3′; 小鼠β-actin正向引物 5′-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3′,β-actin反向引物 5′-TGGGAGGTGTCAACATCTTCTT-3′。

9 Western Blot分析 收集肺組織樣本并使用RIPA緩沖液(北京碧云天公司)進行裂解。通過低溫離心(1000×g,10 min)獲得蛋白質(zhì),并使用BCA蛋白檢測試劑盒(美國Thermo Fisher公司)確定濃度。蛋白質(zhì)在10%～12%的SDS/PAGE凝膠上分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂牛奶封閉1 h后,在4 ℃環(huán)境下孵育抗TGR5、磷酸化p65、p65和乙?；痯53過夜。TBST洗滌3次后,將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。用β-actin作為內(nèi)參對照蛋白。使用增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測蛋白條帶,并用Multi-Analyst software package (美國Bio-Rad公司)對條帶密度進行定量。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、TGR5在新生高氧肺損傷小鼠中上調(diào)

構(gòu)建了HO誘導的小鼠BPD模型,新生小鼠出生14天后收集小鼠肺組織進行組織學檢查和基因檢測。與對照組相比,HO組間質(zhì)水腫和肺泡壁增厚,中性粒細胞和巨噬細胞浸潤。此外,與對照組相比,HO組小鼠肺組織中TGR5的表達顯著上調(diào)(P<0.05)(見圖1)。

圖1 TGR5在HO小鼠中上調(diào)

二、TGR5過表達減弱HO誘導的新生小鼠肺損傷

為了探究體內(nèi)TGR5表達在新生小鼠肺發(fā)育的功能意義,通過靜脈注射LV-TGR5或si-TGR5載體,并建立新生小鼠BPD模型。與HO組相比,LV-TGR5明顯增加TGR5表達,si-TGR5明顯降低TGR5表達(P<0.05)。與對照組相比,HO組間質(zhì)水腫和肺泡壁增厚,中性粒細胞和巨噬細胞浸潤明顯;肺含水量明顯增加;BALF中總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達組新生小鼠水腫和肺泡壁增厚減弱,中性粒細胞和巨噬細胞浸潤減少;肺含水量明顯減少;BALF中總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾進一步加劇肺泡損傷惡化,明顯增加肺含水量,增加BALF中總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量(P<0.05)(見圖2)。

圖2 TGR5過表達對肺組織損傷的影響

三、TGR5過表達減輕HO誘導的肺氧化應激

與對照組相比,HO組的促氧化應激標記物MDA含量顯著升高,抗氧化應激標記物GSH和SOD活性降低(P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達顯著降低MDA含量,升高GSH和SOD活性(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾進一步升高MDA含量,降低GSH和SOD活性(P<0.05)(見圖3)。

圖3 TGR5過表達對BPD小鼠氧化應激的影響

四、TGR5過表達減少HO誘導的中性粒細胞浸潤和炎癥因子釋放

與對照組相比,HO組的肺MPO活性顯著增加(P<0.05);血清中TNF-α和IL-6表達顯著增加,IL-10表達顯著減少 (P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達顯著抑制MPO活性;降低TNF-α、IL-6表達,升高IL-10表達(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾顯著升高MPO活性;升高TNF-α和IL-6的血清表達,降低IL-10的血清表達(P<0.05)(見圖4)。

圖4 TGR5過表達對BPD小鼠炎癥反應的影響

五、TGR5過表達抑制TRAF6/NF-κB信號通路的活化

與對照組相比,HO顯著升高肺組織中TRAF6和p65的蛋白表達(P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達顯著降低TRAF6蛋白表達和p65磷酸化水平(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾進一步升高TRAF6和p65的蛋白水平(P<0.05)(見圖5)。

圖5 TGR5對小鼠肺中TRAF6/NF-κB通路的影響

討 論

BPD是早產(chǎn)兒常見的臨床并發(fā)癥。據(jù)報道,未成熟的肺長期暴露于高氧環(huán)境中是BPD發(fā)生發(fā)展的主要原因之一[12],并一直延伸到患有嚴重呼吸系統(tǒng)問題的兒童時期。我們通過將小鼠暴露于75%的氧氣中,建立了新生小鼠的BPD模型。本研究中,我們證實了新生小鼠持續(xù)暴露于HO導致BPD病理特征。TGR5過表達減弱了HO誘導的中性粒細胞浸潤和氧化應激,并改善間質(zhì)水腫和肺泡壁增厚,減少肺部炎癥。

高氧暴露肺損傷是BPD新生兒最常見的肺損傷模式,可引起肺泡簡化、血管畸形和肺纖維化。出生后0～14天將新生小鼠暴露在75%的氧氣中,這代表小鼠的囊泡和肺泡階段。此外,暴露于高水平的氧氣中不可避免地會導致產(chǎn)生過量的氧自由基[13]。MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,可用于評估氧化應激水平,而抗氧化酶SOD和抗氧化劑GSH在氧化應激中發(fā)揮重要作用,可清除超氧陰離子自由基,保護細胞免受HO損傷[14]。在隨后發(fā)展為BPD的早產(chǎn)兒中檢測到較低的抗氧化水平和較高的MDA濃度[15]。在本研究中,HO暴露后,新生小鼠肺組織MDA升高,GSH和SOD減少,肺結(jié)構(gòu)破壞,炎癥細胞浸潤,表明高氧誘導的肺損傷模型成功建立。TGR5過表達使BPD小鼠的氧化應激和HO誘導的肺損傷得到改善。TGR5過表通過提高GSH和SOD水平表現(xiàn)出抗氧化作用,降低了HO誘導的脂質(zhì)過氧化程度,提示TGR5過表達緩解了HO誘導的新生小鼠肺氧化應激。

肺部炎癥加重BPD的發(fā)展,炎癥因子與BPD的不良結(jié)局相關(guān)[16]。本研究中,ELISA結(jié)果顯示,TGR5過表達可降低小鼠血清中HO誘導的TNF-α、IL-6血清水平,升高IL-10水平,提示TGR5過表達可有效緩解高氧損傷引起的炎癥反應。Leroy等[17]指出,BPD患兒的全身炎癥先于臨床癥狀。TGR5過表達對HO誘導血清炎癥因子水平的抑制作用,提示其可用于BPD的早期干預。TRAF6蛋白是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor associated factor,TRAF)家族成員之一,與敗血癥引起的急性肺損傷密切相關(guān)[18]。研究表明,TRAF6的過度表達增加了TNF-α和IL-6的表達水平[19]。NF-κB通路參與廣泛的炎癥激活。先前的研究表明,TRAF6可以激活NF-κB信號通路[20],而抑制NF-κB通路可減輕LPS誘導的急性肺損傷[21]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HO暴露促進NF-κB通路的激活,這可能與HO誘導的肺損傷和炎癥有關(guān)。TGR5過表達降低了高氧誘導的TRAF6蛋白和NF-κB p65的磷酸化,提示TGR5過表達可能通過抑制TRAF6/NF-κB信號通路活性來緩解小鼠肺損傷,但仍需進一步研究。

綜上所述,本研究證實在小鼠BPD模型中,TGR5可以減少肺泡水腫和氧化應激反應,改善肺功能和降低炎癥細胞浸潤。TGR5可以通過抑制肺細胞中TRAF6/NF-κB通路降低高氧肺損傷的嚴重程度。我們的結(jié)果為保護高氧肺損傷提供了一種新的機制,為預防炎癥反應和新生兒BPD提供一種新的、潛在的治療方法。