岳欣欣付 洋李怡然尹曉燕于 飛傅全威

(1.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院,沈陽(yáng) 110000;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院,沈陽(yáng) 110000;3.東莞康華醫(yī)院,廣東 東莞 523080)

細(xì)胞自噬(autophagy)是細(xì)胞在生理、營(yíng)養(yǎng)匱乏等應(yīng)激條件影響下,通過(guò)自噬溶酶體途徑,將胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器和過(guò)度積累的脂質(zhì)等成分降解的生物學(xué)過(guò)程[1]。 近年來(lái),通過(guò)不同的干預(yù)方法調(diào)控自噬活性,研究其對(duì)肥胖和糖尿病疾病的影響成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)[2-5]。 缺氧是誘導(dǎo)自噬發(fā)生的常見(jiàn)方法之一,然而缺氧誘導(dǎo)的自噬激活是把雙刃劍,它既可以發(fā)揮保護(hù)作用,也可以發(fā)揮加重細(xì)胞損傷的作用[6-7]。 因此,本研究在低氧誘導(dǎo)劑CoCl2干預(yù)條件下模擬體外缺氧環(huán)境,以3T3-L1 誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞為細(xì)胞模型,基于HIF-1α/自噬途徑,探討低氧誘導(dǎo)劑CoCl2調(diào)控脂肪細(xì)胞自噬活性,發(fā)揮自噬的保護(hù)作用,闡明其使脂肪細(xì)胞免受炎癥損傷和改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞購(gòu)自ATCC(XY-XB-1608)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 不完全培養(yǎng)液和胰蛋白酶-EDTA 消化液(Keygen);CoCl2(Sigma);MTT(Aladdin);抗體: HIF-1α(BD, 美國(guó))、LC3B(Cell Signaling Technology, 美國(guó))、Belin-1 (Santa Cruz, 美國(guó))、β-actin (Abcam,美國(guó)) 。 Western blot 及IP 細(xì)胞裂解液、蛋白上樣緩沖液、地塞米松溶液、胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(IBMX)、FBS 胎牛血清均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

超凈工作臺(tái)購(gòu)自江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,購(gòu)自美國(guó)NUAIRE 公司;高速低溫離心機(jī),購(gòu)自英國(guó)Dynamica 公司;PCR 儀及熒光定量系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司;蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司;Olympus CKX41 顯微鏡、CKX53 倒置相差顯微鏡、BX63 自動(dòng)熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞用含10%小牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。 細(xì)胞融合近80%～90%開(kāi)始誘導(dǎo)分化,加入含10%胎牛血清(FBS)、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L 地塞米松和10 mg/L 胰島素的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h, 再換為含10%FBS、10 mg/L 胰島素的DMEM 高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h, 隨后以10% FBS 的高糖DMEM 繼續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)8～12 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 當(dāng)觀察到90%以上的細(xì)胞變圓并有大量脂滴出現(xiàn),說(shuō)明3T3-L1 被誘導(dǎo)為成熟的脂肪細(xì)胞[8]。

1.3.2 分組與干預(yù)措施

將誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細(xì)胞,給予不同濃度(50、100、150、200、400 μmol/L)和不同時(shí)間(0、12 h、24 h、48 h)CoCl2處理,分析CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞的濃度和時(shí)間,根據(jù)此結(jié)果,將成熟的脂肪細(xì)胞分為0 h 組(對(duì)照組)和CoCl2干預(yù)12 h 組、24 h 組、48 h 組。

1.3.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)(MTT 法)

將脂肪細(xì)胞按照一定的濃度接種于96 孔中,每組設(shè)置6 個(gè)平行孔,每孔加入100 μL 細(xì)胞懸浮液,培養(yǎng)至細(xì)胞個(gè)數(shù)接近1×104/孔時(shí),按照分組需求加入藥物干預(yù)。 然后每孔加入10 μL 濃度為5 mg/mL的MTT 溶液,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO,放在搖床上低速搖晃10 min,最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔在490 nm 處的吸光值。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)

按照Western blot 細(xì)胞裂解液說(shuō)明書(shū)提取蛋白,用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。 取30 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上后用5% BSA 或5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,然后與各種一抗在4℃孵育過(guò)夜。 一抗稀釋度分別為:HIF-1α(1 ∶500) 、LC3-Ⅱ (1 ∶500) 、Beclin-1 (1 ∶200) 、Glut-1(1 ∶500)和β-actin (1 ∶4000)。 TBS 洗滌3次后加入二抗,室溫?fù)u床2 h 后,加入ECL 發(fā)光液反應(yīng),曝光后拍照分析。

1.3.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

采用LC3B 自噬熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脂肪細(xì)胞中自噬活性水平。 將細(xì)胞以3.5×104/mL 接種于共聚焦培養(yǎng)皿,誘導(dǎo)分化成熟。 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)措施同1.3.2,用甲醛∶丙酮(1 ∶1)固定細(xì)胞,LC3B 兔多克隆抗體0.5 μg/mL 37℃孵育1 h, 山羊抗兔IgG 0.01 mg/mL 37℃孵育30 min, 抗熒光淬滅劑封片,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.3.6 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液炎癥因子的水平

取各組培養(yǎng)液上清,離心(1000 r/min,20 min),去除細(xì)胞碎片,保存于-20℃冰箱,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,檢測(cè)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6 的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。 對(duì)連續(xù)型數(shù)值變量用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,所用分析方法為單因素方差分析,對(duì)符合正態(tài)性和方差齊性的檢驗(yàn),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度和不同時(shí)間CoCl2 對(duì)脂肪細(xì)胞存活情況的影響

用MTT 法檢測(cè)不同濃度和不同時(shí)間CoCl2對(duì)脂肪細(xì)胞存活情況的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1,隨著干預(yù)時(shí)間的增加,不同CoCl2濃度組脂肪細(xì)胞均出現(xiàn)存活率下降的趨勢(shì),隨著CoCl2濃度的增加,同一時(shí)間段脂肪細(xì)胞的存活率也隨之降低,這提示脂肪細(xì)胞存活率與CoCl2濃度變化、干預(yù)時(shí)間存在劑量依賴和時(shí)間依賴的變化趨勢(shì)。 不同濃度CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞12 ～24 h 時(shí),細(xì)胞存活率開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì),但是下降趨勢(shì)不明顯。 干預(yù)24 ～48 h 時(shí)脂肪細(xì)胞存活率出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì),這提示干預(yù)24 h 是潛在的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。 用50、100、150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 時(shí),細(xì)胞存活率出現(xiàn)下降的趨勢(shì),但不顯著,而用200、400 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率出現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。這提示150 μmol/L 濃度的CoCl2是干預(yù)脂肪細(xì)胞模擬適度缺氧環(huán)境的最佳濃度。

圖1 不同濃度不同時(shí)間CoCl2 對(duì)脂肪細(xì)胞存活率影響Figure 1 Effect of different concentration and time of CoCl2 on the survival rate of adipocytes

2.2 CoCl2 對(duì)脂肪細(xì)胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Glut-1 蛋白表達(dá)水平的影響

根據(jù)2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取150 μmol/L 的CoCl2對(duì)脂肪細(xì)胞分別干預(yù)0 h、12 h、24 h、48 h,檢測(cè)脂肪細(xì)胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Glut-1 蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果如圖2 所示,與0 h 組(對(duì)照組)相比,12 h 和24 h 組LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平增高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與12 h 組相比,24 h 組LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平增高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),這一結(jié)果提示12～24 h 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增加,自噬水平增加,24 h 自噬水平增加最為顯著。 與0 h 組(對(duì)照組)相比,12 h 和24 h 組HIF-1α、Glut-1 蛋白表達(dá)水平增高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與12 h 組相比,24 h 組HIF-1α、Glut-1 蛋白表達(dá)水平增高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),這一結(jié)果提示缺氧12 ～24 h 時(shí)HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白表達(dá)水平開(kāi)始增加,且與自噬增加水平一致,自噬水平增加可能以依賴HIF-1α 方式存在。

注:與0 h 組相比, *P＜0.05;與12 h 組相比, #P＜0.05。圖2 不同時(shí)間CoCl2 對(duì)脂肪細(xì)胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1 和Glut-1 蛋白的表達(dá)的影響Note.Compared with 0 h group, *P＜0.05.Compared with 12 h group, #P＜0.05.Figure 2 Effects of CoCl2 on the expressions of HIF-1α,LC3-Ⅱ,Beclin-1 and Glut-1 in adipocytes of different times

2.3 CoCl2 對(duì)脂肪細(xì)胞自噬水平的影響

采用LC3B 自噬免疫熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脂肪細(xì)胞自噬水平,結(jié)果見(jiàn)圖3,與0 h 組(對(duì)照組)相比,24 h 組自噬水平顯著增加,12 h 和48 h 組自噬水平無(wú)顯著變化。 這一結(jié)果提示150 μmol/L 的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h,自噬活化水平最為顯著,與自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)水平一致。

圖3 免疫熒光檢測(cè)LC3B 的表達(dá)情況Figure 3 Results of LC3 positive cell staining in each group

2.4 CoCl2 對(duì)脂肪細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6水平的影響

檢測(cè)脂肪細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6的水平,結(jié)果見(jiàn)圖4,與0 h 組(對(duì)照組)相比12 h 和24 h 組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平無(wú)明顯增加,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),48 h組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著增加,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 與12 h 組相比,24 h 組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平無(wú)明顯增加,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),48 h 組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著增加,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 這一結(jié)果提示缺氧干預(yù)12 ～24 h 時(shí)是適度缺氧條件下,自噬水平增加以依賴HIF-1α 的方式增加的同時(shí),自噬發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用,減輕了細(xì)胞炎癥因子的水平。

注:與0 h 組相比, *P＜0.05;與12 h 組相比, #P＜0.05。圖4 脂肪細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α 和IL-6 的水平Note.Compared with 0 h group, *P ＜0.05.Compared with 12 h group, #P＜0.05.Figure 4 Effects of CoCl2 on the expressions of TNF-α and IL-6 in culture supernatants of adipocytes

3 討論

體外模擬缺氧環(huán)境,誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧常用二氯化鈷(CoCl2),其主要機(jī)制是二價(jià)鈷離子可誘導(dǎo)細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor,HIF)及其調(diào)控的下游基因的表達(dá)[9]。 因此,故本研究以此為依據(jù)將3T3-L1 細(xì)胞暴露于二氯化鈷作用條件下觀察細(xì)胞在缺氧應(yīng)激條件下的生物學(xué)變化情況,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著CoCl2干預(yù)細(xì)胞時(shí)間的增加,不同CoCl2濃度組脂肪細(xì)胞均出現(xiàn)存活率下降的趨勢(shì),隨著CoCl2濃度的增加,同一時(shí)間段脂肪細(xì)胞的存活率也隨之降低,這提示脂肪細(xì)胞存活率與CoCl2濃度變化、干預(yù)時(shí)間存在劑量依賴和時(shí)間依賴的變化趨勢(shì)。 12 ～24 h 時(shí)段,用不同濃度CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞時(shí),細(xì)胞存活率開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì),但是下降趨勢(shì)不明顯。 24 ～48 h 時(shí)段,用不同濃度CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞時(shí),脂肪細(xì)胞存活率出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì),這提示CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 是潛在的影響脂肪細(xì)胞存活率的時(shí)間轉(zhuǎn)折點(diǎn)。 再觀察24 h 時(shí),用50、100、150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞,脂肪細(xì)胞存活率開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì),但是不顯著,用200、400 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞,脂肪細(xì)胞存活率出現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì),這提示150 μmol/L 濃度的CoCl2是干預(yù)脂肪細(xì)胞模擬適度缺氧環(huán)境的最佳濃度,這一結(jié)果與既往研究結(jié)果相似[10]。

缺氧是誘導(dǎo)自噬發(fā)生的最常見(jiàn)原因之一[11]。缺氧后HIF-1α 被活化,如果自噬以依賴HIF-1α 活化的方式發(fā)生,將有助于抵御缺氧損傷,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài);如果自噬以不依賴HIF-1α 活化的方式被激活,將促進(jìn)細(xì)胞損傷和凋亡,既往多項(xiàng)研究基于此探討如何調(diào)控自噬來(lái)達(dá)到治療疾病的作用[12-18]。鑒于此,本研究預(yù)探討150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞是否可調(diào)控自噬以依賴HIF-1α 活化的方式發(fā)生,發(fā)揮自噬保護(hù)細(xì)胞的作用。 因此,闡明HIF-1α/自噬途徑的關(guān)鍵分子信號(hào)通路是本研究的關(guān)鍵所在。 本研究選取150 μmol/L 濃度的CoCl2分別于0 h、12 h、24 h、48 h 干預(yù)脂肪細(xì)胞,探索HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白、自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)水平,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 h組(對(duì)照組)相比,24 h 組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)水平顯著增加,HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白表達(dá)水平也顯著增加,且增加水平明顯高于其他組,由此結(jié)果我們推測(cè)自噬的活化是以依賴HIF-1α 活化的方式發(fā)生的,進(jìn)一步說(shuō)明150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 是調(diào)控自噬活化的最佳干預(yù)條件,且在此干預(yù)條件下自噬以依賴HIF-1α 方式的活化,發(fā)揮其保護(hù)細(xì)胞的作用。與此同時(shí),本研究進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)自噬活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 h 組(對(duì)照組)相比,24 h 時(shí)自噬活化水平顯著增加,且最為顯著,這一研究結(jié)果與24 h 時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)水平一致。 由此,本研究發(fā)現(xiàn),基于HIF-1α/自噬途徑,150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 可調(diào)控自噬活化發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。 既往研究發(fā)現(xiàn)150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 后,脂肪細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡表現(xiàn),凋亡的相關(guān)蛋白p53、Bcl-2 和caspase-9 等表達(dá)增加[10],這項(xiàng)研究從另一個(gè)方向說(shuō)明24 h 后自噬開(kāi)始發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞損傷和凋亡的作用,也從另一個(gè)方向證實(shí)了本研究的結(jié)果是與其一致的。

既往研究證實(shí),與瘦體重人群相比,肥胖人群脂肪組織中自噬相關(guān)蛋白LC3 的表達(dá)水平增高,且與脂肪組織炎狀態(tài)和胰島素抵抗密切相關(guān),但是對(duì)于肥胖狀態(tài)下脂肪細(xì)胞自噬活性和炎癥狀態(tài)的變化存在爭(zhēng)議[4,19]。 基于上述理論,為進(jìn)一步說(shuō)明基于HIF-1α/自噬途徑,150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 可調(diào)控自噬活化發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用與抑制脂肪細(xì)胞炎癥因子的分泌相關(guān)。 本研究采用150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞0 h、12 h、24 h、48 h,分析脂肪細(xì)胞中脂肪炎癥因子的分泌情況,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),脂肪炎癥因子TNF-α、IL-6 分泌水平逐漸升高,與0 h 組相比,12 h、24 h 脂肪炎癥因子TNF-α、IL-6 分泌水平無(wú)顯著升高,48 h 時(shí)脂肪炎癥因子TNF-α、IL-6 分泌水平升高最為顯著,這與24 h 時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)水平顯著增加趨勢(shì)相反,也與24 h 時(shí)HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白表達(dá)水平顯著增加的趨勢(shì)相反,這提示自噬活性增加時(shí),炎癥因子的分泌減少。 這一結(jié)果明確了50 μmol/L濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 可調(diào)控自噬活化,抑制脂肪細(xì)胞炎癥因子的分泌,發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞免于炎癥損傷的作用。 炎癥因子TNF-α 和IL-6 分泌可干擾胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致胰島素抵抗[20-21]。由此,本研究可進(jìn)一步推測(cè)150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 可基于HIF-1α/自噬途徑激活自噬活性,抑制炎癥因子分泌進(jìn)而改善脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)基于HIF-1α/自噬途徑,150 μmol/L 濃度的CoCl2干預(yù)脂肪細(xì)胞24 h 可調(diào)控自噬以依賴HIF-1α 的方式被活化,使脂肪細(xì)胞免于進(jìn)一步的炎癥損傷,并改善脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗,發(fā)揮其保護(hù)脂肪細(xì)胞的作用。 期望低氧調(diào)控自噬成為治療肥胖、2 型糖尿病的靶點(diǎn),未來(lái)如何更加精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞的自噬活化強(qiáng)度,分析其治療肥胖和糖尿病的精確分子機(jī)制,仍需要更多更先進(jìn)深入的研究。