宋逸明, 沈 鑒, 劉傳旸, 熊秋燃, 程 澄, 柴一荻, 王士峰, 吳 靜*

1. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院環(huán)境污染溯源與精細(xì)監(jiān)管技術(shù)研究中心, 北京 100084 2. 清華蘇州環(huán)境創(chuàng)新研究院先進(jìn)監(jiān)管技術(shù)儀器研發(fā)團(tuán)隊(duì), 江蘇 蘇州 215163

引 言

熒光技術(shù)是一種重要的、 廣泛使用的化學(xué)分析技術(shù)。 三維熒光光譜法是近年來(lái)發(fā)展成熟的一種先進(jìn)的熒光分析方法, 廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)[1-2]、 生物科學(xué)[3]、 食品科學(xué)[4]等領(lǐng)域。 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院基于三維熒光光譜自主研發(fā)了水污染預(yù)警溯源技術(shù)和配套儀器, 通過(guò)對(duì)比待檢測(cè)樣品與數(shù)據(jù)庫(kù)中污染源的三維熒光光譜的相似度, 快速判斷污染排放源, 已成功用于水體和工業(yè)園區(qū)的污染溯源[5-6]。 該技術(shù)成功將三維熒光光譜的應(yīng)用從實(shí)驗(yàn)室拓展到企業(yè)和環(huán)境管理的第一線, 被《科技日?qǐng)?bào)》評(píng)選為2018年國(guó)內(nèi)十大技術(shù)突破。

然而, 在實(shí)際應(yīng)用中, 部分熒光有機(jī)物擁有結(jié)構(gòu)相近的發(fā)色團(tuán), 僅僅依靠三維熒光光譜很難準(zhǔn)確識(shí)別物質(zhì)種類(lèi)。 熒光量子產(chǎn)率(quantum yield, QY)和熒光壽命(fluorescence lifetime, FL)是熒光化合物的重要發(fā)光參數(shù)[7], 更能反映物質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異。 結(jié)構(gòu)相近、 三維熒光光譜相似的熒光有機(jī)物, 其熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命由于取代基的不同可能有顯著差異。 因此, 熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命的引進(jìn), 有望突破熒光有機(jī)物難以精準(zhǔn)識(shí)別的問(wèn)題。

本文選取吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸為研究對(duì)象。 3-甲基吲哚和L-色氨酸均包含具有給電子能力的吲哚環(huán), 其三維熒光光譜與吲哚的相似。 圍繞這三種物質(zhì), 本文主要測(cè)定了(1)三維熒光光譜、 (2)熒光量子產(chǎn)率和(3)熒光壽命。 本研究結(jié)果表明, 熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命可用于具有相似三維熒光光譜的熒光有機(jī)物的精確區(qū)分, 為熒光有機(jī)物的精準(zhǔn)識(shí)別與鑒定提供了一種有潛力的新方法。

圖1 結(jié)構(gòu)式(a)吲哚、 (b)3-甲基吲哚和(c)L-色氨酸Fig.1 The structural formulas of (a) indole, (b) 3-methylindole and (c) L-tryptophan

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光儀(FLS1000, Edinburgh Instruments, 英國(guó))測(cè)量; 三維熒光光譜用熒光分光光度計(jì)(F2700, Hitachi, 日本)測(cè)量; 紫外-可見(jiàn)吸收光譜用紫外-分光光度計(jì)(DR6000, Hach, 美國(guó))測(cè)量。

乙醇(J&K, HPLC, >99.9%), 吲哚(Sigma-Aldrich, >99%, 美國(guó)), 3-甲基吲哚(Sigma-Aldrich, GC, >99%, 美國(guó)), L-色氨酸(Sigma-Aldrich, HPLC, >99%, 美國(guó)), 實(shí)驗(yàn)用水為高純水。 用乙醇為溶劑配制1 mmol·L-1的吲哚溶液、 3-甲基吲哚溶液和L-色氨酸溶液作為儲(chǔ)備液, 置于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測(cè)試方法及原理

1.2.1 三維熒光光譜

三維熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)(excitation wavelength, EX)的掃描范圍為220～450 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)(emission wavelength, EM)的掃描范圍為230～550 nm。 步進(jìn)波長(zhǎng)5 nm, 掃描電壓700 V, 掃描速度為12 000 nm·min-1。

1.2.2 熒光量子產(chǎn)率

熒光量子產(chǎn)率(φf(shuō))指熒光有機(jī)物吸收光子后所產(chǎn)生的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值[7]。 本實(shí)驗(yàn)中量子產(chǎn)率的測(cè)量采用絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率測(cè)量技術(shù)。 使用的積分球是一個(gè)內(nèi)壁涂有白色漫反射材料的空腔球體, 由類(lèi)聚四氟乙烯材料加工而成的高反射性的內(nèi)表面, 在400～1 500 nm光譜范圍內(nèi)反射率>99%, 在250～2 500 nm光譜范圍內(nèi)反射率>95%。 整個(gè)測(cè)試過(guò)程分兩步: (1)根據(jù)待測(cè)溶液設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的范圍, 掃描純?nèi)軇┑臒晒獍l(fā)射光譜; (2)相同條件下掃描待測(cè)溶液的熒光發(fā)射光譜。 儀器自動(dòng)計(jì)算樣品吸收的光子數(shù)與隨后發(fā)射的光子數(shù)的比值。

1.2.3 熒光壽命

熒光壽命(τ)指當(dāng)切斷激發(fā)光后熒光強(qiáng)度衰減至原強(qiáng)度的1/e所經(jīng)歷的時(shí)間[7]。 不同的分子構(gòu)象產(chǎn)生不同的熒光, 其熒光壽命也各異,τ可用多指數(shù)方程來(lái)表示

(1)

式(1)中,R(t)為熒光總強(qiáng)度,Bi和τi分別表示不同分子構(gòu)象的指前因子和熒光壽命。 本實(shí)驗(yàn)中熒光壽命的測(cè)量采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)。 使用脈沖光激發(fā)樣品, 利用光子探測(cè)裝置對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行探測(cè), 每一個(gè)光子計(jì)數(shù)信號(hào)都會(huì)落入一個(gè)對(duì)應(yīng)的時(shí)間窗口, 經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的統(tǒng)計(jì)疊加后即得到熒光壽命曲線。 幾十萬(wàn)次重復(fù)以后, 不同的時(shí)間通道累積下來(lái)的光子數(shù)目不同, 以光子數(shù)對(duì)時(shí)間作圖, 經(jīng)平滑處理后得到時(shí)間分辨熒光光譜, 擬合后得到熒光壽命。 光源采用EPLED系列皮秒脈沖二極管激光器, 激光波長(zhǎng)為254.5 nm, 熒光壽命測(cè)量范圍為50 ns, 分析通道數(shù)目為2 048。

2 結(jié)果與討論

2.1 三維熒光光譜

吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的典型三維熒光光譜(圖2)均存在2個(gè)明顯的熒光區(qū)域, 分別位于EX=250～300 nm和EM=310～420 nm、 EX=220～230 nm和EM=310～420 nm, 各區(qū)域內(nèi)分別存在一個(gè)熒光峰。 各熒光峰的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)(表示為[激發(fā)波長(zhǎng), 發(fā)射波長(zhǎng)])十分接近, 吲哚的兩個(gè)熒光峰的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為[275, 345]、 [220, 345] nm, 記為峰1和峰2(Peak 1, Peak 2); 3-甲基吲哚為[280, 365]、 [225, 365] nm, 記為峰3和峰4(Peak 3, Peak 4); L-色氨酸則為[275, 350] 、 [220, 350] nm, 記為峰5和峰6(Peak 5, Peak 6)。 三種有機(jī)物的熒光峰位置和熒光區(qū)域形狀都很相似, 難以分辨。

圖2 (a)吲哚、 (b)3-甲基吲哚和(c)L-色氨酸的三維熒光光譜Fig.2 EEMs of (a) indole: 5×10-4 mmol·L-1, (b) 3-methylindole: 5×10-4 mmol·L-1, (c) L-tryptophan: 1×10-3 mmol·L-1

相同濃度下, 三種有機(jī)物在激發(fā)波長(zhǎng)為275～280 nm處的最高熒光強(qiáng)度(峰1、 峰3和峰5)依次為: 吲哚>3-甲基吲哚>L-色氨酸。 結(jié)構(gòu)相近的熒光有機(jī)物, 雖然三維熒光光譜相似, 但熒光峰強(qiáng)度卻有顯著差異, 借助三維熒光光譜技術(shù)進(jìn)行分析時(shí), 一旦誤判了物質(zhì)種類(lèi), 也會(huì)對(duì)熒光有機(jī)物濃度的測(cè)量造成嚴(yán)重影響。 因此, 迫切需要探尋更精確有效的熒光有機(jī)物識(shí)別方法, 以提高對(duì)于三維熒光光譜相似的熒光有機(jī)物識(shí)別的準(zhǔn)確度。

2.2 熒光量子產(chǎn)率

紫外-可見(jiàn)吸收光譜(圖3)顯示, 吲哚的最大吸收峰在約275 nm處; 3-甲基吲哚和L-色氨酸的最大吸收峰在約280 nm處。 以上述最大吸收峰波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng)分別對(duì)3種有機(jī)物的熒光量子產(chǎn)率進(jìn)行檢測(cè)。

圖3 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(c=0.01 mmol·L-1)Fig.3 UV-Vis absorption spectra of indole, 3-methylindole and L-tryptophan (c=0.01 mmol·L-1)

測(cè)試結(jié)果顯示(表1), 濃度為0.01 mmol·L-1時(shí), 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的熒光量子產(chǎn)率分別為0.264、 0.347和0.145。 熒光量子產(chǎn)率是表證熒光有機(jī)物發(fā)光效率的重要參數(shù), 數(shù)值越大則有機(jī)物熒光越強(qiáng)。 它主要決定于有機(jī)物的結(jié)構(gòu), 同時(shí)也與有機(jī)物所處的微環(huán)境有關(guān)[7]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示雖然三種有機(jī)物具有相同的吲哚發(fā)光團(tuán), 但取代基的不同給發(fā)光效率帶來(lái)了顯著影響, 表現(xiàn)為熒光量子產(chǎn)率數(shù)值的上升或下降。

表1 吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸量子產(chǎn)率Table 1 The quantum yields of indole, 3-methylindole and L-tryptophan

表2 吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸溶液的熒光壽命(c=0.1 mmol·L-1)Table 2 The fluorescence lifetime of indole, 3-methylindole and L-tryptophan (c=0.1 mmol·L-1)

3-甲基吲哚和L-色氨酸均是吲哚的取代產(chǎn)物, 且取代基的位置相同, 但取代基的性質(zhì)有較大差異。 甲基(-CH3)為飽和烴基, 給電子基團(tuán)。 有研究表明, 甲基能改變熒光體的共軛π電子云的空間布局, 降低分子基態(tài)激發(fā)能, 從而提高取代產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率, 同時(shí), 甲基的引入, 也會(huì)導(dǎo)致EX和EM的紅移[8]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在相同條件下, 相比于吲哚, 3-甲基吲哚熒光量子產(chǎn)率提升了31.44%, 熒光峰EX紅移了5 nm, EM紅移了20 nm, 符合前述已有的研究結(jié)果。 L-色氨酸的取代基團(tuán)含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH), 其中氨基為給電子基團(tuán), 羧基為得電子基團(tuán)。 一般來(lái)說(shuō), 給電子取代基能提高熒光效率, 而得電子取代基則會(huì)使熒光效率降低。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在相同條件下, 相比于吲哚, L-色氨酸熒光峰的EX和EM變化不明顯, 但熒光量子產(chǎn)率顯著下降了45.08%。 一方面, 可能是羧基的影響力較氨基更強(qiáng), 使取代基整體呈現(xiàn)為得電子基團(tuán)的性質(zhì), 從而降低了熒光效率; 另一方面, 分子激發(fā)態(tài)勢(shì)能面上存在著錐形交叉點(diǎn)[9], 氨基靠近吲哚環(huán)處形成氫鍵, 可能使得處在激發(fā)態(tài)的L-色氨酸分子更容易到達(dá)錐形交叉點(diǎn)而返回基態(tài), 從而促進(jìn)非輻射躍遷速率。 兩種因素疊加, 造成L-色氨酸熒光量子產(chǎn)率大幅度降低。

2.3 熒光壽命

吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸溶液的時(shí)間分辨熒光光譜如圖4所示, 其中縱坐標(biāo)為檢測(cè)到的光子數(shù)量, 橫坐標(biāo)為時(shí)間。 對(duì)時(shí)間分辨光譜的熒光衰減曲線進(jìn)行擬合計(jì)算可以得到三種有機(jī)物的熒光壽命τ和其不同分子構(gòu)象的指前因子B。 通過(guò)比較擬合方差χ2, 發(fā)現(xiàn)雙指數(shù)方程擬合效果更好, 但是其指前因子B1小于零, 與實(shí)際不符, 因此, 可以判斷本次實(shí)驗(yàn)中使用的吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸溶液中均只存在一種主要的構(gòu)象, 熒光壽命分別為4.149 2、 7.895 7和2.715 1 ns。

圖4 時(shí)間分辨熒光光譜(c=0.1 mmol·L-1)Fig.4 Time-resolved fluorescence spectra (c=0.1 mmol·L-1)

同時(shí), 使用0.05和1 mmol·L-1的吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸溶液進(jìn)行熒光壽命的測(cè)定, 測(cè)試條件和擬合情況與前述實(shí)驗(yàn)保持一致, 得到三種有機(jī)物不同濃度下的時(shí)間分辨光譜(圖5)。

圖5 不同濃度下的時(shí)間分辨熒光光譜(a): 吲哚; (b): 3-甲基吲哚; (c): L-色氨酸Fig.5 Time-resolved fluorescence spectra at different concentrations(a): Indole; (b): 3-methylindole; (c): L-tryptophan

表3列出了不同濃度下三種溶液的熒光壽命, 結(jié)果顯示, 吲哚和3-甲基吲哚溶液在三種濃度下的熒光壽命排序?yàn)?τ1>τ0.1≈τ0.05; L-色氨酸溶液則穩(wěn)定在2.70 ns附近。 吲哚和3-甲基吲哚溶液在1 mmol·L-1濃度時(shí)的熒光壽命相比0.1 mmol·L-1濃度時(shí)分別上升了12.37%和15.66%。 溶液濃度較高時(shí), 由于內(nèi)濾效應(yīng)存在, 使得到達(dá)有機(jī)物分子的激發(fā)光強(qiáng)度或到達(dá)檢測(cè)器的發(fā)射光強(qiáng)度降低, 前者是由于基態(tài)分子對(duì)入射光的吸收, 后者則是由于基態(tài)分子對(duì)發(fā)射光的吸收, 分別稱(chēng)為初級(jí)和次級(jí)內(nèi)濾效應(yīng)[10]。 初級(jí)內(nèi)濾效應(yīng)會(huì)降低有機(jī)物發(fā)射光譜的總體強(qiáng)度, 但不會(huì)改變熒光光譜的形狀和熒光峰位置, 也不會(huì)改變高濃度下有機(jī)物的熒光壽命值, 因此在對(duì)熒光壽命進(jìn)行分析時(shí), 可忽略初級(jí)內(nèi)濾效應(yīng)的影響。 次級(jí)內(nèi)濾效應(yīng)可能會(huì)使熒光發(fā)射光譜的形狀和熒光峰位置發(fā)生畸變, 其作用機(jī)制本質(zhì)上是熒光的自吸收效應(yīng)[11]。 從前文可知, 吲哚和3-甲基吲哚的熒光發(fā)射光譜和吸收光譜有一定的重疊, 且熒光量子產(chǎn)率較高, 熒光在比色皿中的行程距離內(nèi)更易被溶液中處于基態(tài)的分子部分吸收后再次發(fā)射熒光, 這種自吸收導(dǎo)致的二次發(fā)光甚至多次發(fā)光現(xiàn)象使得表觀熒光壽命變長(zhǎng)。 隨著濃度增大, 多次發(fā)光比例增多, 檢測(cè)得到熒光壽命值就愈大[12]。

表3 不同濃度下吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸溶液的熒光壽命Table 3 The fitting results of fluorescence lifetime of indole, 3-methylindole and L-tryptophan at different concentrations

3 結(jié) 論

研究了吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的三維熒光光譜、 熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命。 濃度為0.01 mmol·L-1時(shí), 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的量子產(chǎn)率分別約為0.264、 0.347和0.145, 濃度為0.1 mmol·L-1時(shí), 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的熒光壽命分別約為4.149、 7.896和2.715 ns。 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的三維熒光光譜形狀相似, 難以準(zhǔn)確區(qū)分, 但其熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命展現(xiàn)出明顯的差異。 本研究結(jié)果初步表明, 熒光壽命和量子產(chǎn)率有潛力應(yīng)用于熒光有機(jī)物的精確區(qū)分, 為有機(jī)物的識(shí)別與鑒定提供了一種新的方法。