馬菁華 劉芳 任啟飛 范志偉 歐明燭 陳云飛

摘要： 根腐病、炭疽病、葉斑病等多種病害會(huì)造成黃精產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降。本研究從多花黃精根際及塊莖中分離得到37株菌株，并接種于無(wú)菌組培苗進(jìn)行致病鑒定，從中篩選出12株致病菌。結(jié)合菌株致病特征和菌落形態(tài)，從12株致病菌中選擇7株致病菌進(jìn)行進(jìn)一步觀察。通過(guò)測(cè)定rDNA-ITS、TEF-1α基因序列，鑒定出這7株致病菌中2株為尖孢鐮刀菌、2株為腐皮鐮刀菌、1株為芬芳鐮刀菌、1株為卵形孢球托霉、1株為裂褶菌。其中，葉片上尖孢鐮刀菌QB-ed-1致病力最強(qiáng)，尖孢鐮刀菌E-rz-7次之；塊莖中尖孢鐮刀菌QB-ed-1致病力最強(qiáng)，芬芳鐮刀菌E-ed-2次之。菌株QB-ed-1對(duì)黃精葉片和塊莖都有較強(qiáng)的致病力。本研究提供了一種主動(dòng)篩選多花黃精致病真菌的方法，可在病害發(fā)生前預(yù)先篩選可能的致病菌，為黃精病害檢測(cè)和防控提供了有效的檢測(cè)手段。

關(guān)鍵詞： 多花黃精；真菌病害；致病性；鐮刀菌屬真菌；卵形孢球托霉；裂褶菌

中圖分類(lèi)號(hào)： S432.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??文章編號(hào)： 1000-4440（2023）07-1472-11

Screening and pathogenicity analysis of pathogenic fungi causing diseases on Polygonatum cyrtonema

MA Jing-hua， LIU Fang， REN Qi-fei， FAN Zhi-wei， OU Ming-zhu， CHEN Yun-fei

（Guizhou Botanical Garden， Guiyang 550004， China）

Abstract： Various diseases such as root rot， anthracnose， and leaf spot can cause a decrease in yield and quality of Polygonatum. In this study， 37 fungal strains were isolated from the rhizosphere and tubers of Polygonatum cyrtonema. Pathogenic identification was carried out using sterile tissue culture seedlings， and 12 fungal strains were selected. Based on the pathogenic characteristics and colony morphology of the strains， seven fungal strains were selected from 12 fungal strains for further observation. By sequencing rDNA-ITS， TEF-1 α gene， these seven pathogenic fungi were identified as two strains of Fusarium oxysporum， two trains of Fusarium solani， one strain of Fusarium redolens， one strain of Gongronella butleri and one strains of Schizophyllum commune. Among them， the pathogenicity of Fusarium oxysporum QB-ed-1 on the leaves was the strongest， followed by Fusarium oxysporum E-rz-7. The pathogenicity of Fusarium oxysporum QB-ed-1 in tubers was the strongest， followed by Fusarium redolens E-ed-2. The strain QB-ed-1 had strong pathogenicity to the leaves and tubers of Polygonatum. This study provides a method for actively screening pathogenic fungi of Polygonatum cyrtonema， which can pre-screen potential pathogenic fungi before the occurrence of the disease，providing an effective detection method for Polygonatum disease detection and prevention.

Key words： ?Polygonatum cyrtonema；fungal diseases；pathogenicity；Fusarium graminearum；Gongronella butleri；Schizophyllum commune

黃精是百合科黃精屬多年生草本植物，其中多花黃精（Polygonatum cyrtonema）、黃精（Polygonatum sibiricum）、滇黃精（Polygonatum kingianum）列入《中國(guó)藥典》[1]，為中國(guó)重要的藥食同源植物。隨著其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用，黃精種植面積不斷增加，莖腐病、葉枯病、炭疽病等多種病害也隨之發(fā)生，給藥農(nóng)造成嚴(yán)重?fù)p失[2]。目前針對(duì)黃精病害及其致病菌已有較多研究，主要有兩種研究方向，其一針對(duì)病害部位進(jìn)行組織分離以篩選病原菌，其二以黃精根際土壤或藥用部位為對(duì)象研究其寄生的真菌群落。前者詳細(xì)闡述了黃精各病害發(fā)生的時(shí)間、過(guò)程、危害程度及各發(fā)病階段葉片、塊莖以及整個(gè)植株的癥狀，有針對(duì)性地分離到對(duì)應(yīng)致病菌并進(jìn)行形態(tài)和致病性的檢測(cè)分析。如莖腐病引起滇黃精莖部褐色病斑最終導(dǎo)致植株莖部干枯倒伏，嚴(yán)重可致70%的植株發(fā)病，從滇黃精莖部分離出致病菌滇黃精刺盤(pán)孢[3]。根腐病引起多花黃精葉片變黃、根狀莖腐爛、植株枯萎等，從多花黃精根部分離出致病菌尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌[4]。葉枯病首先在葉部形成水浸狀病斑，后葉緣變黃褐色，最終整個(gè)葉片枯死，從多花黃精葉片分離出致病菌尖孢鐮刀菌[5]。炭疽病在葉面形成褐色病斑并著生黑色菌絲顆粒，至莖稈枯死，植株發(fā)病率達(dá)20%以上，致病菌為Colletotrichum circinans （Berk.） Vogl [6]。褐斑病為褐色病斑，著生黑色子實(shí)體，可使葉片組織壞死、穿孔，導(dǎo)致植株地上部分枯死，致病菌為棕櫚擬盤(pán)多毛孢[7]。后者采用平板培養(yǎng)法培養(yǎng)黃精內(nèi)生或根際真菌進(jìn)行寄生真菌種類(lèi)的統(tǒng)計(jì)和分析，或采用高通量測(cè)序技術(shù)全面描述微生物群落環(huán)境。分離滇黃精寄生真菌，得到37株可培養(yǎng)真菌，包含21株鐮刀菌屬真菌、12株黑綠木霉及其他真菌[8]。從泰山黃精根莖葉和果實(shí)中共分離32株可培養(yǎng)真菌，其中鐮刀菌屬占比最大，其次為不產(chǎn)孢真菌（Sterile mycelia）和鏈格孢屬真菌（Alternaria sp.）[9]。黃精（種）根莖內(nèi)生真菌群落的優(yōu)勢(shì)真菌依次為Setophoma、肉座菌目的未鑒定屬、新赤殼屬、棘殼孢屬和Cutaneotrichosporon等真菌，根際和內(nèi)生共有的真菌相對(duì)豐度較大的依次為Setophoma、籃狀菌屬、肉座菌目的未鑒定屬、新赤殼屬、角擔(dān)菌科的未鑒定屬、鐮刀菌屬等真菌[10]；多花黃精根際真菌群落中鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬之一，且患根腐病的病株根際中的相對(duì)豐度高于健康植株根際[11]。不同研究方向和手段展示出黃精不同的寄生真菌類(lèi)群，而許多致病菌并非優(yōu)勢(shì)菌屬，卻導(dǎo)致了病害發(fā)生。鑒于此，我們以多花黃精為材料主動(dòng)篩選其根際及內(nèi)生真菌，研究其致病性，可在病害發(fā)生前發(fā)現(xiàn)可能的致病菌，為病害防控研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植株1：多花黃精多年齡植株，采自貴州省植物園黃精苗圃，圃?xún)?nèi)黃精引種自貴州省內(nèi)外多地，包括湖北（E）、貴州畢節(jié)（QB）、貴州水城（QS）、貴州銅仁（QT）、貴州遵義（QZ），取黃精塊莖及根進(jìn)行真菌篩選。

供試植株2：多花黃精無(wú)根組培苗，由團(tuán)隊(duì)研究人員擴(kuò)繁，用于快速鑒定致病真菌。

供試植株3：2年生多花黃精塊莖繁殖植株，植株高大，莖葉繁盛，長(zhǎng)勢(shì)健康，用于對(duì)所篩致病真菌進(jìn)行葉片致病力測(cè)定。

供試植株4：2年生多花黃精種子繁殖植株，植株健康，長(zhǎng)勢(shì)整齊，用于對(duì)所篩致病真菌進(jìn)行塊莖致病力測(cè)定。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基用于真菌培養(yǎng)；MS培養(yǎng)基含蔗糖25 g，瓊脂粉6 g，不添加激素，用于黃精無(wú)根組培苗培養(yǎng)。

1.2 菌株分離純化

1.2.1 根際真菌分離 采集新鮮黃精植株，抖落根部松散土壤后附著于根上的為根際土，按照1 g土添加10 ml水的比例添加無(wú)菌水于根際中，室溫下160 r/min振蕩2 h，靜置10 min后將上清液用無(wú)菌水稀釋1×102～1×104倍，每種稀釋液分別取20 μl涂布于PDA平板。另在無(wú)菌操作臺(tái)用無(wú)菌剪刀將黃精根系沿塊莖處剪斷，傷口在酒精燈下灼燒2 s，用無(wú)菌水沖洗3次，晾干后平鋪于PDA培養(yǎng)基表面。每種處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 塊莖內(nèi)生真菌分離 取多花黃精新鮮塊莖在自來(lái)水下沖洗10 min，之后在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)操作。切取3段塊莖，每段厚2 cm，依次用75%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌水漂洗3次，5%次氯酸鈉浸泡5 min，無(wú)菌水漂洗5次，置于滅菌濾紙晾干，用手術(shù)刀削去表皮，剩余塊莖切成薄片置于PDA培養(yǎng)基表面，削去的表皮將切面在酒精燈下灼燒2 s，同最后一次的洗滌水一起作為對(duì)照，平鋪或涂布于PDA培養(yǎng)基，以驗(yàn)證消毒是否徹底。每種處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.3 菌株純化 培養(yǎng)3～5 d后，平板上長(zhǎng)出較多真菌菌落，挑取菌落邊緣菌絲至新鮮PDA培養(yǎng)基，反復(fù)純化至菌落單一，觀察并記錄各菌株菌落形態(tài)，保存于試管斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病真菌篩選

挑選形態(tài)差異較大的菌株轉(zhuǎn)接到新鮮PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，在菌落邊緣切取直徑0.5 cm的菌餅，接種于多花黃精無(wú)菌組培苗莖基部，置于25 ℃光下繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌株及植株生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)植株發(fā)病情況，記錄可導(dǎo)致多花黃精發(fā)病的菌株及發(fā)病癥狀，篩選致病真菌。

1.4 致病真菌形態(tài)鑒定

根據(jù)菌株引起的植株病癥及菌落形態(tài)，挑選致病能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定。在平板邊緣切取直徑0.5 cm的圓形菌餅，轉(zhuǎn)入新鮮PDA培養(yǎng)基，28 ℃暗培養(yǎng)7 d，挑取少量菌絲用水浸法制片，在尼康 ECLIPSE Ni-E正置顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)并拍照。

1.5 致病真菌分子生物學(xué)鑒定

待鑒定致病菌委托深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司提取真菌DNA并擴(kuò)增相關(guān)基因序列，進(jìn)行真菌分子生物學(xué)鑒定。首先對(duì)真菌目的基因rDNA-ITS測(cè)序，初步結(jié)果顯示較多菌株為鐮刀菌，由于rDNA-ITS對(duì)鐮刀菌屬種間鑒別能力較弱[12]，進(jìn)一步對(duì)真菌目的基因TEF-1α測(cè)序，引物序列如表1所示。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50.0 μl）：基因組DNA（20 ng/ml）1.0 μl，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μl，Taq聚合酶（5 U/μl）1.0 μl，10 mmol/L dNTP 1.0 μl，引物1（10 μmol/L）1.5 μl，引物2（10 μmol/L）1.5 μl，ddH2O 39.0 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后，取3 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，取純化后的PCR產(chǎn)物使用測(cè)序儀ABI3730-XL進(jìn)行測(cè)序。

用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行同源序列比對(duì)，使用MEGA11.0軟件，采用最大似然法（Maximum Likelihood Estimate）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.6 致病真菌致病力測(cè)定

選擇健康生長(zhǎng)的盆栽多花黃精，采用創(chuàng)傷接種法，將各菌株分別接種至多花黃精活體葉片或塊莖上。用75%的酒精對(duì)葉片背面和塊莖接種部位進(jìn)行表面消毒，2 min后用無(wú)菌手術(shù)刀輕輕劃傷葉脈和塊莖，取直徑0.5 cm的菌餅，菌絲面貼于傷口部位，對(duì)照使用相同大小的PDA培養(yǎng)基。各處理3次重復(fù)，置于溫室培養(yǎng)，2 d后取下菌餅或培養(yǎng)基，15 d后測(cè)定病斑大小。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010整理原始數(shù)據(jù)并作圖，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，Duncan’s法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際真菌與內(nèi)生真菌菌落形態(tài)

從苗圃?xún)?nèi)的多花黃精植株中共分離到37株真菌，包括根際真菌24株，塊莖內(nèi)生真菌13株。其中從引種自湖北省的多花黃精植株中分離到真菌20株，包括根際真菌12株，內(nèi)生真菌8株；從引種自貴州省畢節(jié)市的多花黃精植株中分離到7株，包括根際真菌4株，內(nèi)生真菌3株；從引種自貴州省六盤(pán)水市水城區(qū)的多花黃精植株中分離到2株，均為根際真菌；從引種自貴州省銅仁市的多花黃精植株中分離到3株，均為根際真菌；從引種自貴州省遵義市的多花黃精植株中分離到5株，包括根際真菌3株，內(nèi)生真菌2株。各菌株菌落形態(tài)如表2所述。

所分離的真菌菌株菌落形狀多數(shù)為圓形，菌絲呈白色絮狀，蓬松或綿密；部分真菌菌株產(chǎn)生色素，在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)紫色、粉色或土黃色等顏色，少數(shù)真菌菌株形成色素環(huán)；少數(shù)真菌菌株菌落形狀不規(guī)則。根據(jù)形態(tài)初步推斷大部分真菌菌株為鐮刀菌屬。

2.2 致病真菌確定及其致病過(guò)程

選取16株真菌菌株接種于無(wú)菌培養(yǎng)的黃精莖基部，用于研究其致病性，30 d后觀察各菌株及植株生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3所示。從真菌菌株生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)看，各菌株在接種至MS培養(yǎng)基后能夠在培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，多數(shù)真菌菌絲接觸植株后會(huì)纏繞莖葉生長(zhǎng)，少數(shù)菌株則僅在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，不會(huì)攀附植株。從植株生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)看，少數(shù)植株正常生長(zhǎng)，多數(shù)植株則表現(xiàn)出不同程度的染病狀態(tài)，受菌絲侵染的植株莖葉綠色褪去，呈現(xiàn)水浸狀，部分植株受侵染部位出現(xiàn)紅色或紅褐色。

可見(jiàn)不同菌株對(duì)多花黃精生長(zhǎng)的影響不同，部分菌株對(duì)多花黃精無(wú)致病危險(xiǎn)，而有些菌株則會(huì)導(dǎo)致多花黃精感病死亡。如圖1所示，瓶A不接種菌株，葉片鮮綠，植株挺拔，長(zhǎng)勢(shì)良好；瓶B接種菌株E-ed-1，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基并纏繞植株導(dǎo)致莖葉失綠、萎蔫、腐爛，植株接近死亡；瓶C接種菌株QT-rz-2，菌絲鋪滿(mǎn)培養(yǎng)基，但植株葉片鮮綠，長(zhǎng)勢(shì)良好。根據(jù)植株生長(zhǎng)狀態(tài)，將各真菌菌株分為致病菌和非致病菌。接種E-rz-3、QS-rz-2、QT-rz-2，植株正常生長(zhǎng)，E-rz-6侵染能力較弱，植株基本正常生長(zhǎng)，將這4株菌株定義為非致病菌，其余12株引起植株感病，定義為致病菌。

致病菌中E-rz-1、QZ-rz-3、E-ed-2、E-ed-7致病癥狀相同，植株均出現(xiàn)水浸狀，產(chǎn)生紅褐色，并最終死亡。E-rz-5、E-ed-6致病癥狀相同，植株受菌絲侵染部分發(fā)紅，并最終死亡。E-rz-7、QB-rz-3、QB-rz-4、E-ed-1致病癥狀相同，植株莖葉失綠，呈現(xiàn)水浸狀，并最終死亡。QS-rz-1使植株受侵染部分失綠，植株不產(chǎn)生水浸狀和色素，最終依然死亡。QB-ed-1使植株受侵染部分呈水浸狀并易折斷，最終導(dǎo)致植株死亡。各致病菌侵染黃精致病過(guò)程相同，圖2以E-ed-1為例展示了植株發(fā)病過(guò)程。

2.3 致病菌形態(tài)鑒定

結(jié)合各菌株致病特征和菌落形態(tài)，選擇E-rz-5、E-rz-7、QS-rz-1、QZ-rz-3、E-ed-1、E-ed-2、QB-ed-1共7株真菌菌株進(jìn)行進(jìn)一步的觀察。各菌株菌落形態(tài)為圓形或接近圓形，菌絲均為白色，部分菌株在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生特定色素引起菌落正面或背面呈不同的顏色。其中E-rz-5、QZ-rz-3形態(tài)相似，菌落圓形，菌絲白色，呈輻射狀，不同之處在于二者菌落背面的顏色，E-rz-5為橙黃色，QZ-rz-3為姜紅色。E-rz-7、QB-ed-1形態(tài)相似，菌落圓形，菌絲白色，菌落正面略見(jiàn)淺紫色，不同之處在于二者菌落背面，E-rz-7呈現(xiàn)紫色同心圓環(huán)，QB-ed-1呈現(xiàn)粉色同心圓環(huán)。QS-rz-1菌落形狀接近圓形，但不規(guī)則，菌絲白色而綿密，菌落背面為白色。E-ed-1菌落圓形，菌絲白色，菌落背面土黃色。E-ed-2菌落形狀接近圓形，但不規(guī)則，菌絲白色絮狀，菌落正面和背面都呈現(xiàn)粉色同心圓環(huán)（圖3A）。從顯微鏡中觀察到，在試驗(yàn)所用培養(yǎng)基上，E-rz-5、E-rz-7、QZ-rz-3、E-ed-2、QB-ed-1 5株真菌菌株的菌絲有不同程度分節(jié)，均具有分生孢子梗，產(chǎn)生大小不同的橢圓或鐮刀狀孢子，具備鐮刀菌屬特征。QS-rz-1、E-ed-1 2株真菌菌株的菌絲不分節(jié)，其中QS-rz-1孢子球形，與菌絲相連，無(wú)游離孢子，E-ed-1無(wú)孢子（圖3B、圖3C）。

2.4 致病真菌分子生物學(xué)鑒定

利用真菌通用引物ITS1、ITS4對(duì)各致病菌基因組進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，分別獲得對(duì)應(yīng)基因片段。將序列提交至NCBI比對(duì)，得到與待測(cè)物種序列相似性最大的物種信息，并將結(jié)果提交至國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NMDC）。如表4所示，對(duì)各致病菌rDNA-ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，從各菌株中都獲得長(zhǎng)度500 bp以上的片段，分別與Fusarium、Gongronella、Schizophyllum 3個(gè)屬5個(gè)種的同源性高，相似度達(dá)98.70%以上。

對(duì)各致病菌TEF-1α基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，分別獲得對(duì)應(yīng)基因片段，將序列提交至NCBI比對(duì)，得到與待測(cè)物種序列相似性最大的物種信息。如表5所示，QS-rz-1、E-ed-1未檢測(cè)到擴(kuò)增序列，其他菌株均獲得長(zhǎng)度670 bp以上的片段，同表4結(jié)果一致，均屬于Fusarium，5個(gè)種的同源性高，相似度均達(dá)98.59%以上。

下載各菌株rDNA-ITS基因擴(kuò)增序列，比對(duì)結(jié)果中相似性最大的5個(gè)物種DNA序列，采用最大似然法對(duì)各菌株及其相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，得到各菌株的進(jìn)化信息，如圖4所示。7株菌株分屬于3個(gè)屬5個(gè)種，分別為Fusarium oxysporum （E-rz-7、QB-ed-1）、Fusarium redolens （E-ed-2）、Fusarium solani （E-rz-5、QZ-rz-3）、Schizophyllum commune （E-ed-1）、Gongronella butleri（QS-rz-1）。分枝上的數(shù)據(jù)表示Bootstrap檢驗(yàn)的支持百分率，各分枝Bootstrap檢驗(yàn)的支持率都在60%以上，計(jì)算結(jié)果可信。

綜上，致病菌株E-rz-5、E-rz-7、QS-rz-1、QZ-rz-3、E-ed-1、E-ed-2、QB-ed-1依次鑒定為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、卵形孢球托霉（Gongronella butleri）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、裂褶菌（Schizophyllum commune）、芬芳鐮刀菌（Fusarium redolens）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.5 致病真菌致病力測(cè)定

采用創(chuàng)傷接種法在健康多花黃精葉片分別接種不同致病菌15 d后，接種部位呈現(xiàn)大小不同的病斑（圖5A）。未接種致病菌對(duì)照，葉片劃痕已不明顯且沒(méi)有病斑，接種QS-rz-1、E-ed-1、E-ed-2的葉片在劃痕處的正面和背面呈現(xiàn)黃色至褐色干枯病斑，接種E-rz-5、E-rz-7、QZ-rz-3、QB-ed-1的葉片在劃痕處有較大病斑，已透穿葉片呈現(xiàn)孔洞。對(duì)葉片病斑大小統(tǒng)計(jì)，并與對(duì)照相比發(fā)現(xiàn)，E-rz-5、E-rz-7、QB-ed-1菌株的致病力強(qiáng)（表6）。

在塊莖接種致病菌15 d后，接種部位呈現(xiàn)不同程度的病癥（圖5B）。未接種致病菌對(duì)照，刀片傷口細(xì)小且已干燥，接種QZ-rz-3、E-ed-1的塊莖劃痕處變褐，呈現(xiàn)輕微水浸狀，接種E-rz-5、E-rz-7、QS-rz-1、E-ed-2、QB-ed-1的塊莖劃痕處變褐，呈現(xiàn)水浸狀且腐爛、凹陷。對(duì)塊莖病斑大小統(tǒng)計(jì)，并與對(duì)照相比，結(jié)果表明，E-rz-5、E-rz-7、QS-rz-1、E-ed-2、QB-ed-1菌株的致病力強(qiáng)（表6）。

通過(guò)病菌致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)致病菌對(duì)葉片和塊莖均有一定的致病能力，但癥狀和速度不同。葉片的病斑較為干燥，而塊莖的病斑則呈現(xiàn)水浸狀，且有不同程度的凹陷和腐爛。從適應(yīng)能力來(lái)看， 菌株E-rz-5、E-rz-7和QB-ed-1在葉片和塊莖均能生存并侵染使之感病。從致病力來(lái)看，葉片中QB-ed-1致病力最強(qiáng)， E-rz-7次之；塊莖中QB-ed-1致病力最強(qiáng)， E-ed-2次之。綜合來(lái)看，菌株QB-ed-1對(duì)黃精葉片和塊莖的致病力都最強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

對(duì)貴州省植物園黃精種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)不同引種地的多花黃精根際真菌及內(nèi)生真菌進(jìn)行篩選和純化，共分離出37株真菌菌株。根際的真菌數(shù)量較塊莖內(nèi)部多，且多數(shù)呈現(xiàn)輻射狀菌絲，內(nèi)生菌則很少，與樊銳鋒等 [10]研究結(jié)果相同。目前暫無(wú)研究討論菌絲形態(tài)及其影響因素，不確定是否由于菌絲在植株體內(nèi)缺乏足夠空間導(dǎo)致無(wú)法自由伸展。從湖北省多花黃精分離的真菌菌株菌落多為圓形或不規(guī)則圓形，菌絲多白色絮狀帶少許粉色、紫色或土黃色，而從貴州省多花黃精分離的真菌菌株菌落不規(guī)則形狀更多，且菌絲為粉末狀，呈現(xiàn)墨綠色或黑色，由于樣點(diǎn)和樣本數(shù)量較少，其規(guī)律和原因需進(jìn)一步研究分析。根據(jù)前期菌落形態(tài)特征分析及后期分子生物鑒定都發(fā)現(xiàn)鐮刀菌占了很大比例，這與譚偉等[8]研究結(jié)果類(lèi)似。但致病菌的種屬及致病力與宿主采集地和分離部位沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)，且同種致病菌的致病力也有強(qiáng)有弱，說(shuō)明致病菌的危害與菌株自身特性關(guān)系更密切。

黃精屬植物病害已引起科研人員的廣泛關(guān)注，諸多病害的病原菌被分離出來(lái)。從滇黃精、黃精、多花黃精等根莖腐爛病病斑部位分離并鑒定的病原菌有滇黃精刺盤(pán)孢[3]、尖孢鐮刀菌 [4，13-14 ]、腐皮鐮刀菌[4， 14 ]、F. foetens[15]和F. hostae [15]。從炭疽病病斑部位分離并鑒定的病原菌有果生炭疽菌[16]、膠孢炭疽菌[16]、尖孢炭疽菌[16]、C. spaethianum[17]、松針炭疽菌[18]、博寧炭疽菌[18]。從葉枯病、褐斑病、黑斑病等病斑部位鑒定出的病原菌依次為尖孢鐮刀菌[5]、棕櫚擬盤(pán)多毛孢[7]、鏈格孢屬真菌[19]。本研究分離鑒定出2株尖孢鐮刀菌、2株腐皮鐮刀菌、1株芬芳鐮刀菌、1株卵形孢球托霉和1株裂褶菌，其中同一株尖孢鐮刀菌能同時(shí)危害葉片和塊莖。本研究首次發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌對(duì)黃精葉片致病，也首次發(fā)現(xiàn)卵形孢球托霉、裂褶菌對(duì)作物致病。

鐮刀菌屬真菌可導(dǎo)致多種經(jīng)濟(jì)作物土傳病害的發(fā)生，是主要的致病真菌之一[20-25]。有針對(duì)西瓜專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌的研究結(jié)果表明，該菌在室內(nèi)平板培養(yǎng)中通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制土壤中較多細(xì)菌和放線(xiàn)菌，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)及次生代謝產(chǎn)物抑制部分真菌生長(zhǎng)，且其數(shù)量在西瓜多年連作后急劇上升[26]。因而作者大膽推測(cè)相對(duì)于其他屬真菌，鐮刀菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)，有更強(qiáng)的可培養(yǎng)性，無(wú)論在土壤、植株體內(nèi)、人工培養(yǎng)基上都能很好地適應(yīng)并進(jìn)行繁殖。且鐮刀菌可分泌果膠酶、纖維素酶等細(xì)胞壁降解酶[27]，還會(huì)分泌鐮刀菌酸、脫氫鐮刀菌酸等毒素[28]對(duì)植物造成毒害，導(dǎo)致作物病害發(fā)生。有研究結(jié)果表明，從巖石表面分離到1株卵形孢球托霉，其能夠產(chǎn)生有機(jī)酸松化巖石使菌絲能夠插入巖石內(nèi)部，從而達(dá)到侵蝕石灰?guī)r釋放金屬離子的效果[29]。本研究發(fā)現(xiàn)卵形孢球托霉菌絲綿密不易切段，且其菌絲能夠纏繞植株莖葉并導(dǎo)致莖葉綠色褪去而死亡，推測(cè)其菌絲深入植物組織阻斷了植株水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸而導(dǎo)致病害的發(fā)生。裂褶菌多作為營(yíng)養(yǎng)美味的食用菌，寄生于腐爛木材，但其同樣能夠寄生于宿主并通過(guò)菌絲纏繞等將宿主殺死[30]。

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果和有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，土壤和植物體內(nèi)長(zhǎng)期大量存在多種微生物，隨著作物種植年限增加，有害微生物及其代謝產(chǎn)物逐漸在土壤積累，當(dāng)溫度、濕度等環(huán)境條件適宜或植物受到外力損傷時(shí)，可能引發(fā)病害[31]。本研究篩選出多花黃精致病菌，下一步將篩選拮抗、促生菌，并檢測(cè)黃精根際微生物群落結(jié)構(gòu)的建立與致病菌、拮抗菌數(shù)量和種類(lèi)之間的關(guān)系，以期能夠在致病菌引起病害之前及時(shí)預(yù)測(cè)其發(fā)生，并利用拮抗菌遏制致病菌生長(zhǎng)和繁殖，對(duì)作物的田間病害預(yù)防起到積極作用。

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