殷海棠，文志鵬，楊繼紅，李明，李琴，趙青青，肖堅

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2.藥學(xué)部，3.GCP中心，4.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，貴州 貴陽 550004；5.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 藥學(xué)部，湖南 長沙 410008）

膠質(zhì)瘤是一種常見的成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腦瘤，具有侵襲性強、病死率高、預(yù)后差等特點，患者生存期僅有12～15 個月，5 年生存期約為5.5%[1]。膠質(zhì)瘤治療方式主要包括手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療[2]。替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）是臨床治療膠質(zhì)瘤的一線藥物，不良反應(yīng)大，選擇性差，療效不理想[3]。因此，探尋新的抗膠質(zhì)瘤藥物對改善患者預(yù)后有一定意義。

自噬是在一系列信號通路調(diào)控下細胞利用溶酶體降解自身細胞質(zhì)蛋白和受損細胞器的生物學(xué)過程[4]。自噬過程一般包括自噬小泡成核、內(nèi)膜擴張、自噬小體形成、自噬小體與溶酶體融合、底物降解5 個階段。近年來研究表明，自噬對多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有重要調(diào)控作用，抑制自噬可以阻礙包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生[5]。因此，以自噬為靶點探索新的膠質(zhì)瘤治療分子機制，可能為膠質(zhì)瘤治療提供新的方向。蝙蝠葛蘇林堿（Daurisoline, DAS）是從中藥蝙蝠葛根莖中提取的四氫異喹啉類天然生物堿[6]。DAS 具有豐富的藥理作用，被用于癲癇[7]、心血管[8]、腫瘤[9]等疾病的研究與治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DAS 具有良好的抗腫瘤活性，但其在膠質(zhì)瘤中的作用尚未明確。本研究旨在探索DAS 抗膠質(zhì)瘤的作用及其潛在分子生物學(xué)機制，為闡明DAS抗膠質(zhì)瘤的藥理作用提供基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251 和U87（中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）。DAS（上海藍木化工有限公司），CCK-8 試劑（北京蘭杰柯科技有限公司），胎牛血清（美國Thermo Fisher Scientific 公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、4%多聚甲醛、結(jié)晶紫染色液、RIPA Lysis Buffer RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Edu 試劑盒、BeyoECL Plus（超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），Bax、Bcl-2、p-Akt（Ser473）、p-mTOR（Ser448）、Akt、mTOR、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記的山羊抗鼠IgG 及HRP 標記的山羊抗兔IgG（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），LC3B、SQSTM1/P62 抗體（美國CST 公司）。

酶標儀、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），倒置熒光顯微鏡（德國ZEISS公司），透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司），流式細胞儀（美國Beckman 公司），電泳儀（美國Bio-Rad 公司），細胞培養(yǎng)超凈臺（新加坡Esco 公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇U251 和U87 細胞，置于T25培養(yǎng)瓶中，加入含10% 胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM），移入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞匯合度達80%～90%按1∶3 傳代或冷凍保存。取培養(yǎng)3 代后細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞活力測定 將細胞以1×103個/孔的密度接種于96 孔板中，設(shè)置對照組、2.5 μmol/L DAS 組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L TMZ 組。每組設(shè)置3 個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h 后，用含10 μL CCK-8 的100 μL DMEM 替換原培養(yǎng)基，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，使用酶標儀在450 nm 處測光密度（optical density, OD）值。

1.2.3 Edu 實驗 將細胞以1×105個/孔的密度接種于6 孔板中，用不同濃度的DAS 處理72 h 后棄掉培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Trition X-100 孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）洗滌3 次，按試劑盒說明書進行操作，加入Hoechst 33342 溶液避光孵育10 min，倒置熒光顯微鏡拍照，用Image J 軟件計算陽性細胞。

1.2.4 克隆實驗 將細胞以1×103個/孔的密度接種于6 孔板中，設(shè)置3 組：對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組。在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)2 周，4%（v/v）多聚甲醛固定細胞20 min，0.1%（w/v）結(jié)晶紫染色10 min，PBS 洗滌3 次，對6 孔板進行拍照，用Image J 軟件計算各組的克隆形成數(shù)。

1.2.5 細胞凋亡 將細胞計數(shù)后按2×105個/孔接種于6 孔板中。設(shè)置3 組：對照組、5.0 μmol/L DAS組、10.0 μmol/L DAS 組。培養(yǎng)72 h 后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，將沉淀用500 μL loading buffer 重懸，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白Annevin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（propidium iodide, PI），暗室染色10 min，流式細胞儀檢測，通過FlowJo 分析細胞凋亡。

1.2.6 透射電鏡觀察自噬囊泡的形成 將細胞用3%戊二醛和1%四氧化鋨酸固定，丙酮脫水，812 環(huán)氧樹脂包埋，制片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色15 min 后，用透射電子顯微鏡觀察細胞自噬囊泡的形成情況。

1.2.7 Western blotting 檢測細胞相關(guān)蛋白表達 用含蛋白酶抑制劑（苯甲基磺酰氟，PMSF）的RIPA 裂解液裂解細胞，收集上清液。使用BCA 蛋白測定試劑測定蛋白濃度。SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）以1∶4（v/v）的比例加入蛋白上清樣品，100 ℃金屬浴10 min。將蛋白質(zhì)加入到SDS-PAGE 凝膠泳道電泳，蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別用一抗GAPDH（1∶5 000）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶5 000）、p62（1∶1 000）、LC3B（1∶1 000）、Akt（1∶5 000）、p-Akt（1∶1 000）、mTOR（1∶5 000）和pmTOR（1∶2 000）在4 ℃條件下過夜孵育條帶，洗滌3 次，加入相應(yīng)二抗（1∶5 000）常溫下孵育1 h，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光液，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察印跡條帶，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAS抑制膠質(zhì)瘤細胞活力

對照組、2.5 μmol/L DAS 組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞活力比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞活力均低對照組、2.5 μmol/L DAS 組。因此以5.0 和10.0 μmol/L DAS 作為后續(xù)研究濃度，對比DAS、TMZ對U251 和U87 細胞活力影響。見表1。

表1 4組U251和U87細胞活力比較 （%，±s）

表1 4組U251和U87細胞活力比較 （%，±s）

注 ： ?與對照組、2.5 μmol/L DAS組比較，P ＜0.05。

U87細胞100.00±0.00 85.11±3.61 60.65±4.57?34.51±5.61?151.300 0.000組別對照組2.5 μmol/L DAS組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值U251細胞100.00±0.00 79.06±3.67 56.24±4.71?28.22±4.92?190.300 0.000

對照組、10.0 μmol/L TMZ 組、10.0 μmol/L DAS組U251 細胞活力分別為（100.00±0.00）%、（89.19±1.98）%、（28.22±4.92）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=336.100，P=0.000）；10.0 μmol/L DAS 組細胞活力低于10.0 μmol/L TMZ 組（P＜0.05）。對照組、10.0 μmol/L TMZ 組、10.0 μmol/L DAS 組U87 細胞活力分別為（100.00±0.00）% 、（92.37±2.12）% 、（34.51±5.61）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1397.000，P=0.000）；10.0 μmol/L DAS 組細胞活力低于10.0 μmol/L TMZ 組（P＜0.05）。DAS 在膠質(zhì)瘤細胞U251 和U87 的IC50 分別為5.11 μmol/L 和6.35 μmol/L。見圖1。

圖1 DAS在膠質(zhì)瘤細胞U251和U87中的IC50

2.2 DAS抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞Edu 陽性率比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組細胞Edu 陽性率降低（P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明呈濃度依賴性。見表2 和圖2。

圖2 不同濃度DAS對細胞增殖的影響

表2 3組U251和U87細胞增殖情況比較 （±s）

表2 3組U251和U87細胞增殖情況比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/L DAS組比較，P ＜0.05。

組別Edu陽性率/%U251細胞71.33±1.52 43.43±1.46①30.76±0.68①②784.800 0.000 U87細胞29.66±1.52 17.80±0.72①10.53±0.50①②270.200 0.000對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值克隆形成數(shù)/個U251細胞494.66±32.24 176.00±10.81①84.33±9.29①②319.000 0.000 U87細胞623.00±42.03 412.66±36.07①235.66±15.30①②102.500 0.000

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞克隆形成數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組細胞克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明呈濃度依賴性。見表2 和圖2。

2.3 DAS促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組細胞凋亡率升高（P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（（P＜0.05），表明呈濃度依賴性。見表3 和圖3。

圖3 不同濃度DAS對細胞凋亡的影響

表3 3組U251和U87細胞凋亡率比較 （%，±s）

表3 3組U251和U87細胞凋亡率比較 （%，±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/L DAS 組比較，P ＜0.05。

U87細胞2.46±0.87 6.39±0.60①11.63±2.2①②30.620 0.000組別對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值U251細胞2.18±0.17 6.68±0.71①12.51±1.74①②67.390 0.000

對照組、5.0 μmol/L DAS 組和10.0 μmol/L DAS組U251 和U87 細胞Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組Bax 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表4 和圖4。

圖4 3組U251和U87細胞Bax、Bcl-2蛋白的表達

表4 3組U251和U87細胞Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 3組U251和U87細胞Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/LDAS 組比較，P ＜0.05。

組別U251細胞U87細胞對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值Bcl-2蛋白0.38±0.03 0.28±0.04①0.10±0.00①②56.460 0.000 Bax蛋白0.66±0.03 0.77±0.04①0.90±0.02①②27.350 0.001 Bcl-2蛋白0.52±0.04 0.42±0.03①0.32±0.01①②29.190 0.000 Bax蛋白0.52±0.01 0.64±0.02①0.82±0.07①②29.700 0.000

2.4 DAS對膠質(zhì)瘤細胞自噬的影響

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞p62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組p62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表5 和圖5。

圖5 3組U251和U87細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白的表達

表5 3組U251和U87細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白相對表達量比較 （±s）

表5 3組U251和U87細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白相對表達量比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/L DAS組比較，P ＜0.05。

組別U251細胞U87細胞對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值p62蛋白0.26±0.02 0.39±0.01①0.49±0.02①②71.260 0.000 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白0.11±0.00 1.15±0.01①1.36±0.05①②1 104.000 0.000 p62蛋白0.28±0.06 0.64±0.11①0.95±0.14①②27.120 0.000 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白0.10±0.00 0.50±0.03①0.68±0.08①②80.900 0.000

對照組、10.0 μmol/L DAS 組自噬囊泡分別為（2±1）和（40±8）個，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.758，P=0.037），10.0 μmol/L 組自噬囊泡數(shù)高于對照組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 DAS對U251細胞自噬囊泡影響（醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色）

2.5 DAS調(diào)控AKT/mTOR細胞信號通路

對照組、5.0 μmol/L DAS組、10.0 μmol/L DAS組U251和U87 細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見圖7和表6。

圖7 3組U251和U87細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的表達

表6 3組U251和U87細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量比較 （±s）

表6 3組U251和U87細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/LDAS組比較，P ＜0.05。

組別U251細胞U87細胞對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值p-mTOR/mTOR 0.41±0.03 0.66±0.04①0.90±0.06①②76.280 0.000 p-Akt/Akt 0.47±0.03 0.86±0.01①1.15±0.03①②413.900 0.000 p-mTOR/mTOR 0.71±0.06 0.95±0.05①1.25±0.12①②30.290 0.000 p-Akt/Akt 0.57±0.07 0.91±0.00①1.21±0.05①②112.400 0.000

3 討論

膠質(zhì)瘤是發(fā)生率和病死率均排在首位的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，目前的治療方式雖能提高患者生存率，但總體效果不佳。因此，尋找高效、低毒的新型抗膠質(zhì)瘤化合物是目前膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)，DAS 通過激活A(yù)kt/mTOR 信號通路抑制自噬，進而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

DAS 是防己科蝙蝠葛屬藤本植物蝙蝠葛的干燥根莖，即中藥北豆根的成分之一。近年來隨著DAS抗腫瘤的研究不斷深入，WANG 等[10]發(fā)現(xiàn)DAS 可以通過靶向MEK1/2 激酶抑制食管鱗狀細胞癌的生長。HUANG 等[11]發(fā)現(xiàn)DAS 介導(dǎo)HAKAI 蛋白穩(wěn)定性，抑制膀胱癌的血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。ZHANG等[12]研究表明，DAS可以使RhoA/ROCK2介導(dǎo)的Akt和ERK-p38 MAPK 信號通路失活，抑制肝癌血管生成。但DAS 在膠質(zhì)瘤中的作用和機制不甚明確。本研究發(fā)現(xiàn)隨著DAS 濃度升高，膠質(zhì)瘤細胞增殖受抑制，凋亡率升高，同時促凋亡蛋白Bax 表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，表明DAS 有潛在的抑制膠質(zhì)瘤作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，凋亡與自噬相互調(diào)控、相互影響，抑制自噬會促進細胞凋亡[13-14]。細胞內(nèi)正常水平的自噬對清除細胞中聚集蛋白與受損細胞器至關(guān)重要，自噬功能缺陷會導(dǎo)致受損蛋白與細胞器在細胞內(nèi)過度積累，后者會產(chǎn)生細胞毒性導(dǎo)致細胞凋亡[15]。同時，自噬也是清除胞質(zhì)內(nèi)受損線粒體的主要途徑[16]。抑制自噬導(dǎo)致受損線粒體在胞質(zhì)內(nèi)堆積與ROS 水平上升，促發(fā)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細胞凋亡[17]。ZHANG 等[18]研究表明，異甘草素通過p38/MAPK 軸抑制自噬，促進胰腺癌細胞死亡。重樓皂甙Ⅱ通過mTOR 途徑抑制自噬，誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡[19]。自噬不僅在維持細胞生長發(fā)育中扮演重要角色，同時在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用[20-21]。LC3 是自噬的標志性蛋白，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變或LC3-Ⅱ表達增加都被認為是自噬激活的標志[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，DAS 干預(yù)后膠質(zhì)瘤細胞LC3-Ⅱ表達升高。自噬降解底物蛋白p62 能與LC3結(jié)合選擇性地進入自噬體，通過溶酶體介導(dǎo)的自噬途徑被降解[23]。本研究檢測p62 蛋白表達發(fā)現(xiàn)，DAS處理后膠質(zhì)瘤細胞p62 蛋白表達升高，表明DAS 抑制膠質(zhì)瘤細胞自噬。同時，透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAS組膠質(zhì)瘤細胞自噬囊泡增加，進一步證實DAS 抑制自噬囊泡晚期的降解過程。綜上所述，本研究提示DAS 可能通過抑制自噬，誘導(dǎo)細胞凋亡。

Akt/mTOR 信號通路在心血管疾病[24]、氧化應(yīng)激[25]、腫瘤等[26]多種疾病中發(fā)揮重要的自噬調(diào)節(jié)作用。當(dāng)該通路以磷酸化形式激活時，會抑制自噬的發(fā)生[27]。有研究表明，三七皂苷R1 通過激活A(yù)kt/mTOR 信號通路，調(diào)控缺血心肌脂質(zhì)代謝[28]。蛋白激酶N2 通過抗氧化應(yīng)激和激活mTOR，降低過氧化氫誘導(dǎo)的PC12 細胞損傷和凋亡[29]。m6A 脫甲基酶ALKBH5 介導(dǎo)的DDIT4-AS1 通過激活mTOR，維持胰腺癌細胞干性，降低化療敏感性[30]。以上研究均表明Akt/mTOR 信號通路在自噬中扮演重要角色。同樣本研究發(fā)現(xiàn)DAS 干預(yù)后，膠質(zhì)瘤細胞p-Akt 和pmTOR 蛋白表達顯著升高，提示DAS 抑制自噬的分子機制可能與Akt/mTOR 信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究證實了DAS 對膠質(zhì)瘤的抗腫瘤作用。DAS 抑制膠質(zhì)瘤細胞活力和增殖，并促進其凋亡，其機制可能與DAS 上調(diào)Akt/mTOR 信號通路，抑制自噬有關(guān)。但本研究僅在細胞水平驗證DAS 對膠質(zhì)瘤細胞的作用，在動物模型中是否存在同樣的作用和機制，有待進一步深入研究。