陳世懌，夏柱南，柳 鑫，2，楊 慶，*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.湖北省疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

離子液體(ionic liquids，ILs)是一類由有機(jī)或無機(jī)陽離子(如咪唑或吡啶)和陰離子(如硝酸鹽、醋酸鹽和乳酸鹽)組成的在低溫條件下呈液態(tài)的有機(jī)鹽，通常稱為“室溫離子液體”[1]。ILs 具有可燃性低，蒸氣壓低、熱/化學(xué)穩(wěn)定性好、液體溫度范圍廣以及溶劑化能力高等性能特點(diǎn)[2]。ILs 作為傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的“綠色”替代，可以避免傳統(tǒng)有機(jī)溶劑揮發(fā)帶來的環(huán)境污染以及健康危害等問題，在化工、制藥以及食品工業(yè)領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[1-4]。

隨著ILs 在化工、食品以及醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域的規(guī)?；瘧?yīng)用，ILs 的安全性也逐漸引起廣泛關(guān)注。對(duì)ILs的深入研究發(fā)現(xiàn)ILs 并非完全“綠色安全”，一些ILs甚至對(duì)各種環(huán)境生物產(chǎn)生毒性[5-7]。因此，對(duì)ILs 的毒性評(píng)價(jià)在評(píng)估其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響與應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)方面起著及其重要的作用。目前，對(duì)ILs 毒性方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其性質(zhì)及應(yīng)用研究。咪唑型ILs 是近年來應(yīng)用和研究最為廣泛的一類ILs，其毒性也逐漸引起研究者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有報(bào)道表明，咪唑型ILs 對(duì)生態(tài)環(huán)境、細(xì)胞、哺乳動(dòng)物等均具有一定的毒性作用[8-11]。如咪唑硝酸鹽ILs 對(duì)擬南芥幼苗和小麥的生長有抑制作用，且隨碳鏈長度增加毒性增強(qiáng)[12]。1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl) 可擾亂HepG2 糖原合酶2(glycogen synthase 2，GYS2)和糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，PYGL)的表達(dá)，引起細(xì)胞糖代謝的紊亂[13]。四氟硼酸化-1-十四烷基-3-甲基咪唑鹽([C14mim]BF4)急性和慢性暴露，均導(dǎo)致大鼠肝臟損傷[14-15]。

咪唑型ILs 是近年來應(yīng)用和研究最為廣泛的一類ILs，其毒性也逐漸引起研究者的廣泛關(guān)注，但多為研究急性染毒對(duì)生物體的影響。而咪唑型ILs 亞急性染毒對(duì)生物體，尤其是哺乳動(dòng)物的毒性研究仍較為缺乏。因此，本研究通過對(duì)小鼠體質(zhì)量變化、臟器系數(shù)、血清生化指標(biāo)以及組織病理學(xué)改變等的分析，探討1-庚基-3-甲基咪唑氯鹽(1-heptyl-3-methylimidazolium chloride，C7[MIM]Cl)亞急性染毒對(duì)小鼠的毒性作用，以期為評(píng)價(jià)咪唑型ILs的毒性作用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

AL204 電子天平(精度0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器/上海有限公司)；電子秤(精度0.01 g，上海力衡公司)；Advia 2120i 型全自動(dòng)生化分析儀(西門子診斷公司，美國)；Centrifuge 5420型冷凍離心機(jī)(Eppendorf股份公司，德國)；IX53 型顯微鏡(奧林巴斯科學(xué)事業(yè)公司，日本)；HistoCore BIOCUTR型切片機(jī)和ASP300S型脫水機(jī)均購于德國徠卡微系統(tǒng)有限公司。

1-庚基-3-甲基咪唑氯鹽(C7[MIM]Cl，純度＞98.0%，中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所)；血常規(guī)試劑(拜耳，德國)；無水乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明小鼠(雌性，6～8 周，25～27 g) 24 只，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2020-0018。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房內(nèi)，動(dòng)物房溫度(20±3)℃，相對(duì)濕度55%，自然光照，飲食和進(jìn)水自由。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展均獲得武漢輕工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)202211001)。

1.3 動(dòng)物暴露模型建立

依據(jù)本課題組前期研究，C7[MIM]Cl經(jīng)口暴露對(duì)昆明小鼠的半致死劑量(median lethal dose，LD50)為119 mg/kg[16]。本研究中，小鼠C7[MIM]Cl 亞急性暴露設(shè)置為低(1/50 LD50，2.38 mg/kg)、中(1/20 LD50，5.95 mg/kg)和高(1/10 LD50，11.9 mg/kg)共3個(gè)劑量組。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分為對(duì)照組，C7[MIM]Cl 低、中、高劑量組，每組6 只，每天灌胃1 次，連續(xù)28 d，對(duì)照組灌胃給予等體積的生理鹽水。進(jìn)行為期28 d的小鼠亞急性C7[MIM]Cl暴露實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠攝食量和體質(zhì)量增長情況監(jiān)測

記錄小鼠的初始體質(zhì)量，每4 d 稱量小鼠體質(zhì)量，至第28天。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測

第28 天采集小鼠眼眶血樣0.2 mL，在4 ℃以4 000 r/min離心10 min，取血清，全自動(dòng)生化分析儀測定小鼠血清10 個(gè)指標(biāo)，分別為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase， AST)、 堿 性 磷 酸 酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、血 尿 素(blood urea，BUN)、肌 酐(creatinine，CREA)、尿酸(uric acid，UA)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和血糖(glucose，GLU)，這些指標(biāo)與小鼠肝臟、腎臟和心血管功能及小鼠的營養(yǎng)狀況密切相關(guān)。

1.6 臟器指數(shù)統(tǒng)計(jì)及病變觀察

實(shí)驗(yàn)期末將小鼠頸椎脫臼處死，取心、肝、脾、肺、腎和卵巢，稱取臟器質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。小鼠臟器系數(shù)是臟器的質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，能夠初步反映小鼠整體的健康狀態(tài)。隨后，臟器組織用4%的多聚甲醛固定，乙醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片。HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠攝食量和體質(zhì)量變化情況

經(jīng)C7[MIM]Cl 亞急性暴露28 d 后，對(duì)照組小鼠狀態(tài)無異常，不同劑量C7[MIM]Cl 暴露組灌胃當(dāng)日部分小鼠活動(dòng)減少。在持續(xù)灌胃28 d 過程中，高劑量組(11.9 mg/kg)有2 只小鼠在第8 天給藥后出現(xiàn)呼吸急促，持續(xù)2 h 后死亡。剩余小鼠直至觀察期結(jié)束，均存活。小鼠初始體質(zhì)量為25～27 g，記錄小鼠4、8、12、16、20、24 和26 d 的飼料平均消耗量(因?qū)嶒?yàn)結(jié)束前12 h 對(duì)小鼠禁食，故飼料消耗量僅統(tǒng)計(jì)到第26天)和體質(zhì)量。與對(duì)照組相比，2.38 mg/kg組1～26 d飼料的平均消耗量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，5.95 mg/kg組飼料的平均消耗低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1，各組小鼠體質(zhì)量在0～28 d 增加，C7[MIM]Cl 處理的3 個(gè)劑量組體質(zhì)量增量均低于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表1 小鼠C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d的飼料消耗量 g，n=6

表2 小鼠C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的變化g，±s，n=6

表2 小鼠C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的變化g，±s，n=6

時(shí)間/d 0 4 8 12 16 20 24 28體質(zhì)量增量對(duì)照組25.00±1.27 27.14±0.97 27.15±1.05 27.7±1.53 28.29±1.87 28.50±1.90 28.53±2.04 29.12±2.01 4.12±0.98 2.38 mg/kg組26.07±0.59 26.77±0.47 27.03±0.41 27.86±0.78 28.83±0.84 29.22±0.77 30.08±1.24 29.74±0.92 3.04±0.65 5.95 mg/kg組25.03±0.99 25.60±0.47 26.26±0.75 26.63±0.85 27.14±0.85 28.12±0.89 28.06±0.62 28.69±0.64 3.65 ±0.51 11.9 mg/kg組25.02±0.96 26.40±1.01 26.95±0.9 26.52±1.21 27.23±0.82 28.05±1.46 28.47±1.28 28.67±1.46 3.22 ±0.66

2.2 C7[MIM]Cl 亞急性暴露對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

小鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表3。與對(duì)照組相比，C7[MIM]Cl 2.38 mg/kg 組小鼠ALT 水平顯著升高，而BUN、TBIL 和UA 水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)；5.95 mg/kg 組小鼠血清TBIL、UA、TG和TC水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)；11.9 mg/kg 組TG、TC 和Glu 水平均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。這些結(jié)果表明，C7[MIM]Cl的亞急性暴露對(duì)小鼠的肝臟和腎臟功能產(chǎn)生了顯著影響，且不同暴露劑量對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響具有明顯的差異。

表3 C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d后對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響 ±s，n=6

表3 C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d后對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響 ±s，n=6

ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase)；AST：天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase)；ALP：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)；TBIL：總膽紅素(total bilirubin)；BUN：血尿素(blood urea)；CREA：肌酐(creatinine)；UA：尿酸(uric acid)；TG：甘油三酯(triglyceride)；TC：總膽固醇(total cholesterol)和GLU血糖(glucose).與對(duì)照組比較，*P＜0.05; **P＜0.01.

指標(biāo)ALT/(U/L)AST/(U/L)ALP/(U/L)TBIL/(mmol/L)BUN/(mmol/L)CREA/(mmol/L)UA/(mmol/L)TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)GLU/(mmol/L)對(duì)照組42.51±6.57 157.05±34.78 116.33±37.21 12.96±3.53 6.06±0.78 23.67±4.93 158.71±38.01 1.21±0.25 3.39±0.50 7.19±0.36 2.38 mg/kg組61.23±19.64*170.16±52.35 106.39±13.75 7.99±1.68*5.06±1.00*23.18±4.56 115.75±26.43*1.01±0.12 3.21±0.28 7.30±1.07 5.95 mg/kg組40.39±7.62 155.23±43.07 141.44±45.67 8.23±1.24*4.98±0.72 20.98±2.99 96.69±33.18*0.93±0.12*2.82±0.32*7.41±0.96 11.9 mg/kg組42.63±3.92 202.01±95.07 113.21±21.59 10.84±2.85 5.15±0.58 20.26±7.93 100.69±62.56 0.91±0.03*2.46±0.47*6.17±0.57**

2.3 小鼠臟器系數(shù)變化

C7[MIM]Cl經(jīng)灌胃暴露28 d，各劑量組小鼠的臟器系數(shù)如圖1所示。與對(duì)照組相比，各劑量暴露組小鼠的心臟、肝、脾和肺的臟器系數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而2.38 mg/kg C7[MIM]Cl暴露組小鼠的腎臟系數(shù)顯著升高，卵巢系數(shù)顯著降低(P＜0.05)。該結(jié)果表明，C7[MIM]Cl亞急性暴露對(duì)小鼠腎臟和卵巢有較大影響。

圖1 C7[MIM]Cl亞急性暴露小鼠的臟器系數(shù)

2.4 C7[MIM]Cl 亞急性暴露對(duì)小鼠主要臟器組織形態(tài)的影響

取各組小鼠的肝、脾、肺、腎及卵巢進(jìn)行組織切片染色，觀察C7[MIM]Cl 亞急性暴露對(duì)小鼠組織形態(tài)的影響。結(jié)果如圖2 所示，對(duì)照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞排列整齊，未見細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞浸潤，組織充血以及組織壞死等病理現(xiàn)象。C7[MIM]Cl暴露組小鼠的肝組織出現(xiàn)了不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，充血的病理現(xiàn)象。其中，2.38 mg/kg 組有少量炎性細(xì)胞浸潤，5.95 mg/kg 組出現(xiàn)少量充血，而11.9 mg/kg 組出現(xiàn)嚴(yán)重的充血。脾臟組織切片結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠脾臟白髓形狀規(guī)則，細(xì)胞排列規(guī)則。C7[MIM]Cl暴露后，脾臟結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞排列松散，且隨著劑量的升高，病理現(xiàn)象更為明顯。肺組織切片結(jié)果表明對(duì)照組小鼠肺組織的肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整，肺泡隔和肺支氣管結(jié)構(gòu)正常。C7[MIM]Cl暴露小鼠肺組織出現(xiàn)充血，部分肺泡融合以及炎性細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象。并且隨著暴露劑量的增加，肺組織病理性損傷更加嚴(yán)重。腎臟HE 染色結(jié)果表明對(duì)照組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎小管細(xì)胞排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。C7[MIM]Cl暴露組小鼠腎臟組織間出現(xiàn)明顯淤血性腫脹，炎性細(xì)胞浸潤，腎小囊間隙狹窄等病理損傷，隨著暴露劑量的增加，腎臟病理特征愈發(fā)嚴(yán)重。對(duì)照組小鼠卵巢組織中卵泡及卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞清晰可見，顆粒細(xì)胞排列規(guī)律。C7[MIM]Cl暴露后，小鼠卵巢組織腫脹，卵泡呈囊性擴(kuò)張，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞形態(tài)模糊或消失。

圖2 C7[MIM]Cl亞急性經(jīng)口暴露對(duì)小鼠臟器組織的影響

3 討 論

越來越多研究報(bào)道表明ILs 對(duì)生態(tài)環(huán)境、細(xì)胞和哺乳動(dòng)物均存在一定的毒性，且隨著側(cè)鏈長度和濃度的增加，毒性增大[17-18]。ILs具有較好的抗菌活性，通過抑制細(xì)菌的增殖破壞生態(tài)環(huán)境中微生物系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的維持。并且，生態(tài)環(huán)境中ILs 的暴露，對(duì)藻類、高等植物、無脊椎和水生脊椎動(dòng)物的生長也有顯著影響。如離子液體可破壞藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞各種功能，從而抑制斜生柵藻、小球藻和羊角月牙藻等藻類的繁殖[5]；水稻和小麥在種植過程中，遭受離子液體污染后，其幼苗的生長也會(huì)被抑制，并且遭受氧化應(yīng)激損傷[19]；在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)離子液體暴露可能對(duì)小鼠具有腎、肝以及生殖毒性。此外，ILs的大量使用帶來的環(huán)境污染，增加了ILs 通過飲用水或食物鏈暴露于人群的風(fēng)險(xiǎn)，給人類健康帶來威脅[6]。因此，ILs毒性的研究可為其科學(xué)管理及更好地應(yīng)用提供重要的毒理學(xué)數(shù)據(jù)參考與理論支持。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的C7[MIM]Cl 亞急性經(jīng)口暴露28 d 后可引起小鼠的肝、脾、肺、腎和卵巢一定程度的損傷，且不同暴露劑量的毒性表現(xiàn)有所不同。其中血清生化指標(biāo)和組織病理切片染色結(jié)果表明C7[MIM]Cl 的亞急性暴露對(duì)小鼠肝功能和腎功能的影響更為顯著。

肝臟是機(jī)體的主要解毒器官，可將親脂性有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為水溶性代謝產(chǎn)物，隨尿液從體內(nèi)排出，從而有效避免有毒物質(zhì)的體內(nèi)蓄積對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害[20-21]。正常生理?xiàng)l件下，動(dòng)物血清的轉(zhuǎn)氨酶、ALP、TG 和TC在一定的范圍內(nèi)，這些指標(biāo)的異常波動(dòng)與肝臟的代謝、功能及機(jī)體的營養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)[20，22]。血清中轉(zhuǎn)氨酶活性升高，表明肝細(xì)胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶從肝組織釋放到血液[23]。ILs 慢性和急性暴露，均被報(bào)道能引起肝、腎等臟器的損傷，導(dǎo)致血清中氨基轉(zhuǎn)移酶、ALP以及TBIL 等生化指標(biāo)的上升[14，24-25]。本實(shí)驗(yàn)中，2.38 mg/kg C7[MIM]Cl 暴露28 d 后，小鼠血清ALT 水平顯著高于對(duì)照組；5.95 mg/kg 組血清ALT、AST 水平無顯著變化；11.9 mg/kg 組AST 水平上升，但由于組內(nèi)差異較大，所以與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理結(jié)果顯示C7[MIM]Cl 暴露的小鼠肝組織出現(xiàn)了不同程度充血性腫脹、組織細(xì)胞壞死和炎癥性病變等，且暴露劑量越大，損傷程度越明顯。后續(xù)試驗(yàn)中，需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)暴露濃度，以探明C7[MIM]Cl 亞急性暴露引起肝臟損傷的劑量-毒性規(guī)律。此外，TG，TC 和TBIL 作為肝臟脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)，其升高與心血管疾病、甲狀腺功能低下以及糖尿病等密切相關(guān)[26]；其降低則與營養(yǎng)不良、甲狀腺功能亢進(jìn)和腫瘤等的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[27]。本實(shí)驗(yàn)中，5.95 mg/kg和11.9 mg/kg C7[MIM]Cl染毒組小鼠血清的TG、TC和TBIL 水平均顯著低于對(duì)照組。11.9 mg/kg 染毒組小鼠的GLU水平也顯著低于對(duì)照組。而在飼料消耗上，染毒組小鼠平均消耗量低于對(duì)照組。這些結(jié)果揭示C7[MIM]Cl亞急性暴露可通過抑制小鼠的進(jìn)食，影響小鼠的食物攝入，進(jìn)而影響小鼠的營養(yǎng)狀態(tài)。

腎臟是毒性物質(zhì)代謝和排泄的重要器官，極易受到毒性物質(zhì)的攻擊，因此成為毒性物質(zhì)毒理學(xué)評(píng)價(jià)中備受關(guān)注的器官[28-29]。BUN、CREA 和UA 的水平與腎臟功能密切相關(guān)，這些指標(biāo)的升高與腎臟損傷性病變密相關(guān)[30]。本實(shí)驗(yàn)中，表征腎臟功能的血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示，C7[MIM]Cl 亞急性暴露導(dǎo)致小鼠UA 和BUN水平低于對(duì)照組。該結(jié)果表明腎臟是C7[MIM]Cl 亞急性暴露重要的靶器官。

隨著離子液體的廣泛使用，不可避免地造成了其環(huán)境排放和在食物鏈及食品中的遷移，因此離子液體安全性成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。而烷基咪唑型ILs亞急性染毒對(duì)生物體，尤其是哺乳動(dòng)物的毒性研究仍較為缺乏。本研究通過C7[MIM]Cl 灌胃染毒昆明小鼠28 d，觀察到各劑量組小鼠肝、脾、肺、腎、卵巢均出現(xiàn)一定程度的損傷，其中肝臟和腎臟的損傷最為明顯。血清生化指標(biāo)以及病理觀察僅表明C7[MIM]Cl 具有亞急性毒性，但其劑量-毒性規(guī)律以及毒性機(jī)制尚不明確。因此，在后續(xù)研究中，需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步解析C7[MIM]Cl 的毒性量效關(guān)系，并結(jié)合分子實(shí)驗(yàn)闡明毒性機(jī)制。