許金花，李靜靜，吳國峰，任亞俊，王 雪，張騫云，*

(1.滄州市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學二科，河北 滄州 061014；2.滄州市中心醫(yī)院麻醉二科，河北 滄州 061014)

肺癌死亡率在所有腫瘤中居第1 位，據(jù)GLOBOCAN 估計，2020 年全球新發(fā)的肺癌病例約220萬，占全部惡性腫瘤的11.4%[1-2]。非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%[3]。以順鉑聯(lián)合多西他賽為主的化療方案能夠有效抑制腫瘤，但會產(chǎn)生嚴重毒副作用[4]。目前NSCLC的5年生存率低于20%[5]。近年來，肺癌患者的個體化治療研究越來越深入，識別預測NSCLC患者預后的因素將很大程度上有助于評估預后分層及制定個體化治療方案，從而提高生存率。因此，需要找到能預測NSCLC 預后的指標。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)屬于多肽超家族，能夠影響細胞增殖，與炎癥反應相關(guān)[6]。調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells，Treg)是新發(fā)現(xiàn)的T 細胞亞群，能夠維持機體免疫功能穩(wěn)定[7]。TNF-α和Treg 與NSCLC 的病情嚴重程度密切相關(guān)，但是二者對患者預后判斷的價值尚未深入研究。近年來發(fā)現(xiàn)，miR-146a參與炎癥反應，對肺炎、膿毒癥等疾病有較好的預測價值[8-9]，但其與NSCLC 的預后報道較少。本研究擬探討血清中miR-146a 水平對NSCLC 患者預后判斷的價值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 患者資料

選擇2020年6月—2021年11月在滄州市中心醫(yī)院住院治療的晚期NSCLC 患者162例，所有患者均簽署知情同意書。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準[2020-204-02(Z)]。病例納入標準：①符合NSCLC 的診斷標準，經(jīng)病理確診；②臨床分期為IIIa、IIIb或IV期；③估計生存時間大于6個月；④卡氏評分(KPS)大于60 分。病例排除標準：①具有嚴重的心、肺、肝、腎等功能障礙；②腫瘤腦轉(zhuǎn)移；③有艾滋病、活動性肺結(jié)核等傳染??；④存在嚴重感染性疾?。虎荽嬖诰耦惣膊?；⑥存在其他惡性腫瘤。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑miRNA提取分離試劑盒購自凱杰生物工程(深圳)有限公司，miRNA的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，miRNA熒光定量檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司，miR-146a引物購自上海生物工程公司，TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司

1.2.2 儀器實時熒光定量PCR 儀購自Applied Biosystems 公司，F(xiàn)ACB Canto II 流式細胞儀購自BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 miR-146a 相對表達水平檢測所有受試者化療前和2 周期化療結(jié)束后均抽取空腹靜脈血3 mL，3 000 g 離心10 min，取上層血清。采用miRNA 提取分離試劑盒提取血清中miRNA，采用miRNA 的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系，將配置好的體系放入實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應程序為：95 ℃加熱1 min，進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃加熱5 min 充分反應。miR-146a 的引物序列如下：miR-146a 正向5'-ATCGCCTCTAGAAGTCG TCAGG-3'，反向5'-TCAGGCTACTGAAGGCTAG-3'；內(nèi)參采用U6基因，正向5'-GACTGATGCTCTGGCC GA-3'，反向5'-GTCGGGTCGAAGCATGG-3'。采用2-ΔΔCT法計算miR-146a的相對表達水平。

1.3.2 TNF-α濃度檢測血清收集同1.3.1。采用酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測。準備酶標板，每孔分別滴加25 μL患者血清和標準品，37 ℃孵育15 min，再滴加100 μL 酶底物，反應20 min，加入顯色液，避光15 min，最后滴加終止液。將酶標板放入酶標儀中，采用450 nm波長檢測溶液吸光度，計算TNF-α濃度。

1.3.3 Treg細胞比例檢測采集患者化療前和2周期化療結(jié)束后靜脈血3 mL于EDTA抗凝管中，搖勻，加入流式試管中，與單克隆抗體充分混勻，孵育10 min，滴加紅細胞裂解液500 μL，混勻，再滴加5 mL的PBS 緩沖液，3 000 g 離心5 min，小心倒掉上清，滴加300 μL 的PBS 重懸細胞，采用流式細胞儀檢測Treg細胞，使用FACS DIVA軟件分析Treg細胞比例。

1.3.4 隨訪治療結(jié)束后每3 個月隨訪1 次，采用門診、電話、網(wǎng)絡通信等方式進行隨訪，共隨訪1 年，記錄患者生存情況，包括是否死亡及具體死亡時間。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料若符合正態(tài)分布，用±s表示。組間比較，采用t檢驗。若不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位間距表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)(%)表示，采用χ2檢驗。采用Pearson 方法分析相關(guān)性，并計算相關(guān)系數(shù)r。采用多因素logistic 回歸進行預后分析，應用逐步回歸法篩選獨立危險因素，并計算比值比(odds ratio，OR)及95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線計算曲線下面積(area under curve，AUC)，根據(jù)約登指數(shù)找出最佳臨界值。檢驗水準取雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 miR-146a、TNF-α水平和Treg細胞比例的檢測結(jié)果

采用實時熒光定量PCR法檢測NSCLC患者血清中的miR-146a 相對表達水平為(1.48±0.18)，采用酶聯(lián)免疫法檢測NSCLC患者血清中TNF-α濃度為(29.46±4.19)μg/L，采用流式細胞術(shù)檢測NSCLC患者的Treg細胞比例為(4.03±0.85)%。

2.2 miR-146a 相對表達水平與TNF-α濃度、Treg細胞比例的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相 關(guān) 分 析， 得 出NSCLC 患 者 的miR-146a 相對表達水平與TNF-α濃度呈正相關(guān)(r=0.651；P＜0.01，圖1A)，與Treg 細胞比例呈負相關(guān)(r=-0.676；P＜0.01，圖1B)。

圖1 miR-146a相對表達水平與TNF-α濃度、Treg細胞比例的相關(guān)性

2.3 miR-146a、TNF-α水平及Treg細胞比例對患者死亡的多因素logistic回歸分析結(jié)果

隨訪1 年后統(tǒng)計，miR-146a 低表達組在隨訪1 年內(nèi)死亡17人，miR-146a高表達組在隨訪1年內(nèi)死亡35人。TNF-α低濃度組在隨訪1 年內(nèi)死亡22 人，TNF-α高濃度組在隨訪1年內(nèi)死亡30人。Treg 細胞低比例組在隨訪1 年內(nèi)死亡33 人，Treg 細胞高比例組在隨訪1年內(nèi)死亡19人。我們采用多因素logistic回歸分析，納入miR-146a相對表達水平、TNF-α濃度和Treg細胞比例3 個變量進入logistic 模型，結(jié)果如圖2 所示，miR-146a相對表達水平和TNF-α濃度為NSCLC患者死亡的危險因素(OR=1.95、1.39；P＜0.01)。Treg 細胞比例為NSCLC患者死亡的保護因素(OR=0.53；P＜0.01)。

圖2 NSCLC患者死亡的多因素logistic回歸分析

2.4 miR-146a、TNF-α 水 平 及Treg 細 胞 比 例 的ROC曲線分析

如圖3 所示，我們通過ROC 曲線分析得出，miR-146a 相對表達水平的最佳閾值為1.239，此時敏感度為95.7%，特異度為92.6%，約登指數(shù)為0.883，AUC 為0.959， 95%CI為(0.934， 0.985)，P＜0.01。TNF-α濃度的最佳閾值為27.734 μg/L，此時敏感度為55.4%，特異度為87.0%，約登指數(shù)為0.424，AUC 為0.761，95%CI為(0.694，0.828)，P＜0.01。Treg 細胞比例的最佳閾值為5.159%，此時敏感度為65.7%，特異度為80.4%，約登指數(shù)為0.461，AUC為0.778，95%CI為(0.713，0.844)，P＜0.01。

圖3 miR-146a 相對表達水平、TNF-α 濃度和Treg 細胞比例對NSCLC患者預后的ROC曲線分析

3 討 論

肺癌病死率位于所有惡性腫瘤之首，NSCLC是肺癌最常見的一種類型[10]。導致NSCLC 發(fā)病的因素較多，如大氣污染、遺傳因素、肺部慢性炎癥、電離輻射、環(huán)境接觸、職業(yè)暴露、吸煙等，會導致細胞惡變，最終引發(fā)肺癌[11]。以順鉑聯(lián)合多西他賽為主的化學療法仍是當下的主要治療手段[10]。但是化療藥物存在劑量限制性，有毒副作用，腫瘤細胞易產(chǎn)生耐藥性，這些因素均限制了化療的療效[12]。目前，NSCLC的5年生存率仍只有19.7%[5]。因此需要找到能提示預后的指標，從而及早優(yōu)化治療方案，提高生存率。

TNF-α屬于一種蛋白超家族成員，其通過聚集成受體復合物發(fā)揮作用，通過絲裂原活化蛋白激酶進行信號轉(zhuǎn)導，通常情況下TNF-α的活性受抑制，當體內(nèi)有活性氧、整合素等物質(zhì)產(chǎn)生時就會激活并釋放[13]。此時TNF-α被細胞膜表面受體識別并結(jié)合，將信號轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)，影響細胞增殖、分化和遷移，誘導產(chǎn)生多種炎癥因子，如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)和多種趨化因子等，同時活化中性粒細胞，促進血管生成，還可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，促進炎癥發(fā)生[14]。本研究結(jié)果表明，TNF-α濃度為NSCLC患者死亡的危險因素，當TNF-α濃度升高時，會促進炎癥反應發(fā)生，從而加快腫瘤的進展，提高NSCLC患者的死亡率。

Treg 細胞是T 細胞亞群的一種，具有負向調(diào)控免疫功能的作用，可以介導輔助性T 細胞的漂移，同時能夠分泌白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)和TNF-α等因子，維持機體免疫功能的穩(wěn)定，Treg 異常是導致促炎-抗炎失調(diào)的重要原因，當Th17 正常時，TNF-α會誘導輔助性T0細胞分化為Treg細胞，通過自身免疫耐受機制，維持機體的免疫穩(wěn)定，但是當Treg異常減少時，會引起免疫功能紊亂，使得促炎-抗炎平衡被打破，加速IL-17 的釋放，信號經(jīng)由免疫級聯(lián)效應放大，促進炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展[15]。本研究結(jié)果表明，Treg 細胞比例為NSCLC 患者死亡的保護因素，當Treg細胞比例升高時，會增強機體免疫功能，從而抑制腫瘤進展，降低NSCLC患者的死亡率。

近年來發(fā)現(xiàn)，許多miRNA 均廣泛參與炎癥反應，其表達水平與感染的嚴重程度和預后有關(guān)，其中miR-146a在肺炎、膿毒癥等炎癥性疾病都有很好的預后價值[8-9]，但是對于NSCLC的預后作用報道較少。本研究結(jié)果表明，多因素logistic 回歸分析顯示，miR-146a 相對表達水平是NSCLC 患者死亡的危險因素，miR-146a水平升高會促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，提高死亡率，且miR-146a 相對表達水平與TNF-α呈正相關(guān)，與Treg 呈負相關(guān)；ROC 曲線分析顯示，當miR-146a 相對表達水平≥1.239 時，預示NSCLC 患者有較高的死亡風險。以上結(jié)果提示，miR-146a水平越高，患者的預后越差，水平越低則患者預后越好，其預測準確率明顯高于TNF-α和Treg，表明miR-146a對于NSCLC 具有很好的預后價值。蒙振發(fā)等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-146a 通過上調(diào)TLR4/NF-κB 信號通路，促進炎性細胞增殖，提高TNF-α等炎癥因子水平，引起胰腺組織的炎癥損傷。謝平安等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過抑制Treg細胞的增殖，導致Th17/Treg細胞比例失衡，引發(fā)促炎-抗炎機制紊亂，從而加重炎癥反應。這與我們的研究結(jié)果一致。除了與TNF-α、Treg 細胞相互作用，miR-146a也存在其他促炎機制。周燕[18]的研究表明，miR-146a 能夠增加細胞間黏附分子-1 的表達，導致急性呼吸窘迫綜合征患者炎癥加重，預后不良。王宏偉等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過上調(diào)TNF-α水平，激活炎癥通路，促進了銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌感染，導致呼吸機相關(guān)肺炎加重。然而，也有少數(shù)研究認為miR-146a 可能抑制炎癥。樊豐夷等[20]的研究表明，miR-146a水平上升可降低抑制急性痛風性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NALP3 的激活，從而抑制炎癥，與我們的結(jié)果存在爭議，原因可能是由于采用的agomiR-146a 和antagomiR-146a 未做激活和抑制效率驗證，使得miRNA水平可能存在過表達或抑制不充分的情況；另一種可能是由于痛風和NSCLC疾病間分子機制的差異導致。

本研究通過相關(guān)分析表明了miR-146a與多種炎癥和免疫指標的相關(guān)性強度，采用多因素logistic回歸分析得出miR-146a 對NSCLC 患者的預后判斷價值，通過ROC 曲線得到miR-146a 的預測效能。本研究的局限在于僅研究了患者是否死亡這一個預后因素，在以后的研究中，可以考慮對患者進行長期隨訪，采用生存分析研究miR-146a的遠期預后價值。

綜上所述，miR-146a 在NSCLC 中的相對表達水平與TNF-α濃度呈正相關(guān)，與Treg 細胞比例呈負相關(guān)，是NSCLC患者死亡的危險因素，對NSCLC預后有很好的預測價值。