鄭雅琪，趙子婷，潘德淵，劉祿鑫，許秀娥，廖連娣，王少洪，李恩民，*，許麗艷，*

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣東 汕頭515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041；3.汕頭市中心醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515041)

食管癌的發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中排名均位于前10位[1-3]。食管癌是由食管黏膜上皮或腺體發(fā)生的惡性腫瘤，主要分為食管腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinomar，ESCC)兩種組織學(xué)類型，其中食管鱗癌是主要亞型，ESCC 占我國食管癌病例的90%以上[4-6]。tonsoku 樣DNA 修復(fù)蛋白(tonsoku-like DNA repair protein，TONSL)最初因其蛋白產(chǎn)物與NF-κB抑制劑蛋白極相似，而得名為NF-κB抑制劑樣蛋白2(NF-κB inhibitor-like 2，NF-κBIL2)[7]，但后來有研究者發(fā)現(xiàn)TONSL 并非IκB 家族成員，而是擬南芥TONSOKU 的人類同源基因，并且在植物中可通過控制染色質(zhì)重塑防止DNA損傷[8-12]。TCGA數(shù)據(jù)庫的泛癌基因組數(shù)據(jù)顯示TONSL在卵巢癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤的拷貝數(shù)增加，最高達(dá)42%[13]。另有文獻(xiàn)報道其在肝癌和肺癌中高表達(dá)，在肺癌中，敲降TONSL 的相互作用蛋白(MMS22-like DNA repair protein，MMS22L)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖，但其在食管鱗癌細(xì)胞中的功能及其作用機(jī)制尚不清楚[14-15]。基于此，本研究利用食管癌基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，分析在食管癌中TONSL的表達(dá)特征，接著利用食管鱗癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)驗證，然后通過集落形成實驗和EdU實驗探索TONSL對食管鱗癌細(xì)胞增殖和DNA 復(fù)制的影響，并通過Western blot 實驗研究其參與食管鱗癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 食管癌組織樣本檢測

1.1.1 組織樣本收集2017 年于廣東省汕頭市中心醫(yī)院就診的食管鱗癌患者的手術(shù)切除組織20 例(包含相應(yīng)癌旁組織)，所有患者均在術(shù)后病理診斷為食管鱗癌，未對年齡或性別進(jìn)行限制。組織樣本常規(guī)福爾馬林固定并石蠟包埋，所有標(biāo)本均為臨床診斷后的殘余組織，患者均簽署了單獨的知情同意書，用于取樣和分子分析。臨床樣本的采集獲得了汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會(2016-026)的批準(zhǔn)。

1.1.2 免疫組織化學(xué)檢測石蠟包埋組織被切成3 μm 厚的完整切片。將載玻片脫蠟、水化后浸入Tris-EDTA(pH=9)修復(fù)液中，高溫高壓修復(fù)即120 ℃下加熱4 min，室溫冷卻30 min。接著蒸餾水浸洗后在3%過氧化氫溶液中浸泡10 min 消除內(nèi)源性過氧化物酶，TBST 浸洗后加入一抗4 ℃過夜孵育，一抗為TONSL 抗體(Sigma，HPA 046494)，稀釋比為1∶500。TBST 浸洗后再使用DAB 染色液(鼠/兔)(MXB Biotechnologies，KIT-5930)二抗顯色系統(tǒng)進(jìn)行免疫染色，最后使用蘇木素復(fù)染-脫水透明-中性樹膠封片。未加一抗的玻片作為陰性對照。

1.1.3 免疫組織化學(xué)的評分標(biāo)準(zhǔn)TONSL蛋白的表達(dá)根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比和細(xì)胞質(zhì)染色強度進(jìn)行半定量評分[16]。陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比如下：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%記0 分，≥5%～25%記1 分，≥25%～50%記2分，≥50%～75%記3分，≥75%記4分。細(xì)胞質(zhì)/核染色強度分類如下：無著色記0 分，淺黃色記1 分，黃色記2 分，棕色記3 分。然后將兩項得分相乘，以獲得每個病例標(biāo)本的評分(IHC score)。因此，免疫組織化學(xué)評分范圍為0～12分。TONSL在正常食管上皮中的表達(dá)具有明顯的層次特征，考慮到基底細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞均具有分裂增殖能力，食管鱗癌起源于基底細(xì)胞，因此以基底細(xì)胞層的評分作為對正常食管上皮的評分。

1.2 食管鱗癌細(xì)胞系檢測

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與小干擾RNA 轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30 和KYSE510 分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Life Technologies，USA)的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Hieff TransTMin vitrosiRNA/miRNA Transfection Reagent(Yeasen，40806ES03)進(jìn)行小干擾RNA(蘇州吉瑪生物)轉(zhuǎn)染。按照試劑盒說明書操作，在細(xì)胞匯合度為30%～50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用的小干擾RNA 序列為：si-TONSL-1，5'-GCCCUGUGCAACGA UUACUTT-3'；si-TONSL-2，5'-CCAUGAGGAAGCG GUUCAUTT-3'；陰性對照(si-NC，轉(zhuǎn)染無敲降靶基因的siRNA)，5'-UCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。

1.2.2 Western blot 實驗食管鱗癌細(xì)胞在小干擾RNA轉(zhuǎn)染48 h后，加入Laemmli 緩沖液(Bio-Rad)裂解細(xì)胞提取總蛋白，95 ℃變性15 min 以制備各組細(xì)胞蛋白樣品。蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，轉(zhuǎn)移至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜)，而后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h[2]。隨后使用TBST 緩沖液洗凈，加入一抗4 ℃孵育過夜，一抗包括檢查點激酶2(checkpoint kinase 2，CHK2，Proteintech 公 司，1∶200 稀釋)、pCHK2(Proteintech 公司，1∶1 000 稀釋)、ATM 絲 氨 酸/蘇 氨 酸 激 酶(ATM serine/threonine kinase，ATM，GeneTex 公司，1∶200 稀釋)、pATM(Cell SignalingTechnology 公 司，1∶1 000)、Vinculin(Proteintech 公 司， 1∶10 000 稀 釋)、 GAPDH(Proteintech 公司，1∶5 000 稀 釋)和TONSL(Sigma 公司，1∶1 000 稀釋)。PVDF 膜經(jīng)TBST 緩沖液洗滌后，在室溫下用HRP 偶聯(lián)的二抗孵育2 h，包括鼠二抗(Santa Cruz 公司，1∶10 000 稀釋)或兔二抗(Cell Signaling Technology 公 司，1∶3 000 稀 釋)，使 用TBST緩沖液洗膜后，覆蓋化學(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz公司)，然后使用成像系統(tǒng)拍照(e-Blot，上海)，利用ImageJ軟件測定不同條帶灰度值。

1.2.3 集落形成實驗食管鱗癌細(xì)胞在小干擾RNA轉(zhuǎn)染36 h 后，使用胰蛋白酶(Life Tech 公司)消化后收集至滅菌離心管中。按照每孔500個細(xì)胞接種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)6～10 d。使用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞后，加入4%多聚甲醛固定15 min，而后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，自來水洗凈。使用ChemiDocTMMP 成像系統(tǒng)(Bio-Rad)對細(xì)胞集落進(jìn)行拍照，利用ImageJ軟件計算每孔的集落數(shù)量。

1.2.4 EdU 實驗使用BeyoClickTMEdU-488 細(xì)胞增殖檢測試劑盒(碧云天)，按照說明書進(jìn)行操作。將食管鱗癌細(xì)胞用小干擾RNA 轉(zhuǎn)染36 h 后消化收集至滅菌離心管中，而后以每孔5 000 個細(xì)胞的密度接種至96 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后加入37 ℃預(yù)熱的EdU工作液，以10 μmol/L終濃度繼續(xù)培養(yǎng)孵育2 h。4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS緩沖液沖洗3 次后，用0.1%的Triton X-100 通透10 min，用PBS 沖洗3 次。此后，每孔加入100 μL 的Click 反應(yīng)液室溫避光孵育30 min，PBS沖洗3次后用5 μg/mL的Hoechst 33342 室 溫 避 光 孵 育10 min。 使 用Lionheart FXLFX(BioTek，USA)采集圖像并對EdU 陽性細(xì)胞占比進(jìn)行計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計學(xué)分析

各食管癌研究隊列中TONSL拷貝數(shù)擴(kuò)增頻率圖使用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫在線繪制[17-18]，在正常食管和食管癌中的TONSL mRNA表達(dá)水平差異統(tǒng)計圖使用GEPIA數(shù)據(jù)庫在線繪制[19]，124 例食管癌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)來自Liu 等[2]的文獻(xiàn)。所有統(tǒng)計分析及繪圖均使用SPSS 19(IBM，USA)、Microsoft Excel 和Graphpad Prism 8(San Diego，USA)完成。采用配對樣本t檢驗評估食管癌蛋白質(zhì)組中蛋白分子在癌與非癌組織中的表達(dá)差異，采用配對樣本秩和檢驗評估正常食管、食管鱗癌組織中TONSL 蛋白免疫組織化學(xué)評分的差異。應(yīng)用X-tile 軟件(版本3.6.1)確定最佳截斷值以進(jìn)行TONSL相對高表達(dá)和低表達(dá)分組[2]。采用Kaplan-Meier 方法和對數(shù)秩檢驗分析相對高表達(dá)組和低表達(dá)組總生存率和無病生存率的差異。采用Two-Way 方差分析(ANOVA)法對集落形成實驗和EdU 實驗的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TONSL 在食管癌中高表達(dá)且與患者不良預(yù)后相關(guān)

利用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫在線分析了4個食管癌研究隊列的基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TONSL在食管癌中普遍存在拷貝數(shù)擴(kuò)增，最高頻率可達(dá)15%以上(圖1A)。接著利用GEPIA數(shù)據(jù)庫在線分析了食管癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)食管癌組織中TONSL的轉(zhuǎn)錄水平相對正常食管組織上調(diào)(P＜0.05，圖1B)。對124 對食管癌組織與非腫瘤組織的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[2]，發(fā)現(xiàn)食管癌組織中TONSL的蛋白水平同樣高于正常食管組織(P＜0.05，圖1C)，與食管癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致；并且，無論是總生存率(圖1D)還是無進(jìn)展生存率(圖1E)，TONSL 高表達(dá)的食管癌患者均呈現(xiàn)更差的預(yù)后。上述結(jié)果表明TONSL在食管癌中表達(dá)上調(diào)與其拷貝數(shù)擴(kuò)增存在一定的關(guān)聯(lián)性，是食管癌患者不良預(yù)后的標(biāo)志物。從124 例食管癌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中TONSL蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系看(見表1)，TONSL 的水平與性別、年齡、吸煙史、飲酒史、分化程度、T分期、N分期和pTNM分期均無明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。

表1 TONSL表達(dá)水平與食管癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.2 免疫組織化學(xué)驗證TONSL 蛋白在食管鱗癌組織中高表達(dá)

基于上述食管癌基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的結(jié)果，我們利用免疫組織化學(xué)實驗評估TONSL蛋白在20對食管鱗癌手術(shù)樣本以及配對的癌旁正常食管樣本中的表達(dá)情況，并對其進(jìn)行評分。如圖2A 所示，TONSL 蛋白的表達(dá)在食管鱗癌組織中主要位于細(xì)胞質(zhì)，少部分組織細(xì)胞核也有表達(dá)。對TONSL在食管鱗癌和癌旁正常食管中免疫組織化學(xué)評分做差異分析，發(fā)現(xiàn)相對于癌旁正常食管，TONSL蛋白在食管鱗癌組織中高表達(dá)(P＜0.05，圖2B)。從這20 例食管鱗癌患者TONSL 蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系看(見表1)，TONSL的水平與性別、年齡、吸煙史、飲酒史、分化程度、T 分期、N 分期和pTNM 分期均無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

圖2 免疫組織化學(xué)驗證TONSL蛋白在食管鱗癌組織中高表達(dá)

2.3 TONSL敲降抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步研究TONSL在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮的功能和作用機(jī)制，我們利用小RNA 干擾技術(shù)構(gòu)建了TONSL 瞬時敲降食管鱗癌細(xì)胞模型，并進(jìn)行Western blot 檢測TONSL 的敲降效率。結(jié)果顯示，在KYSE30和KYSE510 食管鱗癌細(xì)胞中，與對照組相比，兩條siRNA 的敲降效率均達(dá)到了60%以上，分別將其命名為si-TONSL-1 和si-TONSL-2(圖3A 和B)。集落形成實驗結(jié)果表明，與對照組細(xì)胞相比，TONSL敲降后兩種食管鱗癌細(xì)胞中的集落數(shù)量顯著減少(圖3C 和D)。這說明TONSL敲降抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖。

圖3 TONSL敲降抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖

2.4 TONSL敲降抑制食管鱗癌細(xì)胞DNA復(fù)制

既往有研究報道TONSL參與同源重組修復(fù)、復(fù)制叉修復(fù)和染色質(zhì)形成，TONSL與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期緊密相關(guān)[12-13]?；诖?，本文通過EdU 實驗來探究TONSL 敲降對食管鱗癌細(xì)胞DNA 復(fù)制的影響。如圖4所示，與對照組相比，TONSL敲降后兩種食管鱗癌細(xì)胞的EdU 陽性細(xì)胞占比明顯減少(P＜0.01)，處于細(xì)胞周期S 期的食管鱗癌細(xì)胞占比減少，食管鱗癌細(xì)胞的增殖活性降低。這說明TONSL敲降抑制食管鱗癌細(xì)胞DNA復(fù)制。

圖4 TONSL敲降抑制食管鱗癌細(xì)胞DNA復(fù)制

2.5 TONSL參與食管鱗癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)

據(jù)文獻(xiàn)報道，TONSL 與MMS22L 相互作用形成復(fù)合體，該復(fù)合體可作為許多DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的支架，幫助它們結(jié)合到DNA 損傷位點從而參與DNA損傷修復(fù)過程，在HeLa 細(xì)胞中，敲降TONSL 會誘導(dǎo)DNA損傷檢查點相關(guān)蛋白ATM和CHK2磷酸化水平升高[20-21]。為了探究TONSL 在食管鱗癌細(xì)胞中是否發(fā)揮類似的作用，我們通過Western blot 檢測了TONSL 敲降后ATM和CHK2磷酸化水平。結(jié)果顯示，TONSL敲降可誘導(dǎo)ATM 和CHK2 磷酸化水平升高的增加(圖5)。這可能是因為TONSL敲降后，DNA損傷后正常的修復(fù)機(jī)制未能正常進(jìn)行并完成修復(fù)，使得DNA損傷檢查點相關(guān)蛋白一直持續(xù)激活。

圖5 TONSL參與食管鱗癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)

3 討 論

食管癌發(fā)病率在惡性腫瘤中居第8 位，同時也是每年癌癥死亡的第6 大常見原因，這不僅說明食管癌惡性度高，其死亡率排名高于發(fā)病率還說明食管癌的診斷和治療落后于其他惡性腫瘤[1-3]。食管癌的5 年總生存率在15%～20%左右，盡管近年來由于醫(yī)療水平和生活環(huán)境的發(fā)展和進(jìn)步有所升高，但5 年總生存率僅升至30%左右[22-26]。食管鱗癌作為世界范圍尤其是我國最主要的食管癌亞型，在臨床上卻無可用的早期診斷標(biāo)志物和有效的治療靶點。因此，尋找可用于食管鱗癌早期診斷提高食管鱗癌早診率，鑒定有效的治療靶點是降低食管癌疾病負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵。

TONSL 作為一種支架蛋白，與組蛋白H3/H4、ASF1(anti-silencing factor 1)、 MCM(minichromosome maintenance)復(fù)合物N 端結(jié)構(gòu)域和MMS22L 的C 端結(jié)構(gòu)域相互作用，一起參與復(fù)制應(yīng)激和DNA 雙鏈斷裂修復(fù)，是一種相對較新的參與同源重組修復(fù)、復(fù)制叉修復(fù)和染色質(zhì)形成的蛋白，有希望成為一個新的治療靶點[13，27]。TONSL 亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，含有四肽重復(fù)序列(tetratricopeptide repeats，TPR)，錨蛋白樣重復(fù)序列(ankyrin repeats，ANK)，PB1 泛素樣結(jié)構(gòu)域(PB1 ubiquitin-like domain)和富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats，LRR)等4 個結(jié)構(gòu)域。四肽重復(fù)序列和富亮氨酸重復(fù)序列這兩個基序主要在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起作用，而PB1 泛素樣結(jié)構(gòu)域則在適配器蛋白和支架蛋白中充當(dāng)二聚/寡聚結(jié)構(gòu)域[9，28]。Yu 等[14]通過分析TCGA 和HPA 數(shù)據(jù)庫中TONSL相關(guān)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TONSL在肝癌中表達(dá)上調(diào)，且其過表達(dá)的病例在細(xì)胞周期調(diào)控途徑中富集[14]。在前列腺癌中，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示TONSL 可作為潛在的預(yù)后指標(biāo)和可能的治療靶點[29]。在乳腺癌中，TONSL 發(fā)生拷貝數(shù)擴(kuò)增的概率約為20%，實驗顯示單用TONSL即可使原代乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的端粒酶活性增加，發(fā)生永生化，這說明TONSL上調(diào)在腫瘤發(fā)生的初始階段即存在[30]。最近的研究顯示在肺癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌組織中TONSL表達(dá)上調(diào)，且這種高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[30-31]。在動物中，TONSL可通過其錨蛋白樣重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域與單甲基化的組蛋白H4K20me1 特異性相互作用，進(jìn)而被招募到染色質(zhì)上[12，32-33]。TONSL 本身不具有酶活性，但其與MMS22L 相互作用形成的復(fù)合體可通過調(diào)節(jié)停滯復(fù)制分叉處的染色質(zhì)狀態(tài)來促進(jìn)基因組的穩(wěn)定性，且TONSL-MMS22L 復(fù)合體是許多DNA 損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的支架，在這些蛋白結(jié)合到DNA損傷位點的過程中發(fā)揮重要作用[20-21]。TONSL 與MMS22L 相互作用維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并入核可發(fā)揮促腫瘤生長的作用，而靶向抑制TONSL與MMS22L的相互作用可抑制這種作用，并且增強5-氟尿嘧啶和順鉑等誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA損傷，阻斷DNA 合成的化療藥物的治療效果[15]。Khatpe等[30]的研究顯示過表達(dá)TONSL會導(dǎo)致與DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，尤其是同源重組修復(fù)途徑中幾個基因的表達(dá)上調(diào)，抑制TONSL的作用可顯著影響TONSL 擴(kuò)增的乳腺癌細(xì)胞的生長增殖?？傊琓ONSL 作為上皮細(xì)胞永生的調(diào)節(jié)劑，通過促進(jìn)DNA損傷修復(fù)從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生，靶向抑制TONSL是一種有前途的新型癌癥治療策略，也可以提高DNA損傷抗癌藥物的療效。TONSL有望成為腫瘤診斷分子標(biāo)志物，也有潛力成為腫瘤治療新的靶點。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TONSL在食管鱗癌組織中存在拷貝數(shù)擴(kuò)增，并且在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)均上調(diào)，TONSL的高表達(dá)與食管癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)；在細(xì)胞水平證明了TONSL 參與DNA 損傷修復(fù)，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，TONSL在食管鱗癌中表達(dá)上調(diào)，其可能通過參與食管鱗癌DNA損傷修復(fù)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖，這提示TONSL有望成為食管鱗癌的分子治療靶點。本研究仍有一些不足之處：并非所有食管癌患者的基因組TONSL 均存在拷貝數(shù)擴(kuò)增，此部分患者TONSL上調(diào)的機(jī)制還需進(jìn)一步探究；本研究僅在細(xì)胞層面證明了敲降TONSL抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖，還需進(jìn)一步在動物模型上驗證。