吳 雪,張惜燕,李翠娟,張晉冀,周 潔,胡 勇

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院,陜西 西安 710032)

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(Glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)是由于長期或超劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物所導(dǎo)致的以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化、負(fù)重骨(腰椎、股骨)骨折率顯著增加為特征的代謝性骨病[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療的患者,第一年的骨丟失速率最快,應(yīng)用時(shí)間超過6個(gè)月GIOP發(fā)病率可達(dá)50%,且骨量丟失與糖皮質(zhì)激素使用時(shí)間與劑量呈正相關(guān)[2]。GIOP動(dòng)物模型中可觀察到糖皮質(zhì)激素對(duì)皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的破壞,其抑制骨外膜面的骨形成,促進(jìn)骨內(nèi)膜面的骨吸收,使皮質(zhì)骨變薄,骨髓腔變大;另外,松質(zhì)骨比皮質(zhì)骨更容易受到影響,可見骨小梁的面積百分?jǐn)?shù)減少、厚度變薄、數(shù)目減少、彼此間分離度增大[3]。Wnt信號(hào)通路是治療GIOP的潛在靶點(diǎn)之一,通過刺激成骨細(xì)胞增殖、分化與礦化,可糾正骨代謝負(fù)平衡狀態(tài)[4-6]。研究顯示,超劑量或長時(shí)間使用糖皮質(zhì)激素可顯著降低成骨細(xì)胞Wnt16水平,增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路的拮抗蛋白及復(fù)性調(diào)節(jié)因子Axin-2的表達(dá),抑制成骨細(xì)胞分化,導(dǎo)致骨形成能力減弱及骨密度下降[7]。固本活血壯骨顆粒由7味中藥組成,包括黃芪、鹿角膠、淫羊藿、三七等,具有補(bǔ)腎健脾、活血壯骨之功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),固本活血顆粒通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、糖尿病性骨質(zhì)疏松癥等[8-10]?；诖?本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比大鼠骨組織微結(jié)構(gòu)的變化,觀察固本活血壯骨顆粒對(duì)GIOP的作用并探究其機(jī)制,以期為GIOP的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:48只3月齡的雄性Wistar大鼠,體重為200～230 g,由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(川)2020-030。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:固本活血壯骨顆粒(陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑研究室制備);0.9%氯化鈉溶液(批號(hào)2B20011003,山東齊都藥業(yè)有限公司);阿法骨化醇軟膠囊(批號(hào)A48195,以色列梯瓦制藥工業(yè)有限公司);地塞米松注射液(批號(hào)1911052211,辰欣藥業(yè)股份有限公司)。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)與Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的RNA引物由擎科生物有限公司合成。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:Micro-CT掃描儀(型號(hào)Brukerskyscan1272,美國Bruker);PCR熒光定量儀(型號(hào)CFX96 Touch,美國Bio-Rad);倒置顯微鏡(型號(hào)DMi8M,德國Leica)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模與給藥:將大鼠隨機(jī)分正常組、模型組、西藥組、中藥組,每組12只。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)描述,除正常組大鼠肌注0.9%氯化鈉溶液外,其余組大鼠按1 mg/kg的給藥劑量肌肉注射地塞米松以建立GIOP模型,2次/周,持續(xù)干預(yù)8周[11]。另外,本實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)與造模同時(shí)進(jìn)行:西藥組大鼠以阿法骨化醇軟膠囊溶液灌胃,給藥劑量為1 mg/kg;中藥組以固本活血壯骨顆粒(每1 g顆粒含生藥2 g)溶液灌胃,給藥劑量為4.68 g/kg(成人的6倍劑量);正常組、模型組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃,每周干預(yù)6 d,1次/d,持續(xù)干預(yù)8周。

1.2.2 Micro-CT掃描檢測(cè)大鼠骨微結(jié)構(gòu):依據(jù)文獻(xiàn)設(shè)置Micro-CT掃描參數(shù)后,對(duì)各組大鼠的右側(cè)股骨進(jìn)行掃描和檢測(cè)[11]。實(shí)驗(yàn)可得到骨礦物質(zhì)密度(Bone mineral density,BMD)、結(jié)構(gòu)模式指數(shù)(Structural model index,SIM)、各向異性程度(Anisotropic degree,DA)、骨小梁數(shù)量(Trabecular number,Tb.N)、皮質(zhì)骨總面積(Total area of cortical bone,Tt.Ar)、皮質(zhì)骨厚度(Cortical bone thickness,Ct.Th)、骨髓腔面積(Bone marrow cavity area,Ma.Ar),同時(shí)將獲得的圖像進(jìn)行3D重建。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠骨組織病理學(xué)變化:待測(cè)骨組織需依次經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定,脫鈣液(10%EDTA)脫鈣,石蠟包埋,切片,烘箱脫蠟脫水處理后,再進(jìn)行HE染色,最后于顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)通路相關(guān)分子的mRNA表達(dá):各組大鼠的右側(cè)股骨組織經(jīng)研磨處理后,以Trizol溶液提取組織總RNA,進(jìn)行定量和反轉(zhuǎn)錄處理,并檢測(cè)LRP5、Runx2的mRNA表達(dá);以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法對(duì)各組mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。LRP5上游引物:5’-CATCCAGCAGTTCATCCAGC-3’,下游引物:5’-CATGTTGTACAGGGAGGGT-3’。Runx2上游引物:5’-GCCGGGAATGATGAGAACTA-3’,下游引物:5’-GGACCGTCCACTGTCACTTT-3’。β-actin上游引物:5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’,下游引物:5’-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析法比較多組間的差異;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠股骨BMD比較 見表1。與正常組相比,模型組大鼠的BMD值降低(P<0.05);與模型組比較,西藥組、中藥組大鼠BMD值增高(均P<0.05);西藥組與中藥組大鼠BMD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠股骨BMD比較(g/cm3)

2.2 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察 見圖1。正常組大鼠骨組織中骨小梁數(shù)量多,形態(tài)寬厚,結(jié)構(gòu)完整,相互交織成緊密的網(wǎng)絡(luò)狀,伴少量脂肪細(xì)胞;與正常組比較,模型組大鼠的骨小梁數(shù)量明顯減少,厚度變薄變細(xì),連續(xù)性中斷嚴(yán)重,且脂肪細(xì)胞堆積;與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)得到改善,表現(xiàn)為骨小梁的數(shù)量、厚度的顯著增加,骨小梁間隙以及脂肪空泡的顯著減少。

圖1 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠股骨SIM、DA、Tb.N值比較 各組大鼠松質(zhì)骨3D重建結(jié)果見圖2。正常組大鼠松質(zhì)骨中骨小梁緊密交織成“絲瓜絡(luò)樣”網(wǎng)面結(jié)構(gòu);與正常組比較,模型組大鼠股骨骨小梁數(shù)目顯著減少,結(jié)構(gòu)坍塌,呈顯著空洞樣;與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠的骨組織形態(tài)顯著改善,即骨小梁數(shù)目增多,連接較為緊密,空間結(jié)構(gòu)破壞減少。骨小梁結(jié)構(gòu)系數(shù)變化見表2。與正常組比較,模型組大鼠的SIM值增加,Tb.N降低(均P<0.05);與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠的SIM值降低,Tb.N值升高(均P<0.05)。各組大鼠DA值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖2 各組大鼠股骨松質(zhì)骨3D重建圖

表2 各組大鼠股骨SIM、DA、Tb.N值比較

2.4 各組大鼠股骨Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar值比較 各組大鼠皮質(zhì)骨3D重建結(jié)果見圖3。正常組大鼠骨髓腔面積較小,皮質(zhì)骨厚度較厚,結(jié)構(gòu)無異常;與正常組比較,模型組大鼠股骨髓腔面積明顯增大,皮質(zhì)骨厚度減小,孔隙增多,提示出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥;在以阿法迪三與固本活血壯骨顆粒干預(yù)后,西藥組與中藥組大鼠骨髓腔面積變化不明顯,但皮質(zhì)骨厚度均有明顯改善,此外,固本活血壯骨顆粒對(duì)大鼠皮質(zhì)骨空隙增大的干預(yù)作用優(yōu)于阿法迪三。各組大鼠皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)系數(shù)變化見表3。與正常組比較,模型組大鼠的Tt.Ar值、Ct.Th值降低,Ma.Ar值升高(均P<0.05);與模型組比較,西藥組、中藥組大鼠Tt.Ar值、Ct.Th值改善(均P<0.05)。西藥組、中藥組大鼠Ma.Ar值與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表3 各組大鼠股骨Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar值比較

2.5 各組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達(dá)水平比較 見表4。與正常組比較,模型組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達(dá)降低(均P<0.05);與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達(dá)增加(均P<0.05)。

表4 各組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

根據(jù)GIOP的臨床癥狀和體征,中醫(yī)學(xué)主要將其歸于“骨痿”“骨枯”等范疇[12]。糖皮質(zhì)激素的長期過量應(yīng)用損傷人體臟腑,其陽熱亢烈之性可發(fā)越腎氣,使腎失封藏,腎精得瀉,耗傷腎陰,久而及陽,正如《素問·痿論》所言:“腎者水臟也,今水不勝火,則骨枯而髓虛,故足不任身,發(fā)為骨痿”,其病因?yàn)椤八幮啊?其發(fā)病機(jī)制為糖皮質(zhì)激素引發(fā)機(jī)體陰陽失衡,病變關(guān)鍵在腎[13]。故GIOP的治療當(dāng)以平調(diào)腎之陰陽為核心,采用補(bǔ)益腎精、健脾益氣、活血化瘀、通絡(luò)止痛等治法,補(bǔ)瀉兼施,以平為期[14]。固本活血壯骨顆粒組方契合GIOP的病因病機(jī),方中淫羊藿、鹿角膠補(bǔ)益腎陽,龍骨、牡蠣滋陰潛陽,黃芪、三七益氣健脾、活血定痛,杜仲補(bǔ)益肝腎,強(qiáng)筋健骨,其中龍骨可于養(yǎng)陰的同時(shí)潛浮越之陽,煅牡蠣可于益陰的同時(shí)攝下陷之陽,二者相伍可益腎固精,防止腎失封藏;三七與龍骨、牡蠣相配伍可使祛瘀生新之力更強(qiáng),促進(jìn)新骨形成。

BMD為骨量評(píng)價(jià)指標(biāo)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)以地塞米松作為刺激物建立骨質(zhì)疏松癥模型,可見模型組大鼠BMD值降低;以固本活血壯骨顆粒干預(yù)后,大鼠BMD值提高,提示固本活血壯骨顆?？筛纳艷IOP大鼠骨量。GIOP不僅僅出現(xiàn)骨量的下降,還會(huì)伴隨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)破壞、皮質(zhì)骨多孔性改變。因此,為更全面的了解固本活血壯骨顆粒對(duì)GIOP大鼠的干預(yù)機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過Micro-CT技術(shù)獲得皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨測(cè)量參數(shù)。SIM、Tb.N、DA為松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)指標(biāo),分別代表結(jié)構(gòu)模式指數(shù)、骨小梁數(shù)量以及各向異性程度;Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar為評(píng)價(jià)皮質(zhì)骨質(zhì)量的測(cè)量學(xué)指標(biāo),分別代表著皮質(zhì)骨總面積、皮質(zhì)骨厚度以及骨髓腔面積[3,17]。骨質(zhì)疏松癥后常見Ct.Th、Tb.N降低,DA、Tt.Ar、SIM、Ma.Ar升高[17]。本實(shí)驗(yàn)中,給予固本活血壯骨顆粒干預(yù)后,大鼠的Ct.Th、Tb.N、Tt.Ar和SIM值均得到改善;Ma.Ar值稍有變化,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在一定程度上說明固本活血壯骨顆粒對(duì)GIOP大鼠松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)與皮質(zhì)骨是具有改善作用的。

Wnt/LRP5/β-catenin是調(diào)控骨平衡狀態(tài)的重要信號(hào)通路,該通路的激活有利于骨形成[18]。LRP5、GSK-3β、β-catenin、Runx2等是該信號(hào)通路的主要構(gòu)成部分[19]。Wnt/LRP5/β-catenin信號(hào)通路被觸發(fā)時(shí),Wnt與由Frizzled受體和LRP5組成的受體復(fù)合物結(jié)合,使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不斷聚集,最終轉(zhuǎn)移到細(xì)核內(nèi)與 LEF1/TCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,激活下游靶基因Runx2及OSX,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄與翻譯,以達(dá)到維持細(xì)胞存活、分化與增殖的目的[20]。本實(shí)驗(yàn)中,以地塞米松復(fù)制GIOP模型,可見LRP5與Runx2的mRNA表達(dá)均減少,提示W(wǎng)nt/LRP5/β-catenin信號(hào)通路被抑制;與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠LRP5、Runx2 mRNA表達(dá)均增加,且兩組LRP5、Runx2 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明固本活血壯骨顆粒與阿法骨化醇軟膠囊可提高LRP5活性,增加β-catenin穩(wěn)定性,并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移至核內(nèi),促進(jìn)下游靶基因Runx2表達(dá),以激活Wnt/LRP5/β-catenin信號(hào)通路。另外,HE染色結(jié)果證實(shí),固本活血壯骨顆粒與阿法骨化醇軟膠囊干預(yù)后,GIOP大鼠的骨小梁數(shù)量變多,間隙變小,連續(xù)性增強(qiáng)。

綜上所述,固本活血壯骨顆粒能夠提高GIOP大鼠BMD,改善骨小梁微結(jié)構(gòu),保護(hù)皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨,其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)Wnt/LRP5/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。