葉 濤,徐天舒

(南京中醫(yī)藥大學鼓樓臨床醫(yī)學院,江蘇 南京 210008)

化療所致周圍神經病理性疼痛(Chemotherapy-induced peripheral neuropathic pain,CIPNP)是化療藥物常見的不良反應之一[1]。CIPNP多發(fā)生在化療早期,主要臨床表現(xiàn)為四肢遠端麻木感、刺痛感及冷熱感等感覺神經異常,如異常性疼痛、痛覺過敏[2]。奧沙利鉑是大腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤化療的一線用藥,其在血液系統(tǒng)、胃腸道等方面的不良反應較輕,且無腎毒性,但是神經毒性比較明顯[3]。奧沙利鉑的神經毒性主要分為兩類:一類是急性神經毒性,在奧沙利鉑輸注后數(shù)小時或數(shù)天內即可發(fā)生,主要表現(xiàn)為周圍神經異常,如口周、四肢麻木等,嚴重時引起下頜肌肉及喉頭痙攣,引發(fā)呼吸困難;另一類是慢性神經毒性,具有劑量依賴性,主要發(fā)生在給藥后數(shù)周,臨床表現(xiàn)為四肢末端麻木、疼痛、感覺性共濟失調及運動功能障礙[4-5]。藥物療法是目前CIPNP的主要治療手段,常用的藥物包括還原性谷胱甘肽、鈣鎂合劑、甲鈷胺等,雖然以上藥物對CIPNP有一定的治療作用,但均缺乏高水平證據的支持。美國臨床腫瘤協(xié)會CIPNP的指南中明確指出度洛西汀是目前隨機對照試驗唯一支持的CIPNP治療藥物,但度洛西汀治療方式比較單一,并且度洛西汀對中樞神經系統(tǒng)和消化系統(tǒng)都有一定的不良反應,這些都是亟待解決的問題[6]。

足三里穴是足陽明胃經的合穴,足陽明胃經為多氣多血之經[7]。《素問·痿論》記載:“治痿獨取陽明”。研究顯示,足三里穴是治療CIPNP使用頻率最高的穴位[8]。臨床研究證實,針灸能有效治療由糖尿病引起的周圍神經疼痛[9]。據此推測針灸對CIPNP有較好的鎮(zhèn)痛作用。在影響針刺效應的諸多因素中,針刺強度的參數(shù)設置對鎮(zhèn)痛效應起到關鍵作用[10]。本研究建立奧沙利鉑所致周圍神經疼痛大鼠模型,采用不同強度電針干預足三里,旨在通過研究大鼠疼痛行為學、坐骨神經傳導速度及脊髓膠質纖維酸性蛋白(GFAP)水平的變化來探討針灸治療CIPNP的效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SD雄性大鼠25只,6～8周齡,體重200～220 g,購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心,動物合格證號:202151048,許可證號:SCXK(蘇)2021-0001。大鼠在南京鼓樓醫(yī)院分籠喂養(yǎng),保證室內清潔、干燥通風,溫度保持在22～24 ℃,12 h明暗交替,保證充足的水和食物。實驗中所有操作均遵守南京鼓樓醫(yī)院動物實驗中心頒布的實驗動物管理條例,并通過南京鼓樓醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(動物倫理審批號:DWSY-2104184)。

1.1.2 主要實驗試劑與儀器:注射用奧沙利鉑(批號E2109012,規(guī)格50 mg),異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司),抗GFAP抗體(福麥斯生物技術有限公司),BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、DAB顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

Von Frey纖維絲、有機玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)、金屬篩網(美國North Coast Medical公司),小動物麻醉機(瑞沃德生命科技有限公司),針灸針(25 mm×13 mm)、SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司),低溫高速離心機(德國Thermo公司),PowerLab數(shù)據采集分析系統(tǒng)、MP 150多通道生理信號記錄系統(tǒng)[埃德儀器國際貿易(上海)有限公司]。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立及干預:將雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后,隨機分為空白組、模型組、低強度電針組(1 mA)、中強度電針組(2 mA)、高強度電針組(3 mA)。用5%葡萄糖溶液充分溶解奧沙利鉑,終濃度為1 mg/ml。模型組和各電針組大鼠分別于第1、3、5、8、11、15天腹腔注射奧沙利鉑2 mg/kg建立CIPNP模型,空白組在同時間點腹腔注射等量的5%葡萄糖溶液[11]。造模第16天進行機械性痛敏感實驗,大鼠Von Frey纖維絲機械性刺激疼痛陽性反應且單足縮足≥3次,提示造模成功[12]。

參照《實驗針灸學》[13]對足三里穴進行定位,位于膝關節(jié)后外側,腿部的腓骨小頭下0.5 mm處。成功建立CIPNP模型后,各強度電針組大鼠均針刺足三里。固定大鼠并消毒穴位及周圍皮膚,將針灸針刺入雙側足三里穴,透皮后直刺2 mm,低、中、高強度電針組電流分別為1、2、3 mA,頻率5 Hz,以大鼠肢體微顫為度,10 min/次,1次/d,共干預14 d。小動物專用吸入麻醉機-異氟烷麻醉(0.41 ml/min,2%)下進行電針針刺。模型組大鼠同電針組固定,但是不做針刺治療,1次/d,共干預14 d?？瞻捉M大鼠正常飼養(yǎng),不做其他處理。

1.2.2 大鼠體重:每周記錄1次大鼠體重,以g作為記錄單位。

1.2.3 機械性痛敏感實驗:將大鼠放置在底部為1 cm×1 cm小格的金屬網上,四周罩上透明籠子,讓大鼠在安靜環(huán)境中適應15 min,等待其探究和梳理行為基本消失,使用Up and Down的方法進行測試[14]。測試方法為用Von Frey纖維絲刺激大鼠雙后肢足底,纖維絲規(guī)格分別為4、6、8、10、15 g,將纖維絲垂直于足底表面,用足夠的力量刺激,以纖維絲呈現(xiàn)“S”形為度,每次持續(xù)6～8 s,大鼠的每側足底分別測量6次,兩次測量時間間隔10 s以上,大鼠在刺激時或在移開纖維絲時所立即出現(xiàn)的快速縮足反應記為陽性反應,身體移動時的縮足不記為陽性反應。機械性痛敏感實驗共進行4次,分別于干預第1、5、9、14天進行。

1.2.4 坐骨神經傳導速度檢測:干預第15天,在完成機械性痛敏感實驗后,予大鼠2%異氟烷0.41 ml/min吸入麻醉,俯臥位固定,暴露大鼠右側坐骨切跡處坐骨神經約2 cm。將刺激雙針電極置于大鼠右側坐骨切跡處坐骨神經傳出部位,于同側踝關節(jié)坐骨神經經過部位用雙針電極記錄,參考電極置于刺激電極與記錄電極之間、距記錄電極1 cm處。用波寬0.1 ms的單脈沖方波刺激,調整刺激強度,以復合動作電位出現(xiàn)或消失時的刺激強度為刺激閾值,記錄刺激閾值[15]。以1.5倍閾值作為刺激強度進行測定。計算機記錄刺激開始到動作電位出現(xiàn)的時間作為興奮信號的傳導時間。將大鼠后足以自然肢體狀態(tài)與脊柱成45°夾角向斜后方拉直,沿坐骨神經經過部位和方向,在大鼠體表準確測定刺激電極至記錄電極之間的距離。重復測定7～10次,計算平均值。坐骨神經傳導速度=刺激電極與記錄電極間的距離/傳導時間。

1.2.5 HE染色觀察大鼠脊髓組織形態(tài)學改變:各組大鼠坐骨神經傳導速度測定結束后立即取材。異氟烷麻醉后處死大鼠,迅速暴露大鼠心臟,0.9%氯化鈉溶液灌注,觀察到肺以及肝臟變白后停止灌注,用咬骨鉗暴露整個脊髓,組織剪剪下脊髓腰膨大處即L4～6,立即放置于EP管中,-80 ℃冰箱保存。取脊髓L4～6節(jié)段置于中性多聚甲醛中固定48 h后進行脫水、石蠟包埋,5 μm切片,脫蠟、水化后蘇木素染色5 min,分化液分化,返藍液返藍,伊紅染色1 min,漂洗后梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,在光學顯微鏡下觀察脊髓組織的形態(tài)改變。

1.2.6 Western blot 法檢測脊髓GFAP表達:取凍存的大鼠脊髓標本40 mg,加入200 μl裂解液,破碎勻漿直至完全裂解。裂解后4 ℃、12000 r/min離心15 min,取上清液進行蛋白質濃度測定,根據蛋白濃度測定結果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液,沸水浴10 min。選擇10%PAGE膠電泳,并將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上,5%BSA封閉液室溫封閉1 h后加入稀釋的一抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加入稀釋的二抗,室溫孵育1 h,洗滌后滴加ECL化學發(fā)光液,使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照,讀取相關條帶灰度值,以GAPDH為內參計算大鼠脊髓組織GFAP蛋白的相對表達。

2 結 果

2.1 一般情況 空白組大鼠精神良好、反應靈敏、正常飲食,體重正常增長;模型組大鼠精神萎靡不振、反應遲緩、毛發(fā)稀疏、活動和進食逐漸減少;各電針組大鼠精神可、反應稍慢、毛發(fā)正常、飲食活動可。各組大鼠體重見表1。與模型組比較,各電針組大鼠體重第21、28天時增長速度減慢,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各組與模型組相比均無統(tǒng)計學差異。

表1 各組大鼠體重比較(g)

2.2 各組大鼠機械性痛閾值比較 見表2。干預第1天,與空白組比較,模型組和低、中、高強度電針組大鼠機械性痛閾值降低,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);干預第5、9天,低、中、高強度電針組大鼠機械性痛閾值具有升高趨勢;干預第14天,與模型組比較,低、中、高強度電針組大鼠機械痛痛閾升高,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。各強度電針組大鼠機械性痛閾值比較,差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表2 各組大鼠機械性痛閾值比較(g)

2.3 各組大鼠坐骨神經傳導速度比較 見表3。與空白組比較,模型組大鼠坐骨神經傳導速度明顯減慢,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,低、中、高強度電針組大鼠坐骨神經傳導速度明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);各強度電針組坐骨神經傳導速度比較,差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表3 各組大鼠坐骨神經傳導速度比較(m/s)

2.4 各組大鼠脊髓組織病理學改變 空白組大鼠脊髓組織神經元細胞核大小正常,位于細胞中央,無明顯空腔。與空白組比較,模型組大鼠脊髓組織結構紊亂,出現(xiàn)大量的空腔,炎性浸潤嚴重,存在大量炎性細胞,正常神經元大量減少。與模型組比較,各電針組大鼠脊髓結構較完整,炎性浸潤程度較輕,炎性細胞較少,正常神經元較多。白色箭頭指示正常神經元細胞,黑色箭頭指示活化的神經元細胞。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織病理學改變(HE染色,×400)

2.5 各組大鼠脊髓組織GFAP蛋白表達比較 與空白組比較,模型組脊髓組織GFAP蛋白表達水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,低、中、高強度電針組脊髓組織GFAP蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);各強度電針組GFAP蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4(圖2)。

A:空白組;B:模型組;C:低強度電針組;D:中強度電針組;E:高強度電針組

表4 各組大鼠脊髓組織GFAP蛋白表達比較

3 討 論

奧沙利鉑是第三代鉑類抗癌藥,主要用于大腸癌、卵巢癌等的治療?；熕幬镌跉绨┘毎耐瑫r,對人體正常的組織和細胞也有殺傷作用。奧沙利鉑化療后的周圍神經毒性發(fā)生率高達90%,分為急性神經毒性和慢性神經毒性,臨床主要表現(xiàn)為肢體末端感覺異常、感覺過敏,遇冷誘發(fā)或加重[16]。奧沙利鉑引起的神經毒性呈劑量依賴性,其病理機制目前尚不明確,可能與奧沙利鉑在背根神經節(jié)的堆積、影響神經元細胞的離子通道、調控神經元內凋亡相關蛋白有關[17-18]。中醫(yī)理論認為,化療藥物毒性峻猛,進入人體后傷及正氣,導致四肢經脈氣血不通,氣血阻滯而發(fā)為疼痛;并且化療藥物長期使用可損傷脾胃之氣,影響氣血生化,氣血生化不足以濡養(yǎng)四肢經脈、皮膚等,表現(xiàn)為四肢末端冷熱痛等感覺異常,歸屬于中醫(yī)“痿證”“痹癥”的范疇。針灸可以明顯改善輕中度CIPNP患者的肢體麻木、疼痛感,且不良反應較少[19-20]。檢索并分析近10年相關文獻,提示足三里是治療CIPN頻率最高的穴位[21]。足三里為氣血充盛的足陽明胃經的下合穴,陽明經為五臟六腑之海,“潤宗筋、主束骨而立機關”,又有“治痿獨取陽明”之說[22]。針灸足三里可以健運脾胃,使氣血化生有源,氣血充足濡養(yǎng)四肢經脈,改善周圍神經病變的感覺異常[23]。

本研究結果顯示,造模結束、干預第1天,與空白組比較,模型組和低、中、高強度電針組大鼠機械性痛閾值均降低;干預第5、9天,低、中、高強度電針組大鼠機械性痛閾值具有升高趨勢;干預第14天,與模型組比較,低、中、高強度電針組大鼠機械痛痛閾升高。各電針組組間機械性痛閾值比較,差異無統(tǒng)計學意義。說明不同強度電針干預足三里穴14 d可以有效改善CIPNP大鼠的機械性痛敏感,但不同強度的刺激量對CIPNP大鼠的鎮(zhèn)痛效果沒有差異,這可能是實驗設計刺激強度未達到可引起電針治療效果出現(xiàn)差異的臨界值。坐骨神經傳導速度檢測可以客觀反映周圍神經傳導功能,定量評價神經損傷程度[24]。GFAP在星形膠質細胞中特異性表達,可以充當星形膠質細胞的特異性標志物。研究表明,脊髓中星形膠質細胞的活化在CIPNP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[25]。本實驗研究結果顯示,不同強度電針足三里穴均可以提高坐骨神經傳導速度,降低脊髓組織中GFAP蛋白的表達,但是不同強度刺激之間的療效沒有差異。說明不同強度電針足三里可以保護CIPNP大鼠的周圍神經,抑制脊髓組織星形膠質細胞的活化,改善大鼠的周圍神經病變。

電針足三里可改善CIPNP大鼠痛覺過敏癥狀,提升坐骨神經傳導速度,降低脊髓組織中GFAP蛋白表達水平,修復大鼠周圍神經病變;其作用機制可能與抑制脊髓星形膠質細胞活化,改善大鼠痛覺過敏有關。