黃仁燕,王宏飛,王徐紅,柳國(guó)斌

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院血管外科,上海 201203)

糖尿病足潰瘍是糖尿病患者截肢的主要原因,同時(shí)也是糖尿病患者死亡的重要原因之一[1-2]。糖尿病足潰瘍發(fā)病率約19%～34%,截肢率達(dá)52%以上,5年內(nèi)再次截肢率約45.72%[3]。此外,糖尿病足潰瘍患者5年內(nèi)病死率高達(dá)30.5%[4]。糖尿病足潰瘍治愈率低、復(fù)發(fā)率較高、預(yù)后不良,嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量[5-6]。再上皮化障礙是糖尿病足潰瘍難愈合的主要原因之一[7-8]。糖尿病足潰瘍?cè)谟显缙诔３霈F(xiàn)過(guò)度的炎癥反應(yīng),愈合中晚期常出現(xiàn)再上皮化障礙,從而延緩整個(gè)愈合進(jìn)程[9]。再上皮化是上皮細(xì)胞在肉芽組織上通過(guò)遷移和增殖覆蓋創(chuàng)面使其完全愈合的過(guò)程,而糖尿病足潰瘍因長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境,成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞的遷移減少,導(dǎo)致再上皮化障礙,使創(chuàng)面經(jīng)久難愈[10-11]。糖尿病足潰瘍屬于中醫(yī)“脫疽”“筋疽”范疇,邪氣致瘀為本病基本病因病機(jī),因此治療應(yīng)“扶正祛邪”并用。紫朱軟膏是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院研制的治療糖尿病足潰瘍的外用藥膏,由朱砂、紫草、阿膠、冰片、龍血竭、黃芪等組成,具有清熱解毒、祛腐生肌之效。研究顯示,紫朱軟膏能有效提高糖尿病足潰瘍臨床療效[12],但其具體作用機(jī)制尚未明確。因此,本研究通過(guò)觀察紫朱軟膏對(duì)糖尿病潰瘍小鼠炎癥反應(yīng)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,為中醫(yī)藥治療糖尿病足潰瘍提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57B/L小鼠由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供,倫理編號(hào):PZSHUTCM190308012,體重(27±8.0)g,12 h∶12 h的光-暗循環(huán)飼養(yǎng),濕度(60±3)%,溫度(25±2)℃,自由飲水和進(jìn)食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:紫朱軟膏(批號(hào)130301,規(guī)格30 g)由朱砂、紫草、阿膠、冰片、龍血竭、黃芪等組成。白介素(Interleukin,IL)-6抗體(批號(hào)CSBE04639,美國(guó)Proteintech公司);腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體(批號(hào)CSBE04741,美國(guó)Proteintech公司);IL-4抗體(批號(hào)M201804,蘇州卡爾文生物);IL-10抗體(批號(hào)M201807,蘇州卡爾文生物);一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,iNOS)抗體(批號(hào)AF0199,美國(guó)Affinity公司);Snail抗體(批號(hào)AF6032,江蘇親科生物);α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(批號(hào)23081-AP,武漢三鷹生物);β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(批號(hào)8480T,美國(guó)Cell Signal公司);上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(Epithelial cadherin,E-cadherin)抗體(批號(hào)ab185335,美國(guó)Abcam公司);Western一抗稀釋液(批號(hào)P0023A,上海碧云天);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(批號(hào)ANT30002,上海碧云天)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器:燙傷儀(型號(hào)SQL-5Q,上海欣軟信息科技有限公司);電泳儀(型號(hào)EPS300,上海天能);低溫高速離心機(jī)(型號(hào)MIKRO220R,Hettich公司);熒光定量PCR儀(型號(hào)LightCycler 96,羅氏公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?糖尿病潰瘍模型的制備:將C57B/L小鼠高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)3周后,腹腔注射40 mg/(kg·d)鏈脲佐菌素,連續(xù)7 d。當(dāng)空腹血糖≥250 mg/dl時(shí),糖尿病模型制備成功。模型制備成功后改為普通飼養(yǎng)喂養(yǎng)3周,采用燙傷儀燙傷小鼠背部,燙傷第2天燙傷組織病理示深Ⅱ度燙傷即模型制備成功。普通潰瘍模型制備:小鼠予普通飼料連續(xù)飼養(yǎng)3周后,采用SQL-5Q燙傷儀燙傷小鼠背部,燙傷第2天取燙傷組織病理示深Ⅱ度燙傷即為模型制備成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施:將糖尿病潰瘍模型小鼠隨機(jī)分為模型組和紫朱軟膏組,每組各4只。制備的普通潰瘍模型小鼠分為對(duì)照組。對(duì)照組和模型組小鼠給予0.9%氯化鈉溶液外用換藥,1次/d;紫朱軟膏組予紫朱軟膏換藥,0.032 g/cm2,1次/d。三組均干預(yù)14 d。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)炎癥指標(biāo)及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子mRNA表達(dá):利用超純RNA提取試劑盒提取小鼠潰瘍組織樣本總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,擴(kuò)增后進(jìn)行溶解曲線分析。按照2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式,計(jì)算各樣品組織中炎癥指標(biāo)IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、iNOS及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞因子snail、β-catenin、α-SMA、E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)量。目的基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因引物序列

1.2.4 Western blot檢測(cè)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子蛋白表達(dá):利用十二烷基硫酸鈉裂解小鼠潰瘍組織,提取總蛋白。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各組小鼠潰瘍?nèi)庋拷M織樣本蛋白含量,電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,半干轉(zhuǎn)膜后封閉,先后加入各觀察指標(biāo)相關(guān)的一抗、二抗,然后洗膜、曝光、顯影,應(yīng)用Image J分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述,比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠潰瘍愈合情況及創(chuàng)面愈合率比較 見(jiàn)圖1。各組小鼠創(chuàng)面面積隨觀察天數(shù)增加均趨于縮小、愈合。對(duì)照組小鼠創(chuàng)面愈合速度較其他兩組快。對(duì)照組小鼠在干預(yù)開始至7 d愈合速度較快,其他兩組在干預(yù)7～11 d的愈合速度較快。干預(yù)14 d,對(duì)照組小鼠創(chuàng)面基本愈合,其他兩組尚未完全愈合。干預(yù)11、14 d,紫朱軟膏組小鼠愈合情況較模型組好。

圖1 各組小鼠潰瘍愈合情況

如圖2所示,干預(yù)3 d,與對(duì)照組比較,模型組小鼠創(chuàng)面愈合率偏低(P<0.05);干預(yù)7、11、14 d,對(duì)照組小鼠的創(chuàng)面愈合率高于模型組(均P<0.01)。干預(yù)3、7 d,模型組、紫朱軟膏組小鼠的創(chuàng)面愈合率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);干預(yù)11、14 d,紫朱軟膏組小鼠的創(chuàng)面愈合率較模型組高(均P<0.01)。表明紫朱軟膏能有效促進(jìn)糖尿病潰瘍小鼠創(chuàng)面愈合。

圖2 各組小鼠創(chuàng)面愈合率比較

2.2 各組小鼠潰瘍組織病理學(xué)改變 各組小鼠潰瘍組織HE染色見(jiàn)圖3。干預(yù)3 d,各組小鼠潰瘍組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。干預(yù)7 d,各組均見(jiàn)新生肉芽組織,上皮組織開始由創(chuàng)緣向創(chuàng)面中心遷移,偶見(jiàn)新生毛細(xì)血管,新生組織中皮脂腺等附屬結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全。干預(yù)14 d,對(duì)照組小鼠創(chuàng)面完全被上皮細(xì)胞覆蓋,肉芽平整,新生皮膚組織結(jié)構(gòu)排列整齊;模型組小鼠潰瘍未愈合,上皮組織未完全覆蓋創(chuàng)面,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,缺乏正常排列結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu);紫朱軟膏組潰瘍愈合優(yōu)于模型組,創(chuàng)面上皮組織覆蓋更明顯,結(jié)構(gòu)更平整。

2.3 各組小鼠潰瘍組織炎癥因子mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較,模型組小鼠潰瘍組織IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)較高,IL-4、IL-10 mRNA表達(dá)較低(均P<0.05);與模型組比較,紫朱軟膏組小鼠潰瘍組織IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)降低,IL-4、IL-10 mRNA表達(dá)升高(均P<0.05)。

表2 各組小鼠潰瘍組織炎癥因子mRNA表達(dá)比較

2.4 各組小鼠潰瘍組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞因子mRNA和蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3(圖4)。與對(duì)照組比較,模型組小鼠潰瘍組織snail、β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(均P<0.05);與模型組比較,紫朱軟膏組潰瘍組織snail、β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)。

圖4 各組小鼠上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組小鼠潰瘍組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較

3 討 論

糖尿病足潰瘍中醫(yī)病名主要有“脫疽”“筋疽”等[13]?！懊摼摇痹凇饵S帝內(nèi)經(jīng)》中被稱為“脫癰”,其曰:“發(fā)于足趾,名脫癰,其狀赤黑”,記載了脫疽者局部病變特點(diǎn)[14]。至?xí)x代,《針灸甲乙經(jīng)》將《內(nèi)經(jīng)》中的“脫癰”改名為“脫疽”,這也是首次提出“脫疽”病名[15]。在后代眾多醫(yī)書中亦有對(duì)脫疽的記載,如《外科理例》中記載:“丁生手足,或足潰而自脫,故名脫疽”。陰虛為本病的基本病因病機(jī),局部潰瘍主要表現(xiàn)為瘀血、痰濁、熱毒。中藥油膏在糖尿病足潰瘍治療中已廣泛應(yīng)用,且組方以清熱、活血化瘀、補(bǔ)虛藥物為主[16-17]。紫朱軟膏是通過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)的治療糖尿病足潰瘍的外用油膏制劑。該方由朱砂、紫草、黃芪、血竭、阿膠、冰片等組成,具有清熱解毒、祛腐生肌、補(bǔ)益氣血之效。糖尿病足潰瘍?cè)缰衅诰植恳愿狻⒀仔詽B出多見(jiàn),治療以“祛腐”為主,紫朱軟膏具有清熱解毒、祛腐生肌的作用,在祛除局部濕熱毒邪同時(shí)還可祛除創(chuàng)面腐肉組織,改善創(chuàng)面炎癥反應(yīng)[18]。糖尿病足潰瘍中后期治療以“生肌”為主,紫朱軟膏能補(bǔ)益氣血,為創(chuàng)面提供營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)肉芽組織形成及再上皮化[12]。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞并獲得增殖、遷移等表型的過(guò)程[19-20]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化目前被劃分為3種亞型,其中2型上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在傷口愈合、組織再生和器官纖維化發(fā)揮著重要作用[21]。在2型上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中細(xì)胞骨架會(huì)重新排列,細(xì)胞間連接和頂-底極性喪失,細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng),通過(guò)快速遷移覆蓋創(chuàng)口表面,促使創(chuàng)面上皮化形成表皮屏障,最終促進(jìn)創(chuàng)面愈合[22-23]。多項(xiàng)研究通過(guò)檢測(cè)上皮分子標(biāo)志物表達(dá)如β-catenin、E-cadherin、Occludin、ZO-1等和間充質(zhì)分子標(biāo)志物表達(dá)如FSP1、α-SMA、N-cadherin和Vimentin等,從分子水平上證明細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化改變[24-25]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,如Snai1、Zeb2和Twist對(duì)EMT均具有誘導(dǎo)作用[26-27]。因此,促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可能成為糖尿病足潰瘍治療的研究方向。本課題組通過(guò)在糖尿病潰瘍模型上加用紫朱軟膏干預(yù),觀察糖尿病潰瘍愈合情況的同時(shí),觀察其對(duì)炎癥細(xì)胞因子及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞因子的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)11、14 d,紫朱軟膏組小鼠的創(chuàng)面愈合率較模型組高。干預(yù)14 d,紫朱軟膏組潰瘍愈合優(yōu)于模型組,創(chuàng)面上皮組織覆蓋更明顯,結(jié)構(gòu)更平整。與模型組比較,紫朱軟膏組小鼠潰瘍組織IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)降低,IL-4、IL-10 RNA表達(dá)升高。與模型組比較,紫朱軟膏組潰瘍組織snail、β-catenin、α-SMA表達(dá)上調(diào),E-cadherin表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果提示紫朱軟膏能減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生,促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合。

綜上所述,紫朱軟膏可能通過(guò)改善創(chuàng)面炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合。但本課題僅觀察了紫朱軟膏對(duì)炎癥反應(yīng)及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,未進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,后期將圍繞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化深入探索紫朱軟膏干預(yù)糖尿病潰瘍的作用機(jī)制。