李長安,崔紅生,班承鈞

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029)

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞引起的慢性氣道炎癥性疾病,其患病率、病死率與心理應(yīng)激、情志等密切相關(guān)[1]。精神障礙,尤其是焦慮和抑郁,在哮喘患者中普遍存在,并與哮喘控制不佳、藥物依從性差、生活質(zhì)量差相關(guān)[2-3]。對于伴有焦慮或抑郁癥的哮喘患者,現(xiàn)無有效的藥物和非藥物治療方法,認(rèn)知行為治療、身心療法、放松療法和生物反饋療法在臨床均未取得滿意療效。

情志與哮喘關(guān)系密切,情志不遂可促使哮喘的發(fā)生、發(fā)展;而哮喘得不到有效控制則易引起心理疾病;兩者互為因果,形成惡性循環(huán),促進(jìn)疾病進(jìn)展。肝主疏泄功能在機(jī)體心理應(yīng)激中起著決定性的作用。武維屏等[4]認(rèn)為,氣郁、氣逆是哮喘發(fā)病之中心環(huán)節(jié),氣郁不解,氣逆不降,哮喘難平。因此,調(diào)肝理肺、理氣降逆為治療哮喘重要法則,哮喘寧顆粒組方嚴(yán)謹(jǐn),調(diào)肝與理肺并行,臨床療效顯著,在防治心理因素所誘發(fā)的哮喘方面具有極大的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SPF級雄性SD大鼠,鼠齡4～5周,體重(120±10)g,動物許可證號:SCXK(京)2020-0001,購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。室溫(22±1)℃,空氣濕度40%～50%,予常規(guī)飼料及飲用水,實驗環(huán)境安靜舒適;本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實驗動物倫理委員會審核通過,倫理批號:BUCM-4-2020122303-4150。

1.1.2 實驗試劑與儀器:卵蛋白(批號A5503-5G,Sigma公司);氫氧化鋁佐劑(批號PI77161,Thermo scientific公司);戊巴比妥鈉(批號57-33-0,Sigma公司)。自制60 cm×60 cm×40 cm玻璃霧化箱(北京有機(jī)玻璃廠);可調(diào)式多孔束縛筒(型號JNT-GQ5,冀諾泰公司);空氣壓縮霧化吸入器(型號NE-C900,歐姆龍);動物肺功能檢測儀(AniRes動物肺功能分析系統(tǒng),北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備:①哮喘寧顆粒(京藥制字Z20053078,規(guī)格12 g/袋),藥物組成:柴胡、黃芩、清半夏、白芍、葶藶子、前胡各10 g,地龍、鉤藤、全瓜蔞、丹參各15 g,炙麻黃、防風(fēng)各6 g,由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。用法:1袋/次,2次/d,口服。②吸入用布地奈德混懸液(批準(zhǔn)文號H20140474,規(guī)格1 mg/2 ml),2 mg/次,2次/d,霧化吸入。要求所有實驗用藥皆用同一批號藥物。參考《藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》[5]計算出大鼠哮喘寧顆粒用藥劑量為2.18 g/(kg·d),普米克令舒用藥劑量為363.11 μg/(kg·d)。

1.2.2 動物分組與給藥:將32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、應(yīng)激哮喘組、普米克令舒組及哮喘寧組,每組8只。參考文獻(xiàn)制備[6-8]心理應(yīng)激哮喘大鼠模型;為避免各組大鼠因給藥途徑不同所引起的軀體應(yīng)激反應(yīng)的差異,故從實驗第15天開始每組大鼠每日激發(fā)前2 h采取灌胃和霧化吸入方式給藥。①應(yīng)激哮喘組:于實驗第1天大鼠腹腔注射含卵蛋白、氫氧化鋁佐劑的混合液1 ml致敏。2周后每日霧化吸入1%OVA(流量2 ml/min)20 min激發(fā)哮喘,連續(xù)14 d。從實驗第1天開始將大鼠置入束縛筒內(nèi)束縛制動1次,要求動物無身體的擠壓和疼痛感,能從仰臥位轉(zhuǎn)為俯臥位,但頭尾不能翻轉(zhuǎn),束縛期間禁食禁水。每日開始時間及束縛制動的持續(xù)時間不同,第1天為2 h,其后每次增加10 min,連續(xù)28 d。實驗第15天開始每日激發(fā)前2 h均予0.9%氯化鈉溶液灌胃和霧化吸入。②普米克令舒組:在心理應(yīng)激哮喘大鼠模型的基礎(chǔ)上,從實驗第15天開始每日激發(fā)前2 h給予普米克令舒363.11 μg/kg霧化吸入,1次/d,30 min/次,連續(xù)14 d;同時每日給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。③哮喘寧組:在心理應(yīng)激哮喘大鼠模型的基礎(chǔ)上,從實驗第15天開始每日激發(fā)前2 h給予哮喘寧顆粒2.18 g/kg灌胃,1次/d,連續(xù)14 d。④正常組:致敏和激發(fā)均以0.9%氯化鈉溶液代替,但不做束縛刺激。每日激發(fā)前2 h均予0.9%氯化鈉溶液灌胃和霧化吸入。

1.2.3 各組大鼠宏觀表征比較:包括大鼠體重、飲食量及呼吸頻率變化等。

1.2.4 各組大鼠行為學(xué)變化比較:包括蔗糖水偏嗜實驗、懸尾實驗、曠野實驗等。①蔗糖水偏嗜實驗:實驗前,訓(xùn)練實驗大鼠適應(yīng)含糖飲水。每籠同時并排放置2個飲水瓶,第1個24 h內(nèi),每瓶均裝有1%蔗糖水;隨后的24 h,1瓶裝1%蔗糖水,另1瓶裝純凈水。經(jīng)過24 h禁水禁食后,開始進(jìn)行蔗糖水偏嗜實驗:即同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水,1瓶為1%蔗糖水,1瓶為純凈水,水瓶左、右隨機(jī)放置,1 h后取走并稱重。糖水偏好程度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。②懸尾實驗:操作者握住大鼠的尾根部1/3處,將大鼠頭部向下,固定在懸尾實驗架上,由兩位實驗人員進(jìn)行操作和記錄,每只大鼠觀察3 min,主要觀察大鼠不動時間和掙扎次數(shù)。不動時間指大鼠處于完全放松靜止不動狀態(tài)的累積時間。掙扎次數(shù)指大鼠由倒掛向上翻轉(zhuǎn)的總次數(shù)。③曠野實驗:用open-field test法進(jìn)行測試。自制敞箱,底面為80 cm×80 cm正方形,劃分為25等格,箱高40 cm。以大鼠穿越底面塊數(shù)(四爪均進(jìn)入的方格方可計數(shù))為水平運(yùn)動得分,以直立次數(shù)(雙足離開底面至放下為1次活動)為垂直運(yùn)動得分。保持環(huán)境安靜,調(diào)節(jié)合適光線,每次測試前清潔敞箱,去除異味。分別在造模前、取材前1 d由兩位評定者評定大鼠在3 min內(nèi)的運(yùn)動情況。

1.2.5 各組大鼠肺通氣功能比較:大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,從環(huán)狀軟骨下第2～3個U形透明軟骨間切一橫形切口,進(jìn)行氣管切開插管,連接動物肺功能儀,并將大鼠放入密封體描箱中進(jìn)行肺通氣功能測定。觀察大鼠呼氣峰流速(PEF)、呼氣中期峰流速(FEF25%～75%)、用力呼氣時間(FET)、FEV0.3/FVC、平均吸氣氣道阻力(Ri)、平均呼氣氣道阻力(Re)等指標(biāo)。

1.2.6 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察:從肺門至肺邊緣處橫切,取2～3 cm肺標(biāo)本,進(jìn)行石蠟包埋和切片,然后進(jìn)行HE染色,觀察支氣管和肺組織病理形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠宏觀表征比較

2.1.1 各組大鼠體重比較:見表1。干預(yù)第14、21、28天,應(yīng)激哮喘組大鼠體重明顯低于正常組(均P<0.05);與應(yīng)激哮喘組比較,哮喘寧組大鼠干預(yù)第28天體重增加明顯(P<0.05);與普米克令舒組比較,哮喘寧組大鼠干預(yù)第28天體重輕度增加,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠體重比較(g)

2.1.2 各組大鼠飲食量比較:見表2。干預(yù)第14天,應(yīng)激哮喘組大鼠飲食量低于正常組(P<0.05);與應(yīng)激哮喘組相比較,哮喘寧組干預(yù)第21、28天飲食量明顯增加(均P<0.05)。

表2 各組大鼠飲食量比較(g)

2.1.3 各組大鼠呼吸頻率比較:見表3。在干預(yù)第21、28天,應(yīng)激哮喘組、哮喘寧組、普米克令舒組大鼠激發(fā)前、后呼吸頻率明顯高于正常組(均P<0.05);與應(yīng)激哮喘組比較,哮喘寧組、普米克令舒組激發(fā)前呼吸頻率無明顯變化(均P>0.05),激發(fā)后呼吸頻率明顯減少(均P<0.05)。

表3 各組大鼠呼吸頻率比較(次/min)

2.2 各組大鼠行為學(xué)比較

2.2.1 各組大鼠蔗糖水偏嗜實驗比較:見表4。在干預(yù)第7、22、28天,應(yīng)激哮喘組大鼠糖水消耗量及糖水偏好程度明顯低于正常組(均P<0.05);與應(yīng)激哮喘組大鼠相比,干預(yù)第22、28天,哮喘寧組、普米克令舒組大鼠糖水消耗量及糖水偏好程度明顯增高(均P<0.05);干預(yù)第28天,哮喘寧組大鼠糖水偏嗜程度高于普米克令舒組(P<0.05)。

表4 各組大鼠蔗糖水偏嗜實驗比較

2.2.2 各組大鼠懸尾實驗比較:見表5。在干預(yù)第28天,應(yīng)激哮喘組大鼠翻動次數(shù)明顯低于正常組(P<0.05),應(yīng)激哮喘組、哮喘寧組、普米克令舒組大鼠靜止時間明顯高于正常組(均P<0.05);與應(yīng)激哮喘組比較,哮喘寧組大鼠翻動次數(shù)明顯增加,靜止時間明顯增加(均P<0.05)。

表5 各組大鼠懸尾實驗比較

2.2.3 各組大鼠曠野實驗比較:見表6。在干預(yù)第28天,應(yīng)激哮喘組和普米克令舒組大鼠水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動得分明顯低于正常組(均P<0.05)。與應(yīng)激哮喘組比較,哮喘寧組小鼠垂直運(yùn)動得分明顯增加(P<0.05)。

表6 各組大鼠曠野實驗比較(分)

2.3 各組大鼠肺通氣功能指標(biāo)比較 見表7。干預(yù)第28天,應(yīng)激哮喘組FEF25%～75%、FEV0.3/FVC明顯低于正常組,FET、Ri明顯高于正常組(均P<0.05);與應(yīng)激哮喘組比較,哮喘寧組及普米克令舒組大鼠Ri、Re減低(均P<0.05);PEF、FEF25%～75%、FEV0.3/FVC輕度增高,FET輕度減低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表7 各組大鼠肺通氣功能指標(biāo)比較

2.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 見圖1。正常組大鼠支氣管被覆單層柱狀上皮,管腔內(nèi)未見黏液及脫落上皮細(xì)胞,管周未見炎細(xì)胞浸潤,支氣管上皮及管壁平滑肌組織未見增生;肺泡間隔未見增寬,無或有少數(shù)淋巴細(xì)胞浸潤。應(yīng)激哮喘組大鼠可見支氣管黏膜上皮杯狀細(xì)胞增多,管腔內(nèi)有分泌物,管壁平滑肌增生,管周淋巴細(xì)胞呈散在及灶片狀浸潤,肺泡間隔增寬,有淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤,靠近胸膜處肺泡明顯擴(kuò)張,肺泡間隔變窄斷裂,擴(kuò)張的肺泡融合形成較大的含氣囊腔,呈肺氣腫改變,肺泡壁毛細(xì)血管受壓。普米克令舒組大鼠支氣管黏膜上皮少見杯狀細(xì)胞,上皮輕度增生,腔內(nèi)未見明顯分泌物,管壁平滑肌稍增生,管周有散在淋巴細(xì)胞浸潤,肺泡壁有淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤,病變程度和咳喘寧組類似。哮喘寧組大鼠支氣管黏膜上皮杯狀細(xì)胞較應(yīng)激哮喘組減少,腔內(nèi)未見明顯分泌物,支氣管管壁平滑肌增生,管周有散在淋巴細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增寬,有淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色,×100)

3 討 論

哮喘是典型的心身疾病,其發(fā)生、發(fā)展與情志因素關(guān)系密切;全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)指出焦慮及抑郁為哮喘重要并發(fā)癥,對哮喘控制至關(guān)重要。因此,改善哮喘患者焦慮、抑郁水平對于哮喘控制有著重要意義。既往研究表明,慢性心理應(yīng)激可以較好地模擬情志異常的綜合病理過程,慢性心理應(yīng)激可明顯加重哮喘氣道炎癥[9-10],但尚無有效藥物或非藥物治療措施可顯著改善氣道炎癥,減少心理應(yīng)激哮喘發(fā)作[11]。

中醫(yī)理論認(rèn)為,“肝主疏泄”功能在機(jī)體心理應(yīng)激反應(yīng)中起著決定性的作用。肝的疏泄功能正常,則氣機(jī)調(diào)暢,氣血調(diào)和,心情舒暢,情志和合。反之,若情志失和則肝郁而不達(dá),氣血失調(diào),臟腑功能紊亂而產(chǎn)生各種心身疾患[12]。故《素問·舉痛論》曰:“百病生于氣也”,《丹溪心法》曰:“氣血沖和,萬病不生,一有怫郁,諸病生焉”。肝肺生理相關(guān),病理相因,支氣管哮喘從肝論治既符合中醫(yī)傳統(tǒng)理論,又具有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)基礎(chǔ),是治療哮喘的重要治法之一[13]?；诟沃魇栊埂⒏畏蜗嚓P(guān)理論,武維屏認(rèn)為肝失疏泄,氣機(jī)郁滯,肝肺失和為哮喘發(fā)作的中心環(huán)節(jié),提出調(diào)肝理肺法治療支氣管哮喘,并在長期臨床實踐過程中對其內(nèi)涵及療效機(jī)制做了全面闡釋和系統(tǒng)研究[14-15]。哮喘寧顆粒是調(diào)肝理肺法的代表方藥,臨床療效較好。既往臨床研究表明[16],哮喘寧治療支氣管哮喘的控顯率和總有效率分別為63.33%和90.00%。

本研究結(jié)果顯示哮喘寧顆?？擅黠@緩解應(yīng)激哮喘組大鼠呼吸氣促及應(yīng)激狀態(tài);哮喘寧組大鼠體重及飲食明顯增加。曠野實驗、懸尾實驗及蔗糖水偏嗜實驗是臨床研究中評價心理應(yīng)激的常用行為指標(biāo)[17]。高宗等[18]通過曠野實驗水平運(yùn)動得分、糖水消耗量等得出半夏厚樸湯對卒中后抑郁大鼠有改善作用;與此相似,本研究結(jié)果提示哮喘寧組大鼠水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動、蔗糖水偏嗜、掙扎次數(shù)均明顯增加,懸尾實驗不動時間明顯降低;且隨著用藥時間的延長,一般在治療3周后大鼠應(yīng)激水平可明顯改善;提示哮喘寧顆粒可改善模型大鼠心理應(yīng)激,減輕焦慮、抑郁,隨著治療時間延長,效果可能更加明顯。

哮喘為慢性氣道炎癥性疾病,哮喘發(fā)作時氣道分泌物增加、氣道痙攣,反復(fù)發(fā)作則氣道平滑肌增生,均會導(dǎo)致氣道阻力增大,喘憋明顯。研究認(rèn)為,中藥方劑可通過抑制炎性通路,減輕炎癥細(xì)胞在肺組織中的浸潤與聚集,從而控制哮喘大鼠氣道炎性反應(yīng),達(dá)到治療支氣管哮喘的目的[19-20]。應(yīng)激也可導(dǎo)致氣道阻力增加,炎性分泌物增多,氣道反應(yīng)性增高,加重哮喘癥狀[7]。因此緩解應(yīng)激癥狀,改善氣道阻力,可緩解哮喘癥狀。本研究結(jié)果顯示,與應(yīng)激哮喘組大鼠比較,哮喘寧組及普米克令舒組氣道阻力Re、Ri降低,Ri下降更明顯,提示哮喘寧顆粒及普米克令舒對氣道阻力,特別是中心氣道的阻力改善有較好的治療作用。哮喘寧組及普米克令舒組大鼠FEV0.3/FVC、FEF25%～75%、PEF相較于應(yīng)激哮喘組輕度升高,提示哮喘寧顆粒及普米克令舒對于模型大鼠小氣道的改善作用偏弱。臨床研究顯示,中醫(yī)藥治療支氣管哮喘可顯著改善患者肺功能和通氣情況,并降低氣道炎癥[21];哮喘嚴(yán)重程度與肺通氣功能呈明顯負(fù)相關(guān),與血清炎癥水平呈明顯正相關(guān)[22],這與本研究結(jié)果相似。本研究組織病理學(xué)觀察顯示,相較于應(yīng)激哮喘組,哮喘寧組大鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。

綜上所述,哮喘寧顆?？删徑庑睦響?yīng)激哮喘大鼠應(yīng)激狀態(tài),改善氣道平滑肌痙攣,降低氣道阻力,減輕氣道炎癥浸潤,改善肺通氣功能。