呂艷 鄭旭 韓燕燕 高珊 李翀 耿強

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心（天津 300381）

乳腺癌是全球范圍內(nèi)最常見的女性惡性腫瘤，在我國乳腺癌發(fā)病率已居女性惡性腫瘤首位［1］，探索乳腺癌發(fā)生機制對實現(xiàn)個體化治療乳腺癌具有非常重大的意義。CCN5 又稱WISP-2（Wnt-1 induced secreted proteins-2， Wnt 誘導(dǎo)分泌蛋白2）因子，在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞粘附和轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用［2-4］。有關(guān)CCN5 調(diào)控乳腺癌細胞增殖機制尚未明確。本研究擬構(gòu)建CCN5siRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞MCF-7，觀察乳腺癌細胞增殖能力變化，檢測CCN5、Skp2和p27Kip1 mRNA 和蛋白表達，探索乳腺癌發(fā)生的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MCF-7 購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。MTT 細胞增殖及毒性檢測試劑盒、Western blot 相關(guān)試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司。RNA prep pure 培養(yǎng)細胞總RNA 提取試劑盒（離心柱型）、Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒以及SYBR Green PCR 試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。CCN5siRNA慢病毒載體由北京合生基因生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)高糖DMEM 不全培基、1 ×105U/L 青霉素 、100 mg/L 鏈霉素及l(fā)0 %滅活胎牛血清，組成完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)MCF-7 細胞。將MCF-7 細胞置于5 % CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每3 天傳代1 次。取對數(shù)生長期的MCF-7 細胞用于實驗研究。

1.2.2 構(gòu)建CCN5 基因敲降細胞用完全培養(yǎng)基稀釋MCF-7 為3 × 104～ 5 × 104個/mL，接種2 mL 細胞懸液至6 孔板中。保持細胞狀態(tài)良好，形態(tài)清晰、生長正常、無任何污染。細胞接種24 h 后，更換1 mL 轉(zhuǎn)染液，含有15 μL CCN5siRNA 慢病毒質(zhì)粒（濃度1.38 × 108U/ml， MOI = 10），200 μL Poly-Brene（助轉(zhuǎn)染劑，濃度50 μg/mL），785 μL 高糖DMEM 完全培養(yǎng)基。更換轉(zhuǎn)染液8 h 后，再次更換為高糖DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后MCF-7 細胞形態(tài)，計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 MTT 實驗收集對數(shù)生長期MCF-7 細胞，調(diào)整細胞濃度為2 × 104個/mL，分于96 孔板，每孔100 μL，共9 孔。將MCF-7 細胞置于37 ℃，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h 后，分為3 組細胞，每組3 孔，即空白對照組，空載組和轉(zhuǎn)染組，分別給予3 組細胞不同的處理?？瞻讓φ战M：加入100 μL DMEM 培養(yǎng)基；空載組：加入1 μL 空質(zhì)粒（未攜帶CCN5 siRNA的慢病毒載體，病毒滴度3.73 × 108TU/mL），10 μL Polybrene 助轉(zhuǎn)染劑，89 μL DMEM 培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染組：加入1 μL 攜帶CCN5siRNA 的質(zhì)粒（攜帶CCN5siRNA 的慢病毒載體，病毒滴度1.34 × 108TU/mL），10 μL Polybrene助轉(zhuǎn)染劑，89 μL DMEM培養(yǎng)基。37 ℃，5% CO2孵育箱培養(yǎng)細胞12 h 后換液，加入100 μL DMEM培基，孵育72 h，棄上清，每孔加入90 μL 新鮮培養(yǎng)基，10 μL MTT，37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔加入100 μL Formazan 溶液，搖床低速震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測量吸光度值（OD）。

1.2.4 qRT-PCR 實驗從MCF-7 細胞中提取總RNA，核酸測定儀確認其OD（260）/OD（280）比值在1.8 ～ 2.0 之間，測定總RNA 濃度，計算gDNA反應(yīng)體系中所需的RNA 總量。gDNA 去除反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：5×gDNA Buffer 2 μL，Total RNA，RNase-Free ddH2O 補足反應(yīng)體系至10 μL，反應(yīng)條件：42 ℃，3 min，置于冰上。RT 反應(yīng)逆轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)體系如下： 10×King RT Buffer 2 μL， Fast King RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 補足反應(yīng)體系至10 μL，并與gDNA 去除反應(yīng)體系混合，形成20 μL 反應(yīng)體系。以β-actin檢測作為內(nèi)對照。

引物序列及反應(yīng)條件見表1。

1.2.5 Western blot實驗Western blot檢測CCN5、Skp2、P27Kip1 蛋白，分組同RT-PCR。 慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞48 h 后，以含0.25% 胰蛋白酶消化收集細胞，計數(shù)細胞濃度，加入1 mL PMSF/107個細胞，裂解20 ～ 30 min。在4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液，測蛋白濃度后，每個樣品蛋白終濃度均調(diào)整為2 μg/μL，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。將定量后的蛋白質(zhì)100 ℃加熱5 min，上樣、電泳，12% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜 90 min，1 mL 一抗（1∶4 000稀釋）4 ℃孵育過夜，棄一抗后加入1 mL辣根過氧化物酶標記二抗（1∶500 稀釋），室溫孵育2 h，漂洗、顯影、成像。以GDPDH 檢測作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0 軟件，計量資料采用Shapiro-Wilktest 正態(tài)性檢驗方法，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗和SNK 法；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞見圖1，CCN5 siRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞，被轉(zhuǎn)染細胞達到80%以上，熒光強度適中。觀察細胞形態(tài)良好：細胞平鋪，舒展，融合度達到70%以上。

圖1 熒光標記的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞Fig.1 Fluorescencly labeled lentiviral vector were transfected into MCF-7 cells

圖2 CCN5siRNA 轉(zhuǎn)染組與空載組MCF-7 細胞增殖抑制率對比Fig.2 Comparison of MCF-7 cell proliferation inhibition rate between CCN5siRNA transfection group and negative vector group

2.2 CCN5 基因敲降對MCF-7 細胞增殖活性的影響MTT 法檢測MCF-7 細胞增殖活性的變化。以細胞增殖抑制率顯示細胞增殖活性，細胞增殖抑制率=（1-干預(yù)組OD值/對照組OD值）× 100%。MTT 結(jié)果顯示：與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力受到抑制（P＜ 0.05）?？蛰d組細胞增殖能力與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），空白對照組細胞增殖抑制率為0。實驗結(jié)果見2。

2.3 CCN5 基因敲降對Skp2、p27Kip1mRNA 水平的影響與對照組和空載組相比，轉(zhuǎn)染組CCN5 mRNA 水平下降（P＜ 0.05），轉(zhuǎn)染組Skp2mRNA 水平高于對照組和空載組（P＜ 0.05），而轉(zhuǎn)染組P27Kip1mRNA水平低于空載組和對照組（P＜ 0.05）。以上結(jié)果提示，CCN5抑制Skp2mRNA 表達，Skp2對P27Kip1mRNA 表達也存在抑制作用，即CCN5mRNA表達水平下降，失去對Skp2mRNA表達抑制，高表達Skp2mRNA 抑制P27Kip1mRNA 表達。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 RT-PCR 法檢測各組CCN5、Skp2p 及27Kip1 mRNA 表達水平Tab.2 mRNA expression levels of CCN5， Skp2p and 27Kip1 by RT-PCR ±s

表2 RT-PCR 法檢測各組CCN5、Skp2p 及27Kip1 mRNA 表達水平Tab.2 mRNA expression levels of CCN5， Skp2p and 27Kip1 by RT-PCR ±s

組別CCN5siRNA轉(zhuǎn)染組空載組空白對照組CCN5 0.76 ± 0.08 1.62 ± 0.09 1.54 ± 0.14 Skp2 1.82 ± 0.08 0.65 ± 0.07 0.67 ± 0.08 p27Kip1 0.66 ± 0.09 1.67 ± 0.11 1.63 ± 0.07

2.4 CCN5 基因“敲降”對Skp2、p27Kip1 蛋白水平的影響見圖3，在轉(zhuǎn)染組、空載組和空白對照組之間CCN5、Skp2 和p27Kip1 蛋白電泳條帶深淺不同。蛋白電泳條帶的灰度數(shù)據(jù)分析結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示：與空載組和對照組相比，轉(zhuǎn)染組CCN5蛋白水平降低（P＜ 0.05），轉(zhuǎn)染組Skp2 蛋白水平則呈現(xiàn)上升（P＜ 0.05），轉(zhuǎn)染組p27Kip1 蛋白水平下降（P＜ 0.05）。

圖3 Western blot 檢測MCF-7 細胞CCN5、Skp2 和p27Kip1蛋白表達電泳圖Fig.3 Western blot analysis of CCN5， Skp2， and p27Kip1 protein expression in MCF-7 cells

圖4 CCN5 基因敲降對Skp2、p27Kip1 蛋白表達的影響Fig.4 Influence of CCN5 gene knock down on Skp2 and p27Kip1 protein expression

3 討論

CCN 家族是最近發(fā)現(xiàn)的一個基因家族，CCN5又稱WISP-2（Wnt-1 induced secreted proteins-2，Wnt-1 誘導(dǎo)分泌蛋白2）因子，是CCN 家族的6 種基質(zhì)蛋白之一，分子量為29KD 的抑癌基因，在誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制腫瘤細胞粘附和轉(zhuǎn)移等方面有重要作用［5-7］。

文獻研究表明：CCN5 與乳腺癌細胞侵襲能力之間存在線性調(diào)控關(guān)系，即CCN5 蛋白表達增加，乳腺癌細胞侵襲性減弱［8］，相反，CCN5 蛋白表達降低，乳腺癌細胞侵襲能力增強［9］，這些研究結(jié)果提示：CCN5 表達水平異常在惡性腫瘤發(fā)生和進展中扮演著重要角色。然而，目前還不清楚CCN5 是通過怎樣的分子機制調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲性和轉(zhuǎn)移。Skp2 通過對多種靶蛋白的泛素化降解而與細胞周期調(diào)控及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)［10-12］。Skp2 調(diào)控的靶點包括周期素依賴性激酶抑制物p27Kip1［13］。

本研究正是通過siRNA 干擾CCN5 基因的表達，采用MTT 法觀察MCF-7 細胞增殖活性的變化，并采用熒光定量RT-PCR 和Western blotting 檢測CCN5、Skp2 和P27Kip1 在mRNA 和蛋白水平的變化，探討CCN5 基因調(diào)控乳腺癌細胞增殖和侵襲的分子機制。

首先，MTT細胞毒性實驗表明：CCN5siRNA轉(zhuǎn)染組細胞增殖抑制率顯著升高，反證了CCN5對MCF-7細胞增殖有抑制作用。通過構(gòu)建CCN5siRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染MCF-7 乳腺癌細胞，熒光定量RTPCR 實驗結(jié)果表明：在mRNA 水平干擾CCN5基因表達，引起CCN5基因的mRNA 水平下調(diào)，并引起Skp2/P27Kip1通路基因水平的變化，例如：Skp2mRNA水平上調(diào)和P27Kip1mRNA水平下降，與空白對照組和陰性對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。而空白對照與陰性對照組織間無顯著性差異（P＜ 0.05）。

其次，本研究還在蛋白水平對CCN5 與Skp2/P27Kip1 通路的相關(guān)性作了探索和研究。Western blot 結(jié)果表明：CCN5siRNA 組的Skp2 蛋白水平比空白對照組和陰性對照組均升高，提示CCN5 基因被“敲除”后，其相關(guān)調(diào)控蛋白Skp2 上調(diào)，與此同時，P27Kip1 蛋白和mRNA 水平下調(diào)，提示Skp2 水平受到上調(diào)后，抑制下游P27Kip1 蛋白和mRNA 水平。CCN5/Skp2/P27Kip1 通路在乳腺癌細胞增殖調(diào)控中具有微觀抑制的作用，當(dāng)CCN5 水平下降時，這種微觀抑制被“解除”，細胞增殖、分裂無限循環(huán)，分化降低，非典型增生，乳腺癌發(fā)生。并且，MTT 細胞增殖能力實驗結(jié)果也提示，CCN5siRNA組細胞增殖活性增強，高于空白對照組和陰性對照組（P＜ 0.05），而空白對照組與陰性對照組之間無顯著差異（P＞ 0.05）。

既往有研究表明，CCN5 是一種抑癌基因，在侵襲力和轉(zhuǎn)移力強的乳腺癌細胞株的表達水平較低，例如，CCN5mRNA 和蛋白表達水平在MDA-MB-231、MDA-MB-468 表達水平低于MCF-7 細胞［14-15］，提示CCN5 基因與抑制乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。近年有研究表明：CCN5 對癌細胞增殖調(diào)控的作用取決于激素水平和微環(huán)境變化。例如：雌激素和孕激素可能通過WISP2/IGF1 信號通路刺激子宮蛻膜間質(zhì)細胞的生長［16］，而CCN5 能抑制血管平滑肌細胞以及三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231 的增殖［17-18］。研究表明，CCN5 表達與乳腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌的侵襲性呈負相關(guān)，表明CCN5 具有抑制腫瘤侵襲和生長的活性［19-20］，并且，CCN5在乳腺癌進展過程中顯示升高的水平［21］，這從一個側(cè)面證實了CCN5 與乳腺癌進展的正相關(guān)。

CCN5 表達由雌激素以及雌激素受體陽性細胞中的表皮生長因子和胰島素樣生長因子誘導(dǎo)，CCN5 是雌激素誘導(dǎo)和胰島素樣生長因子誘導(dǎo)的增殖所必需的［22-23］。因此，CCN5 與激素受體相關(guān)的增殖調(diào)控將成為進一步關(guān)注的焦點。另外，CCN5 是否影響HER-2 陽性乳腺癌化療后病理緩解因素是課題組感興趣的研究熱點［24-25］。

本研究通過反證法，即：采用CCN5siRNA 慢病毒體外轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞，實現(xiàn)敲降CCN5 基因的目的，隨后觀察乳腺癌細胞增殖能力變化，檢測Skp2、P27Kip1 等下游被CCN5 調(diào)控基因的mRNA 和蛋白表達水平，探索CCN5 基因調(diào)控乳腺癌細胞MCF-7增殖能力的作用機制。研究結(jié)果說明：CCN5 基因通過下調(diào)Skp2 表達和上調(diào)P27Kip1 表達，抑制乳腺癌細胞增殖，提示CCN5 可能是抑制乳腺癌細胞增殖的靶點之一，所以，本研究為探索乳腺癌分子靶向治療奠定了分子機制基礎(chǔ)。

【Author contributions】LV Yan designed the study and wrote the article. GAO Shan ， HAN Yan， ZHENG Xu and GENG Qiang performed the experiments. Li Chong reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.