劉海英 陳峰 姚嘉

海南省人民醫(yī)院1乳腺外科，2綜合介入科（?？?570000）

乳腺癌是婦女最常見的癌癥，全世界每8 名婦女中約有1 例有患乳腺癌的累積風(fēng)險(xiǎn)［1］。乳腺癌也是婦女癌癥死亡的主要原因，占癌癥病例的25%，占癌癥相關(guān)死亡的15%［2］。多數(shù)乳腺癌病例在早期是可以治療的，但約有20% ～ 30%患者的癌細(xì)胞會(huì)從原發(fā)部位擴(kuò)散到其他部位，如骨骼、腦、遠(yuǎn)處結(jié)節(jié)、肝、肺和胸膜轉(zhuǎn)移［3-6］。目前臨床上對(duì)于乳腺癌的治療方法主要包括化療和放療等非特異性的治療方法，缺乏針對(duì)性的治療方法。因此，需要找到新的治療靶點(diǎn)用于乳腺癌的治療。

miRNAs 是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵分子，能夠影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。在癌癥中，許多miRNAs 作為致癌基因或腫瘤抑制劑發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、入侵和血管生成［7］。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin like growth factor，IGF1）是一種調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育的小多肽，在癌癥的發(fā)展中具有多種生物學(xué)效應(yīng)，能調(diào)節(jié)干細(xì)胞、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞代謝和血管生成等［8］。在乳腺癌中，IGF1能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，其高表達(dá)與乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，因此IGF1 有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)［9］。本實(shí)驗(yàn)室前期通過生物信息學(xué)方法篩選出差異表達(dá)的miRNA 即miR-767-5p 顯著上調(diào)及預(yù)測(cè)靶基因?yàn)镮GF1，并通過實(shí)驗(yàn)證明miR-767-5p 與IGF1靶向結(jié)合［10］。本研究以差異表達(dá)最明顯的乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）為研究對(duì)象，以miR-767-5p為切入點(diǎn)，觀察抑制miR-767-5p的表達(dá)對(duì)乳腺癌增殖、侵襲和EMT的影響，探討其對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移和 EMT的作用及分子機(jī)制，為尋找新的乳腺癌治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料MEM 培養(yǎng)基，胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco；MEM Non-Essential Amino Acids Solution（NEAA）購(gòu)自美國(guó)invitrogen；Sodium Pyruvate 購(gòu)自日本Sigma；完全培養(yǎng)基：MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%NEAA+1%Sodium Pyruvate+終濃度為0.01 mg/mL 的insulin；PBS 和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)TBD；重組人胰島素溶液購(gòu)自武漢普諾賽生命科技；結(jié)晶紫購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)；甲醛購(gòu)自上海麥克林生化科技；Lipofectamine2000 購(gòu)自上海一基生物科技；matrigel 購(gòu)自吉林吉春制藥；Tween-20 和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液，十二烷基硫酸鈉（SDS ），TEMED ，過硫酸銨購(gòu)自北京索萊寶科技；蛋白質(zhì)Marker 購(gòu)自Biohelix；E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、IGF1、GAPDH 一抗和Goat anti-Rabbit IgG 二抗購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技；MCF-7 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MCF-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)接至完全培養(yǎng)基中在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。在80% ～ 90%的細(xì)胞密度下，0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證根據(jù)miR-767-5p 序列（UGCACCAUGGUUGUCUGAGCAUG），分別合成miR-767-5p inhibitor、inhibitor-NC，使用Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。正常細(xì)胞作為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-767-5p inhibitor 作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染inhibitor-NC 作為陰性對(duì)照組，采用熒光染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力將細(xì)胞按照5 000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中，分別培養(yǎng)24、36、48、60 和72 h 后向孔中加入10 μL CCK-8試劑，并于37 ℃下培養(yǎng)6 h。使用微板讀數(shù)器測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)下的光密度。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力在試驗(yàn)開始前24 h，用無血清培養(yǎng)液替換培養(yǎng)各組別的細(xì)胞。在接種之前，用 PBS 將24 孔板及 Transwell小室浸泡5 min。將80 μL matrigel 凝膠涂于小室內(nèi)，37 ℃ 培養(yǎng)30 min。消化細(xì)胞接種到Transwell小室內(nèi)，下層的24 孔板中加入0.75 mL 含10% FBS 的培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。PBS清洗后加入1 mL 4%甲醛溶液，室溫固定20 min。吸去固定液，PBS 洗滌后加入1 mL 0.5%結(jié)晶紫溶液，染色30 min 后，使用棉簽將 Transwell 小室沒有遷移的細(xì)胞擦去后將其放置于200 ×顯微鏡下，對(duì)其進(jìn)行觀察，并對(duì)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力先用marker筆在6 孔板背后，豎著均勻畫線。在每孔中加入1 × 106個(gè)細(xì)胞，次日用槍頭在背后的直線垂直劃痕。用PBS 沖洗去除劃下的細(xì)胞，按照不同分組處理細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液在37 ℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在0、48 h 分別拍照，在0、48 h 分別拍照，在拍照的時(shí)候，將畫線和劃痕的交點(diǎn)作為觀察點(diǎn)，定點(diǎn)觀察。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-767-5p和IGF1 的結(jié)合將野生型（WT）或突變型（MUT）IGF1 的3′UTR 擴(kuò)增并克隆到pmirGLO 載體中。然后，將HEK293T 細(xì)胞接種在96 孔板上，并與WT 或MUT 螢光素酶質(zhì)粒和miR-767-5p 或?qū)φ誱iRNA共轉(zhuǎn)染。使用雙熒光素酶報(bào)告物測(cè)定系統(tǒng)來測(cè)量熒光素酶活性。

1.2.7 IGF1 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)用 Trizol 法提取總RNA，Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 并進(jìn)行qPCR 檢測(cè)IGF1 相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH 為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。其引物序列如下：IGF1（F：5′-TGTCCTCCTCGCATCTCTTCT-3′；R：5′-CCATACCCTGTGGGCTTGT-3′）；GAPDH（F：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′；R：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′）。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)取出培養(yǎng)箱中的細(xì)胞，將培養(yǎng)液吸去后，對(duì)預(yù)冷的PBS 進(jìn)行兩次洗滌，然后按照每1 × 106個(gè)細(xì)胞加入200 μL 裂解液的比例加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后每孔上樣20 μg 蛋白。制備SDS-PAGE 凝膠并電泳，使用PVDF 膜濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜。一抗E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、IGF1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）和膜室溫孵育1 h。用PBST 清洗3 次，每次5 min。隨后1∶10 000 稀釋二抗（含HRP 標(biāo)記），再次孵育清洗。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)，并通過TANON GIS 軟件讀取條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)資料以SPSS 19.0軟件為主要工具進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±s表示。兩組間樣本采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)有無綠色熒光判斷轉(zhuǎn)染是否成功。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，miR-767-5p inhibitor 和inhibitor-NC 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)均可見綠色熒光，Control 組無熒光信號(hào)，表明miR-767-5p inhibitor 和inhibitor-NC 均能成功轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（100 ×）Fig. 1 Transfection efficiency with a fluorescence microscope（100 ×）

2.2 抑制miR-767-5p的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和inhibitor-NC組相比，miR-767-5p inhibitor 組顯著抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖（P＜ 0.05），見圖2。

圖2 抑制miR-767-5p 的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig. 2 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cellular proliferation of MCF-7 cells

2.3 抑制miR-767-5p的表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響由侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Control 組侵襲細(xì)胞數(shù)為（245.33 ± 5.69）個(gè)，miR-767-5p inhibitor組、inhibitor-NC 組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（128.67 ± 6.35）、（248.67 ±8.33）個(gè)。與Control 組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 組對(duì)MCF-7 細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 抑制miR-767-5p 的表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響Fig. 3 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cellular invasion of MCF-7 cells

2.4 抑制miR-767-5p的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響劃痕試驗(yàn)顯示，劃痕48 h 后，miR-767-5p inhibitor組對(duì)MCF-7 細(xì)胞的遷移較Control 組和inhibitor-NC組存在明顯的抑制作用，見圖4。

圖4 抑制miR-767-5p 的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響Fig. 4 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cell migration of MCF-7 cells

2.5 抑制miR-767-5p 的表達(dá)對(duì)遷移相關(guān)蛋白MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達(dá)的影響與Control組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染組的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05），Control 組和inhibitor-NC 組的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），進(jìn)一步表明miR-767-5p inhibitor 可以抑制MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)。見圖5。

圖5 MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達(dá)水平Fig. 5 The protein expression levels of MMP-2 and MMP-9

2.6 miR-767-5p 和IGF1 的靶向結(jié)合關(guān)系TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-767-5p 和IGF1 具有結(jié)合位點(diǎn)（圖6A）。RT-qPCR 檢測(cè)敲除miR-767-5p 后，IGF1 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，敲除miR-767-5p 后，IGF1 的表達(dá)水平顯著升高（圖6B）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與pLUC-IGF1-mut 共轉(zhuǎn)染時(shí)，突變體3′-UTR 載體的活性不受miR-767-5p mimics 同時(shí)轉(zhuǎn)染的影響（圖6C）。

圖6 乳腺癌中miR-767-5p 和IGF1 的靶向結(jié)合Fig.6 Targeted binding of miR-767-5p and IGF1 in breast cancer

2.7 抑制miR-767-5p 的表達(dá)對(duì)IGF1 表達(dá)的影響與Control 組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染組IGF1 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05），Control 組和inhibitor-NC 組的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），這表明miR-767-5p inhibitor 可以抑制IGF1 的表達(dá)。見圖7。

2.8 抑制miR-767-5p 的表達(dá)對(duì)EMT 相關(guān)蛋白Ecadherin 和N-cadherin 表達(dá)的影響與Control 組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 組顯著提高E-cadherin 蛋白表達(dá)（P＜ 0.05），顯著降低N-cadherin蛋白表達(dá)（P＜ 0.05），Control組和inhibitor-NC 組的E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），這進(jìn)一步表明miR-767-5p inhibitor 可以影響E-cadherin 和N-cadherin 的表達(dá)。見圖8。

圖8 E-cadherin 和N-cadherin 的蛋白表達(dá)水平Fig. 8 The protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin

3 討論

癌癥在全球所有疾病中病死率居第2 位，僅次于心腦血管疾病，90%的癌癥死亡是由于腫瘤轉(zhuǎn)移引起的［11］。其中乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是導(dǎo)致婦女疾病死亡的主要原因［12］。乳腺癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，細(xì)胞自身可以通過血管生成獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣，然后轉(zhuǎn)移到其他新組織形成繼發(fā)性腫瘤，增加乳腺癌治療的難度。轉(zhuǎn)移性乳腺癌5 年的生存率為25% ～ 30%，預(yù)后較差［13］。因此需要迫切找到治療乳腺癌的靶點(diǎn)，miRNA 能調(diào)節(jié)基因表達(dá)，許多miRNAs 作為致癌或抑癌基因發(fā)揮作用，本課題組確定miR-767-5p 在乳腺癌中異常表達(dá)，先前研究發(fā)現(xiàn)，miR-767-5p 通過靶向SUZ12 抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖和轉(zhuǎn)移［14］；LINC-PINT通過下調(diào)miR-767-5p 誘導(dǎo)TET2 表達(dá)抑制甲狀腺癌癥侵襲性［15］；Circ-SMARCA5 靶向miR-767-5p 抑制多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展［16］；CircNOL10 通過吸收miR-767-5p 調(diào)節(jié)SOCS2/JAK/STAT 信號(hào)抑制乳腺癌癥進(jìn)展［17］，以上研究提示miR-767-5p 在多種癌癥中均發(fā)揮作用。癌細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要組成成分，是腫瘤癌癥患者死亡的主要原因［18-19］。抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲可以延緩腫瘤的惡化［20］。在本實(shí)驗(yàn)中，Transwell 和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-767-5p 抑制劑后，乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力被抑制。這表明抑制miR-767-5p的表達(dá)通過抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞通過血管生成積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)EMT，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤周圍血管壁較弱，使其易進(jìn)入血液和轉(zhuǎn)移。研究表明，與良性腫瘤相比，惡性腫瘤周圍新血管數(shù)量明顯增加［21］。EMT 是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，能有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、耐藥和增殖。EMT 改變了腫瘤細(xì)胞的類型，提高了腫瘤細(xì)胞降解基質(zhì)的能力，削弱了腫瘤胞間結(jié)合力，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)，存活率升高。EMT 能夠使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶，形成新的繼發(fā)轉(zhuǎn)移灶［22-23］。無數(shù)實(shí)驗(yàn)證明EMT 使上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin 表達(dá)下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin 表達(dá)增加［24-26］。本研究中，轉(zhuǎn)染miR-767-5p 抑制劑后乳腺癌細(xì)胞中E-cadherin 蛋白的表達(dá)上調(diào)，N-cadherin 蛋白的表達(dá)下調(diào)。此外，轉(zhuǎn)染miR-767-5p抑制劑后MMP-2和MMP-9 蛋白表達(dá)水平以及IGF1 的蛋白和mRNA表達(dá)水平均下調(diào)。這一結(jié)果表明，抑制miR-767-5p 的表達(dá)可能通過抑制IGF1 抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并由此抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

綜上所述，抑制miR-767-5p 的表達(dá)能抑制IGF1 的表達(dá)，阻斷乳腺癌細(xì)胞EMT 過程并抑制其侵襲和遷移。miR-767-5p 可能成為乳腺癌治療的潛在靶標(biāo)，有望用于乳腺癌轉(zhuǎn)移治療臨床應(yīng)用。

【Author contributions】LIU Haiying performed the experiments and wrote the article. CHEN Feng performed the experiments. LIU Haiying and YAO Jia revised the article. LIU Haiying designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.