莊趙為 袁武梅 任作東 李上飛 陳明貴 曾妍，

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室（新疆石河子 832002）；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬湛江中心醫(yī)院精準醫(yī)學(xué)檢驗實驗室（廣東湛江 524037）

乳腺癌的發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢，到2020 年全球約有1 930 萬新發(fā)癌癥病例，乳腺癌成為全球女性最常見的癌癥，乳腺癌的癌癥相關(guān)死亡排名為第五名［1］。2020 年中國約有82 萬新發(fā)癌癥病例，乳腺癌的新發(fā)病例數(shù)約42 萬，成為中國第四大常見癌癥［2］。

顆粒酶B 和穿孔素主要表達于細胞毒性T 淋巴細胞（CD8+T）和自然殺傷細胞（NK），在促進腫瘤細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。顆粒酶B 介導(dǎo)的凋亡作用通常需要穿孔素的協(xié)同，穿孔素首先破壞靶細胞的膜，形成孔道，顆粒酶B 通過孔道進入靶細胞誘導(dǎo)其凋亡［3-6］。顆粒酶B 和穿孔素的檢測多數(shù)采用免疫組化、ELISA 的方法檢測組織或外周的表達量，未涉及具體免疫細胞中的表達情況。

本研究利用流式細胞術(shù)檢測乳腺良性疾病和乳腺癌患者外周血CD3+T 細胞、CD8+T 細胞及NK細胞中顆粒酶B 和穿孔素的表達情況，旨在探究顆粒酶B 及穿孔素在免疫細胞中的作用及臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2023 年1-6 月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬湛江中心醫(yī)院首診住院治療的女性乳腺癌患者108 例為腫瘤組，平均年齡（53.31 ± 9.59）歲；收集同期住院70 例女性乳腺良性疾病患者為對照組，平均年齡（38.00 ± 9.52）歲。收集乳腺癌患者外周血并檢測T 淋巴細胞亞群及NK 細胞中顆粒酶B 和穿孔素的表達，收集乳腺癌患者雌激素受體（estrogen receptor， ER）、孕激素受體（progesterorne receptor， PR）、人表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor 2， HER-2）、Ki67、分子分型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期等臨床資料。收集22 例乳腺癌患者治療前血樣和102 例乳腺癌患者治療后血樣。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬湛江中心醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者知曉本次研究，倫理審批號：PJ［IIT-2021-007-02］。

1.2 儀器與試劑貝克曼流式細胞儀購自美國Beckman-Coulter 公司，熒光單克隆抗體試劑、溶血劑、固定劑及破膜劑均為青島瑞斯凱爾生物科技有限公司。

1.3 實驗方法采集患者外周血2 ～ 5 mL，肝素抗凝，在24 h 內(nèi)盡快檢測。流式細胞術(shù)檢測顆粒酶B 和穿孔素步驟：（1）向管底加入CD45、CD3、CD8、CD16、CD56 試劑25 μL；（2）用微量移液器吸取50 μL 全血加入管底，避免樣本碰到管壁；（3）渦旋混勻5 s，室溫避光孵育20 min；（4）加入1×溶血劑450 μL，室溫避光裂解15 min；350 ×g離心5 min棄掉上清；（5）加入120 μL 固定劑，渦旋后，靜置避光孵育20 min；（6）加入1×PBS 緩沖液300 μL，渦旋后，350 ×g離心5 min 后棄掉上清；（7）加入1×破膜劑2 mL，渦旋混勻后，避光孵育20 min 后350 ×g離心5 min 棄掉上清；（8）加入顆粒酶B 或穿孔素抗體10 μL，渦旋后，避光靜置20 min；（9）加入1×PBS緩沖液300 μL，打開流式細胞儀上機模板，流式管渦旋后上機檢測，檢測結(jié)果通過流式細胞儀分析軟件自動分析獲得。以顆粒酶B 或穿孔素陽性率表示顆粒酶B 或穿孔素的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料為非正態(tài)分布，以中位數(shù)表示，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗。采用受試者工作特征（ROC）曲線探究診斷價值。統(tǒng)計繪圖選用GraphPad Prism 8.0.2 進行制作。P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血T 淋巴細胞亞群及NK 細胞中顆粒酶B 與穿孔素陽性率比較腫瘤組CD3+T 細胞、CD8+T 細胞及NK 細胞中顆粒酶B 和穿孔素陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05），見圖1。

圖1 比較腫瘤組和對照組顆粒酶B 和穿孔素的表達水平Fig.1 Comparison of the expression levels of granzyme B and perforin between the tumor group and the control group

2.2 外周血T 淋巴細胞亞群及NK 細胞中顆粒酶B 與穿孔素陽性率診斷乳腺腫瘤ROC 曲線根據(jù)ROC 曲線顯示，CD3+T 細胞、CD8+T 細胞及NK 細胞中顆粒酶B 與穿孔素陽性率預(yù)測乳腺腫瘤良惡性的曲線下面積（AUC）均大于0.5，見表1。對于預(yù)測乳腺腫瘤良惡性均具有很好的價值，見圖2。

表1 外周血T 細胞和NK 細胞中顆粒酶B 和穿孔素的ROC 曲線Tab.1 ROC curve of granzyme B and perforin in peripheral blood T cells and NK cells

圖2 外周血T 細胞及NK 細胞中顆粒酶B 和穿孔素陽性率預(yù)測乳腺腫瘤良惡性ROC 曲線Fig.2 ROC curve of granzyme B and perforin positive rate in peripheral blood T cells and NK cells to predict benign and malignant breast tumors

2.3 乳腺癌患者T 淋巴細胞亞群及NK 細胞中顆粒酶B 和穿孔素的表達與臨床病理特征的相關(guān)分析83 例乳腺癌患者樣本中，隨著腫瘤增大，CD3+T 細胞和CD8+T 細胞中顆粒酶B 陽性率顯著升高（P＜ 0.05）；CD3+T 細胞中穿孔素陽性率也顯著升高（P＜ 0.05）。CD3+T 細胞中顆粒酶B 和穿孔素陽性率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于未轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。CD3+T 細胞、CD8+T 細胞中顆粒酶B 陽性率在不同TNM 分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），此外CD3+T 細胞中穿孔素陽性率在不同TNM 分期中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表2。

表2 外周血中顆粒酶B 和穿孔素陽性率與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between the positive rate of granzyme B and perforin in peripheral blood and clinical pathological characteristics

2.4 乳腺癌患者治療前后外周血中顆粒酶B 和穿孔素陽性率的變化乳腺癌患者治療后外周血CD3+T 細胞和CD8+T 細胞中顆粒酶B 和穿孔素陽性率均顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05），見表3。

表3 乳腺癌患者治療前后外周血中顆粒酶B 和穿孔素陽性率的變化Tab.3 Changes of positive rates of granzyme B and perforin in peripheral blood of breast cancer patients before and after treatment

3 討論

腫瘤免疫是通過全身免疫系統(tǒng)共同調(diào)控的［7］，當機體發(fā)生癌變時，免疫細胞的數(shù)量及功能會發(fā)生改變，顆粒酶B 和穿孔素是免疫細胞發(fā)揮殺傷功能的關(guān)鍵蛋白。CD3+T 細胞代表總T 細胞水平，CD3+CD8+T細胞為細胞毒性T細胞，CD3-CD16+CD56+細胞為NK 細胞，顆粒酶B 和穿孔素主要表達在細胞毒性T 淋巴細胞和自然殺傷細胞。顆粒酶B 和穿孔素在不同腫瘤中的表達不同，KADIN 等［8］發(fā)現(xiàn)在乳房假體周圍淋巴瘤中顆粒酶B 的表達高于皮下積液，故顆粒酶B 可以作為一種新的生物標志物，檢測惡性淋巴瘤，更好地判斷細胞的性質(zhì)。在非霍奇金淋巴瘤的鑒別診斷中，可用流式細胞術(shù)檢測顆粒酶B 和穿孔素的表達水平，鑒別T 細胞淋巴瘤和NK 細胞淋巴瘤中的亞型［9］。YUNUSOVA等［10］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者外周血NK 細胞中穿孔素和顆粒酶B 的表達高于健康人，故卵巢癌中顆粒酶B和穿孔素的高表達可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CHUNG 等［11］檢測肺癌血清中顆粒酶B 含量，發(fā)現(xiàn)顆粒酶B 在肺癌患者中低表達，在健康人群中高表達。也有文獻報道在結(jié)直腸癌腫瘤組織中顆粒酶B 高表達，在正常結(jié)腸黏膜組織低表達［12-14］。文獻報道主要檢測組織、外周血和腹水中總的顆粒酶B 和穿孔素的表達，未對具體細胞中顆粒酶B和穿孔素的表達進行檢測，本研究的創(chuàng)新點在于檢測外周血中CD3+T 細胞、CD8+T 細胞和NK 細胞中顆粒酶B 和穿孔素的表達，證明在乳腺癌外周血中，顆粒酶B 和穿孔素主要表達于細胞毒性T細胞和NK 細胞。結(jié)果顯示，與乳腺良性腫瘤相比，乳腺癌CD3+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞及NK細胞中顆粒酶B 和穿孔素表達均明顯升高，其原因是在生理情況下，靜止的CD8+T 細胞前體細胞內(nèi)顆粒酶B 和穿孔素的表達水平低，當機體內(nèi)發(fā)生癌變時，CD8+T 淋巴細胞被激活，釋放出大量的顆粒酶B 和穿孔素，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［15-16］。

檢測T 淋巴細胞亞群及NK 細胞中顆粒酶B和穿孔素的表達，發(fā)現(xiàn)其在乳腺良惡性病變中存在統(tǒng)計學(xué)差異，說明這些指標對于乳腺腫瘤良惡性診斷具有價值。通過構(gòu)建ROC 曲線，發(fā)現(xiàn)CD8+T 細胞顆粒酶B 陽性率的AUC 值最大，CD3+T細胞顆粒酶B 的特異性較強，而CD8+T 細胞中顆粒酶B 和穿孔素的靈敏度較高，綜合各項數(shù)據(jù)表明CD8+T 細胞中的顆粒酶B 同時具有較高的靈敏度和特異性，可以作為乳腺癌的協(xié)助診斷指標。

病理參數(shù)分析結(jié)果顯示，CD3+T 細胞中顆粒酶B 和穿孔素的表達與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，CD8+T 細胞中顆粒酶B 的表達也與腫瘤大小、腫瘤分期呈正相關(guān)。這與YUNUSOVA等［10］的研究結(jié)果一致，在結(jié)直腸癌外周血中NK 細胞中顆粒酶B 和穿孔素隨著腫瘤體積增大和淋巴結(jié)侵襲而升高。其原因是顆粒酶B 在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中，細胞外顆粒酶B 由于未被受體吸收，可能會進入到循環(huán)血中。本研究進一步收集乳腺癌患者治療前后血樣，檢測外周血中顆粒酶B 和穿孔素的表達，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者經(jīng)治療后外周血CD3+T 細胞和CD8+T 細胞中顆粒酶B 和穿孔素陽性率高于治療前，和KADAM 等［17］研究一致，Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌患者化療后顆粒酶B 的表達量高于化療前，說明臨床治療有效，有助于臨床醫(yī)生評估乳腺癌的治療效果。另有文獻報道，在結(jié)直腸癌的治療中，新輔助放化療患者與手術(shù)切除組比，CD8+T細胞中顆粒酶B明顯增加，總生存期更長［18］。朱月華等［19］研究結(jié)果也顯示放射療法聯(lián)合免疫治療的宮頸癌患者治療后外周血單個核細胞中顆粒酶B 和穿孔素的表達量高于治療前，并顯著高于單純放射療法組，聯(lián)合治療組的1、2 和5 年總生存率高于放療組，說明聯(lián)合治療后顆粒酶B 和穿孔素升高，患者的預(yù)后更好。以上文獻結(jié)果均說明腫瘤患者治療后顆粒酶B 和穿孔素升高，預(yù)后更好。對乳腺癌患者的治療方案進行分析，發(fā)現(xiàn)本研究納入治療組分析的乳腺癌患者治療方案中均包含紫杉醇類藥物，紫杉醇類藥物對腫瘤具有免疫刺激作用，故治療后乳腺癌患者外周血中CD3+T 細胞和CD8+T 細胞中顆粒酶B 和穿孔素高表達，可能是由于總T 細胞和細胞毒性T 細胞反應(yīng)增加［20］。

綜合以上結(jié)果，乳腺癌患者外周循環(huán)血中CD3+T 細胞和NK 細胞中的顆粒酶和穿孔素在乳腺疾病的良惡性診斷中具有參考價值，與腫瘤大小及轉(zhuǎn)移有關(guān)，可輔助臨床對乳腺癌治療的評價及預(yù)后的判斷。本研究仍需改進，可進一步擴大樣本量，從而避免存在選擇偏倚或者引起研究結(jié)果的誤差，后續(xù)需進一步擴增樣本量并對乳腺癌進行分類，繼續(xù)探究顆粒酶B 和穿孔素的臨床價值。

【Author contributions】ZHUANG Zhaowei performed the experiments and wrote the article. YUAN Wumei revised and polished the article.REN Zuodong， LI Shangfei and CHEN Minggui performed data collection and statistical analysis. ZENG Yan designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.