李佳維 徐濤 俞萬鈞 呂佳佩

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%[2-3]。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）作為一種非編碼RNA，能通過調節(jié)內源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）或miRNA，調節(jié)基因轉錄，與其他蛋白質相互作用影響惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。circRNA 的5'帽端和3'尾端形成特殊閉環(huán)結構對核酸外切酶具有內在的抵抗力[6]，可能是更準確和有效的新型生物標志物。研究證實circRNAs 參與肺癌發(fā)生、發(fā)展的調控，例如has_circ_0000190 為多種促致癌信號通路的介質，可以靶向抑制肺癌進展[7]；circ_NDUFB2 通過破壞IGF2BPs 和激活抗腫瘤免疫來抑制NSCLC 的進展[8]。

脂質代謝重編程會影響細胞功能，從而導致癌變[9]。棕櫚酸（C16:0，即含16 個碳原子的飽和脂肪酸）是動物中最豐富的飽和脂肪酸，可以作為其他脂質合成和β 氧化反應的底物。研究發(fā)現(xiàn)C16:0 可能參與黑色素瘤細胞轉移[10]，且與肝癌細胞轉移能力成正相關[11]。研究表明circRNAs 在脂質代謝中起重要作用[12]，但脂質如何影響circRNAs 的改變仍鮮有報道。

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者血清中C16:0 含量顯著降低，通過體內及體外實驗證實C16:0 能顯著抑制NSCLC 細胞增殖、遷移及侵襲，誘導細胞凋亡[13-14]。為進一步探究C16:0 抑癌機制，本研究構建C16:0 刺激細胞模型，通過circRNAs 高通量測序，篩選出腫瘤相關因子環(huán)狀含有DENN 結構域蛋白4C（circ_DENN domain-containing protein 4C，circ_DENND4C）。本研究結合脂質及circRNAs 組學，分析C16:0 抑制A549 細胞增殖、遷移和侵襲能力的作用及機制，為NSCLC 的治療提供了新靶點與思路。

1 材料和方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人NSCLC 細胞系A549（美國模式培養(yǎng)物集存庫）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco公司，規(guī)格：500 mL，批號：C11995500BT）；10%FBS（以色列BI 公司，批號：04001-1A）；100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素（美國Gibco 公司，100X，批號：15070063）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司，批號：25200114）；Opti-MEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號：10370070）；C16:0（德國Sigma 公司，批號：SLCC6727）；circRNAs 測序（中國上海美吉生物公司醫(yī)藥科技有限公司）；Trizol 試劑（美國SIGMA 公司，批號：T9424）；TransScript First strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（北京全式金生物技術股份有限公司，批號：AU34-02）；7500 實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；PerfectStart Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術股份有限公司，批號：AQ602-21）；circ_DENND4C 過表達載體（上海GenePharma 公司）；結晶紫（國藥集團化學試劑有限公司，批號C805211）；Lipofectamine 2000（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號：11668030）；TransDetect@Cell 計數(shù)套件（北京Trans 公司）；微板讀取器（美國cMax plus 公司）；Image J 軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）；Matrigel 基質膠（北京索萊寶科技有限公司，批號：356234）；光學顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) A549細胞接種于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3 d更換1次。使用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化以傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞測序分組和造模 將A549 細胞分為對照組和C16:0 組。C16:0 組為circRNAs 測序實驗組，采用C16:0 200 μmol/L 刺激A549 細胞；未做處理的A549 細胞作為對照組。每組3 個樣本，48 h 后提取總RNA，樣本RNA 送檢用于高通量circRNAs 轉錄組測序。

1.4 circRNAs 表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。使用Trizol 試劑裂解細胞提取總RNA，提取的總RNA 保存在4 ℃冰箱以備后續(xù)的反轉錄及實時定量PCR 使用。使用TransScript First strand cDNA Synthesis Super-Mix for PCR 將1 μg 總RNA 反轉錄成cDNA，反應條件如下：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。用Perfect-Start Green qPCR SuperMix 在實時PCR 系統(tǒng)上進行qRT-PCR，反應條件如下：94 ℃30 s，94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃10 s，共40 個循環(huán)，所有實驗重復3 次。以β-actin 為內參，采用2-ΔΔCt法計算circRNAs 相對表達水平。RT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.5 細胞轉染及細胞功能實驗分組 將A549 細胞接種至6 孔板中，每孔5×105個細胞，培養(yǎng)24 h，細胞生長至90%融合后，采用Lipofectamine 2000 進行細胞轉染。分別將Lipofectamine 2000 和核苷酸加入到250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋，將稀釋液混合，輕輕混勻，室溫靜置24 h 后，收集細胞，通過qRT-PCR 法檢測細胞轉染效率。將細胞分為空白對照組（NC 組）、C16:0組、circ_DENND4C 質粒過表達組（pex-0086466 組）、circ_DENND4C 質粒過表達聯(lián)合C16:0 組（pex-0086466+C16:0 組）進行細胞功能實驗。

1.6 細胞增殖能力檢測 采用細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法。將轉染的A549 細胞轉移到96 孔板，每孔2×103個細胞，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后更換為DMEM 培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h 后定義為第0 天，此時更換為含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基。分別于第0、1、2 天在C16:0組及pex-0086466+C16:0 組中加入C16:0（4 μL/孔，濃度10 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)。第3 天，向每個孔中加入10 μL CCK-8 試劑+90 μL DMEM 培養(yǎng)基。使用酶標儀檢測450 nm 波長處吸光度（optical density，OD）值。細胞增殖率計算公式：細胞增殖率（%）=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.7 細胞菌落形成能力檢測 采用細胞克隆形成試驗。將轉染的A549 細胞轉移到6 孔板，每孔500 個細胞，在C16:0 組及pex-0086466+C16:0 組中加入C16:0（40 μL/孔，濃度10 mmol/L），培養(yǎng)2 周，每3～4 d 更換1 次培養(yǎng)基。然后棄掉孔中培養(yǎng)基，用甲醛固定菌落20 min，用0.5%結晶紫溶液染色20 min。PBS 沖洗3 次后，用肉眼計數(shù)染色的菌落。菌落形成率=菌落數(shù)/1 000×100%。

1.8 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕試驗。將轉染的A549 細胞接種至6 孔板中，每孔5×105個細胞，恒溫培養(yǎng)箱培育24 h。用200 μL 無菌移液管尖端（記錄0 h）創(chuàng)建清晰的無細胞區(qū)，用PBS 清洗細胞3 次，去除劃下的細胞，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；在C16:0 組及pex-0086466+C16:0 組中加入C16:0（40 μL/孔，濃度10 mmol/L），放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，分別在0、24、48 h 使用光學顯微鏡拍攝細胞遷移距離。遷移細胞數(shù)和初始接種細胞數(shù)的比值為相對遷移細胞數(shù)（%）。

1.9 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 侵襲實驗。使用Matrigel 涂覆Transwell 小室底部膜的上室，至37 ℃30 min 使Matrigel 聚合成凝膠。將轉染的細胞用無血清培養(yǎng)基重新懸浮，轉移到Transwell 小室上室中，每孔5×104個細胞，在下室中加入500 μL 含有10%FBS的培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，棄掉孔中培養(yǎng)基，用甲醇固定穿過膜的細胞20 min后風干，PBS 清洗3 遍，隨后用0.1%結晶紫溶液染色15 min，染色后用PBS 反復清洗殘余的結晶紫。最后在光學顯微鏡（×200）下隨機選取10 個視野/孔計數(shù)細胞。侵襲細胞數(shù)和初始接種細胞數(shù)的比值作為相對侵襲細胞數(shù)（%）。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件、Graphpad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 C16:0 對NSCLC 細胞中circRNAs 組學的影響C16:0刺激A549細胞48 h后高通量測序檢測到2 260個circRNAs（圖1A，見插頁）。發(fā)現(xiàn)C16:0 可以引起A549細胞內circRNAs 表達改變，其中有意義的上調36 個，下調227 個（P＜0.05）（圖1B，見插頁）。因此設想C16:0可能調控circRNAs 影響NSCLC 發(fā)生、發(fā)展。從中挑選出上調及下調變化前10的circRNAs（圖1C，見插頁），這些circRNAs表達改變均在對照組5倍以上（圖2）。

圖1 C16:0 處理后的A549 細胞測序結果分析（A：circRNAs 表達變化的層次聚類分析圖，紅色和綠色分別表示高表達和低表達；B：circRNAs 表達變化的火山圖，紅點和綠點分別代表上調及下調＞2 倍的circRNAs；C：表達上調及下調前10 的circRNAs 層次聚類分析圖）

圖2 C16:0 處理后的A549 細胞測序結果分析（A：表達上調前10 的circRNAs 測序結果；B：表達下調前10 的circRNAs 測序結果）

2.2 驗證C16:0 相關的circRNAs 表達 結合上述測序結果中上調及下調變化前10 的circRNAs 及circinteractome 數(shù)據庫（https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）、人類circRNAs 數(shù)據庫（http://www.circbase.org/）中腫瘤相關circRNAs 的結果，取交集得到14 個（7 個表達上調，7 個表達下調）可能與C16:0 影響NSCLC 生長有關的circRNAs。通過qRT-PCR 驗證，結果發(fā)現(xiàn)上調因子中circ_PCNX2、circ_ORC2、circ_NUP42、circ_XPO1表達變化與測序結果一致，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖3A）；下調因子中circ_DENND4C、circ_ARSL、circ_DOCK5 表達變化與測序結果一致，其中circ_DENND4C 加藥后表達下調近5 倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3B）。因此認為C16:0 可能通過抑制circ_DENND4C表達從而達到抑制NSCLC的生長。

圖3 C16:0 調控腫瘤相關circRNAs 表達（A：qRT-PCR 驗證在C16:0 加藥后測序結果顯示表達上調前10 且與腫瘤相關的7 個circRNAs；B：qRT-PCR 驗證在C16:0 加藥后測序結果顯示表達下調前10 且與腫瘤相關的7 個circRNAs，與對照組比較，aP＜0.05）

2.3 C16:0 通過調控circ_DENND4C 對NSCLC 細胞增殖、菌落形成、侵襲和遷移的影響 為了驗證circ_DENND4C 在NSCLC 中的生物學功能及其在C16:0 抑制NSCLC 發(fā)生、發(fā)展中的作用，在A549 細胞中通過質粒介導circ_DENND4C 過表達，然后利用C16:0 刺激A549 細胞，采用qRT-PCR 驗證circ_DENND4C 的mRNA 表達情況，C16:0 組中circ_DENND4C 表達下調，pex_0086466 組中circ_DENND4C 表達上調，而NC 組與pex-0086466+C16:0 組中circ_DENND4C 表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4A，見插頁）。利用CCK-8與克隆試驗發(fā)現(xiàn)，circ_DENND4C 過表達可以促進A549 細胞的增殖和克隆能力，C16:0 可以抑制A549細胞的增殖和克隆能力，而過表達circ_DENND4C 可以逆轉C16:0 對A549 細胞的抑制作用（圖4B-C，見插頁）。劃痕試驗表明，過表達circ_DENND4C 可以使A549 細胞的遷移能力大幅上升，C16:0 可以抑制其遷移，而過表達circ_ DENND4C 可以逆轉C16:0 對A549細胞遷移能力的抑制（圖4D，見插頁）。Transwell 侵襲實驗表明，pex_0086466 組細胞侵襲率約為NC 組的2倍，C16:0 組細胞侵襲率僅有NC 組的30%，而過表達circ_DENND4C 后加入C16:0 細胞侵襲率與NC 組相似（圖4E，見插頁）。以上實驗說明circ_DENND4C 可以促進NSCLC 增殖、侵襲和遷移，是C16:0 抑制NSCLC 的關鍵因子。

圖4 C16:0 通過調控circ_DENND4C 對A549 細胞增殖、集落形成、侵襲和遷移的影響（A：4 組A549 細胞中circ_DENND4C 表達水平比較；B：4 組A549 細胞增殖能力比較；C：4 組A549 細胞的克隆數(shù)比較；D：4 組A549 細胞遷移能力比較；E：4 組A549 細胞侵襲能力比較，結晶紫染色，×200）

3 討論

NSCLC 是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，與小細胞肺癌相比，NSCLC 癌細胞的生長和分裂更慢，傳播和轉移相對較晚，約占所有肺癌總數(shù)的80%～85%，大部分患者確診時已經處于中晚期，5 年生存率低于54%[1]。因此，發(fā)現(xiàn)治療NSCLC 的新型分子靶點，探索其中的調控通路是急需解決的問題。盡管人們長期以來一直認為脂質在癌癥中起著關鍵作用，但特征變化的程度和復雜性及其在癌癥和生理學中的作用直到現(xiàn)在才被曝光。近年來，基于液相色譜-質譜技術的高速發(fā)展，已經發(fā)現(xiàn)了許多關于癌癥脂質代謝的變化[15]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者血漿中脂質譜與健康志愿者具有明顯異質性，并篩選出一系列相關脂質組群，其中NSCLC 患者血漿中C16:0 濃度明顯低于健康志愿者。并進一步通過細胞功能實驗發(fā)現(xiàn)C16:0 可以抑制NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展[14]，但其具體機制仍是未知。

目前越來越多的研究表明，circRNAs 與各類癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關[16]。 circRNAs 較線性RNA 相比，其在組織中更穩(wěn)定，壽命更長，對核糖核酸酶更具有抵抗力[17]，是一種潛在的生物標志物[12]。已有大量研究證實circRNAs 的異常表達與NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展有關，例如，has-circ-100395 通過調節(jié)miR-1228/TCF21 途徑來調節(jié)NSCLC 的增殖、遷移和侵襲功能[18]；circ-001278 在肺腺癌細胞中表達顯著上調，其可以促進肺腺癌組織中程序性死亡配體1/程序性死亡受體1的表達[19]；circ_PTPRM 通過調節(jié)miR-139-5p/SETD5來促進NSCLC 的進展[20]。部分circRNAs 可以調節(jié)糖酵解和β 氧化參與腫瘤脂質代謝過程，Li 等[21]在腫瘤異種移植模型中，沉默或強制表達circ_ACC1 分別導致腫瘤生長抑制和增強，并提出了circ_ACC1 誘導AMP 依賴的蛋白激酶激活致腫瘤細胞在代謝重編程的觀點。因此腫瘤脂質代謝過程與circRNAs 有著不可忽視的關聯(lián)。

本研究通過circRNAs 測序發(fā)現(xiàn)circ_DENND4C 也許是C16:0 抑制NSCLC 發(fā)生、發(fā)展的關鍵因子。circ_DENND4C（has-circ-0086466）來源于DENND4C 基因外顯子，是一種在腫瘤增殖中具有調節(jié)功能的缺氧相關分子。有研究表明，circ_DENND4C 在乳腺癌組織中高表達，沉默缺氧誘導因子-1 后其表達下調，且抑制缺氧下乳腺癌細胞的增殖[22]。circ_DENND4C 在腦膠質瘤中高表達，敲低circ_DENND4C 可破壞血腫瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB）的完整性且提高滲透率，從而促進抗腫瘤藥物阿霉素穿過BTB 誘導膠質瘤細胞凋亡[23]。circ_DENND4C 在肝癌細胞中也過度表達。此外circ_DENND4C 可以增強轉錄因子4 的表達，通過隔離miR-195-5p 激活Wnt/β-catenin 信號傳導通路在肝癌細胞中發(fā)揮促腫瘤功能[24]。但目前尚未有關于circ_DENND4C 和NSCLC 的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)C16:0 可以抑制A549 細胞的增殖生長，同時抑制circ_DENND4C 的表達。當circ_DENND4C 過表達時，C16:0 對A549 細胞的抑制作用消失，且circ_DENND4C本身過表達可以促進A549 細胞增殖、遷移和侵襲能力。因此，本研究認為C16:0 通過調控促癌因子circ_DENND4C 表達從而抑制NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展。本研究首次整合了脂質質譜分析及circRNAs 測序雙組學結果，從全新角度為C16:0 用于NSCLC 治療奠定基礎。

綜上所述，circ_DENND4C 過表達可以促進NSCLC的進展，C16:0 可以通過下調circ_DENND4C 的表達抑制NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)為C16:0 治療NSCLC 提供重要的實驗依據。