鄭思化 趙學正 高偉

骨肉瘤是主要起源于間葉組織的一種原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年[1]。骨肉瘤具有高度的侵襲性和轉移性，對患者的生命和生活質量均造成嚴重的影響[2-3]。目前，外科手術仍是治療骨肉瘤的主要方法。隨著新輔助化療技術的不斷推廣，患者5 年生存率明顯提高，但復發(fā)性和轉移性骨肉瘤患者生存率仍較低[4-5]。因此，深入探究骨肉瘤發(fā)病的細胞機制及分子信號機制迫在眉睫。研究發(fā)現鈣蛋白酶1（calpain 1，CAPN1）通過促進癌細胞的增殖、侵襲，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用[6]。但目前CAPN1 是否參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展尚不明確。本研究旨在探討小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默CAPN1 基因對人骨肉瘤細胞MG-63 增殖、侵襲及B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人骨肉瘤細胞MG-63 購自中國科學院細胞庫。DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號：C11995500BT）和10% FBS（美國Gibco 公司，批號：2007142）；siRNA 轉染試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號：2007281）；CAPN1 siRNA 轉染試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號：2009172）；Lipofectamine 2000 轉染試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號：2012011）；Trizol Reagent 試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：2110172）；RNA 反轉錄試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，貨號：K1622-100 react）；qRTPCR 試劑盒（上海欽誠生物科技有限公司，貨號：QC90504-1）；四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液（上海哈靈生物科技有限公司，批號：2003241）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液（碧云天生物技術有限公司，貨號：ST038）；Bcl-2 抗體（北京智杰方遠科技有限公司，貨號：251711）和Bax 抗體（深圳市豪地拓生物科技有限公司，貨號：251834）。倒置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：CKX53）；酶標儀（美國Thermo 公司，型號：Multiskan Sky）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI 公司，型號：7500）；Transwell 小室（美國Corning 公司，型號：3422）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司，型號：CytoFLEX）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取MG-63 細胞放置于37 ℃水浴中解凍后制備單細胞懸液，調整為1×105/mL 的密度接種于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞生長融合至80%時，棄掉上層培養(yǎng)液，消化處理，傳代培養(yǎng)和凍存細胞。

1.2.2 細胞轉染 將密度為1×105/mL 單細胞混懸液接種于細胞培養(yǎng)板中，細胞生長融合至約90%時，將siRNA 序列、CAPN1 siRNA 序列分別轉染細胞，分為CAPN1 siRNA 組與siRNA 組，以未轉染的細胞作為對照組。

1.2.3 細胞CAPN1 mRNA 表達水平檢測 采用qRTPCR 法。應用Trizol Reagent 試劑盒從MG-63 細胞中提取總RNA，檢測RNA 的純度和完整性，采用RNA 反轉錄試劑盒合成cDNA，按照qRT-PCR 試劑盒說明標準進行PCR 反應。反應體系：10 μL 緩沖液，1 μL dNTP mix，1 μL TaqDNA 聚合酶，2 μL 上游引物，2 μL下游引物，1 μL cDNA，33 μL H2O；反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，67 ℃退火15 s，45 個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作為內參，采用2-ΔΔCt法計算CAPN1 mRNA 相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 細胞增殖率檢測 采用MTT 比色法。將兩組MG-63 細胞按每孔1×104個細胞接種于96 孔板中，每孔加入200 mL DMEM 培養(yǎng)基。每組細胞于接種后12、24、36、48 h 加入20 μL MTT 溶液孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO 溶液混勻使沉淀溶解，用酶標儀檢測490 nm 處吸光度（optical density，OD）值。增殖率（%）=[（OD實驗組-OD對照組）/OD實驗組]×100%。

1.2.5 細胞侵襲率檢測 采用Transwell侵襲實驗。Transwell 孔徑8 μm，每孔加入稀釋后的Matrigel 50 μL，于37 ℃孵育4 h。對照組、siRNA 組和CAPN1 siRNA 組細胞接種到Transwell 小室中，稀釋成2×106個/mL，上室中每孔加入細胞懸浮液200 μL，下室中每孔加入細胞懸浮，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結晶紫染色，觀察細胞侵襲情況，使用Image J 軟件計算侵襲細胞數。侵襲率（%）=[（OD實驗組-OD對照組）/OD實驗組]×100%。

1.2.6 細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。采用RIPA 裂解液提取MG-63 細胞，依據BCA 法測定蛋白濃度。按每泳道50 μg 蛋白進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳分離蛋白，然后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入一抗后4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。采用TBST 洗滌3 次，每次洗滌10 min。ECL 液暗室發(fā)光顯影，使用Image J 軟件計算各個條帶的灰度值，內參為β-actin。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3 組MG-63 細胞中CAPN1 mRNA 表達水平比較 3 組MG-63 細胞CAPN1 mRNA 表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中CAPN1 siRNA 組細胞CAPN1 mRNA 表達水平為0.34±0.06，低于對照組的0.98±0.05 和siRNA 組的0.97±0.04，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組細胞CAPN1 mRNA 表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 3 組MG-63 細胞增殖率比較 CAPN1 siRNA 組細胞在培養(yǎng)12、24、36 和48 h 的增殖率均低于對照組和siRNA 組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組細胞在培養(yǎng)12、24、36 和48 h 的增殖率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 3 組MG-63 細胞增殖率比較（%）

2.3 3 組MG-63 細胞侵襲率比較 3 組MG-63 細胞侵襲率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中CAPN1 siRNA 組細胞侵襲率為（61.47±6.68）%，低于對照組的（94.34±2.67）%和siRNA 組的（93.54±2.98）%，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組細胞侵襲率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1（插頁）。

圖1 3 組MG-63 細胞侵襲情況的染色圖（A：對照組；B：siRNA 組；C：CAPN1 siRNA 組）

2.4 3 組MG-63 細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平比較 CAPN1 siRNA 組細胞Bcl-2 蛋白表達水平低于對照組和siRNA 組，而Bax 蛋白表達水平高于對照組和siRNA 組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖2 和表3。

表3 3 組MG-63 細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平比較

圖2 3 組MG-63 細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達的電泳圖

3 討論

骨肉瘤常見于血運豐富的四肢長骨干骺端，如脛骨近端、股骨遠端等[7-9]。骨肉瘤臨床癥狀主要表現為局部疼痛和腫脹，偶爾伴關節(jié)活動障礙，存在較高的轉移傾向，并且早期很容易出現轉移，特別是肺部轉移，病情發(fā)展迅速[10-13]。

CAPN 是一種有著類似催化結構域的性質保守的半胱氨酸蛋白酶，參與體內一系列細胞基本生理過程，包括細胞的增殖和凋亡、胞內信號轉導及細胞骨架重建等[14]。CAPN 家族包含十余種亞基，而其中CAPN1 表達最為廣泛，且最受關注。近年來研究發(fā)現，CAPN 的表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程關系緊密，且研究發(fā)現腎細胞癌腫瘤、腦膜瘤組織及神經鞘瘤組織中CAPN1 表達均明顯升高[15]。CAPN1 不僅與腫瘤細胞的增殖關系緊密，且與腫瘤細胞的遷移關系緊密。趙治艷等[16]研究發(fā)現，siRNA 沉默CAPN1 可抑制膽囊癌細胞GBC-SD 增殖和遷移作用，可為治療膽管癌提供新的實驗依據。本研究表明，CAPN1 siRNA 組CAPN1 mRNA 表達水平低于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1 可下調CAPN1 表達；CAPN1 siRNA 組細胞在培養(yǎng)12、24、36 和48 h 的增殖率均低于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1 可抑制MG-63 細胞增殖；CAPN1 siRNA 組MG-63 細胞侵襲率低于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1 可抑制MG-63 細胞的侵襲。

研究發(fā)現，凋亡相關基因及其蛋白異常表達在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[17-18]。Bcl-2 和Bax 分別是起促凋亡和抗凋亡作用的蛋白。Bcl-2 在多種腫瘤中表達升高，而Bax 在多種腫瘤中表達降低。Bcl-2蛋白高表達可使腫瘤細胞持續(xù)增殖，避免出現凋亡；而Bax 蛋白可誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。本研究表明，CAPN1 siRNA 組細胞Bcl-2 蛋白表達水平低于對照組和siRNA 組，而Bax 蛋白表達水平高于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1可下調Bcl-2 表達及上調Bax 表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡，但其具體的作用機制尚未完全明確，還需后續(xù)深入探討，為治療骨肉瘤提供依據。

綜上所述，siRNA 沉默CAPN1 表達抑制了MG-63細胞增殖和侵襲能力，并促進其凋亡，其機制可能與調控Bcl-2 和Bax 蛋白表達有關。