程豪政,妥 靜,董楊柳,王 樂,者湘漪,李洪濤,李冬妹,潘澤民

宮頸癌(cervical cancer,CC)是婦女惡性腫瘤死亡的第四大因素[1]。據(jù)報道[2],中國新疆維吾爾自治區(qū)宮頸癌發(fā)病率與病死率很高,該地區(qū)人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus, HPV)陽性率為14.02%,其中多為HPV52、HPV53、HPV16和HPV18。

研究[3]表明,感染HPV16具有更強的致病性和致癌性。HPV16分為A譜系、B譜系、C譜系和D譜系4種變異譜系[4],中國新疆維吾爾自治區(qū)女性感染HPV16以歐洲病毒株為主[5]。HPV16 E4基因產(chǎn)物E4蛋白質(zhì),是HPV表達量最高的蛋白質(zhì),其氨基酸主要來源于E4開放閱讀框(open reading frame, ORF),且E4 ORF包含在E2 ORF內(nèi)[6-7]。E4蛋白質(zhì)可增強病毒復制和病毒粒子的排出[8-10]。HPV衣殼蛋白質(zhì)在病毒進入細胞與細胞核的過程中起關(guān)鍵作用[11-12]。L2促進了病毒基因組的逆行運輸,促進細胞間期將病毒基因組整合到宿主基因[13-14]。新疆維吾爾自治區(qū)HPV16 E4和L2基因的變異及分布特征尚不清楚,因此,研究HPV16 E4 和L2基因變異,有助于發(fā)現(xiàn)HPV16基因變異位點與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集在伊犁州友誼醫(yī)院、喀什地區(qū)人民醫(yī)院和石河子大學附屬醫(yī)院共收集了80例患者的HPV16感染陽性的宮頸細胞樣本(脫落細胞40例,組織細胞40例);樣本收集取得了所有患者的知情同意。所有患者都無外地的長期旅居史,收集樣本存放于-80 ℃低溫冰箱。

1.2 樣本的DNA提取與PCR擴增DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司)提取DNA,DNA儲存在 -20 ℃的冰箱?；旌戏磻?40 μl)包括2×Taq PCR SuperMix 20 μl,引物各1 μl及2 μl樣本DNA。反應程序溫度控制為94 ℃,持續(xù)5 min;34個循環(huán)×(94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min);72 ℃ 5 min。存放于-20 ℃冰箱。引物的信息,見表1。

表1 引物信息

1.3 測序上海天昊遺傳分析中心對40例脫落細胞DNA樣品進行基因測序檢測,用蝦堿性磷酸酶(北京生物技術(shù)有限公司)和核酸外切酶I(北京生物科技有限公司)純化PCR產(chǎn)物。使用Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(美國ABI公司),酒精純化產(chǎn)物后,DNA分析儀(ABI3130XL)測樣品基因序列。40例組織細胞DNA樣本通過Illumina Hiseq平臺,以2×150 bp雙端測序模式進行高通量測序,獲得FastQ數(shù)據(jù)。

1.4 HPV16變異株進化分析分析單核苷酸多態(tài)性(Polyphred軟件),與歐洲原型病毒株(GenBank:NC_001526.4)的序列比對,同時與其他HPV16變異病毒株比對:歐洲株A1-A3:A1(HQ644283.1,HQ644268.1,HQ644280.1,HQ644282.1),A2:(AF536179.1),A3:(HQ644236.1);亞洲株A4[HQ644235.1(A4),HQ644248.1,AF534061.1,HQ644251.1];非洲株AF:B(HQ644238.1,HQ644240.1,HQ644290.1,HQ644298.1);C(AF472509.1,HQ644239.1,HQ644249.1,HQ 644237.1);北美NA:D1(HQ644257.1);亞美型AA:D2(HQ644263.1, HQ644277.1,HQ644279.1,HQ644281.1);D3(HQ644247.1,HQ644255.1,HQ644253.1,AF 402678.1)。MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 統(tǒng)計學處理直接計數(shù)HPV16 E4、L2基因變異位點的變異頻數(shù),SPSS 26.0軟件分析統(tǒng)計結(jié)果,使用χ2檢驗的統(tǒng)計方法,分析HPV16 E4、L2單核苷酸變異與宮頸癌的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E4、L2基因的變異分析HPV16 E4和L2基因變異結(jié)果:80例DNA樣本基因測序結(jié)果,其多態(tài)性位點見表2、3。

表2 HPV16 E4 基因變異與氨基酸的改變

在80例HPV16陽性樣本中,72例樣本存在HPV16 E4基因變異,10個位點存在核苷酸變異,包括4種錯義變異和7種同義變異,其中錯義變異分別為:A2541C(1/72,1.39%)、G2621C(1/72,1.39%)、A2636C(3/72,4.17%)和T2703G(1/72,1.39%)。氨基酸改變分別為:蘇氨酸替換為脯氨酸(T25P)、谷氨酰胺替換為組氨酸(Q51H)、谷氨酸替換為天冬氨酸(E56D)、亮氨酸替換為纈氨酸(L79V)。常見同義變異為nt2520(T-C)(28/72,38.89%)、nt2546(C-T/A)(70/72,97.22%;1/72,1.39%)、nt2585(G-A)(25/72,34.72%)、nt2660(T-C)(28/72,38.89%)。

在80例HPV16陽性樣本中,74例樣本存在HPV16 L2變異,40個位點存在核苷酸變異,包括23種錯義變異和18種同義變異。如表3所顯示,HPV16 L2最常見的錯義變異核苷酸變異位點為:T4177C、A4362C、A4362T和A4654C,其氨基酸變化為絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?S269P)、亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼?L330F)和異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?I428L)。17種同義變異中變異頻率較高的位點為:nt4074(G-A)(73/74,98.65%)和nt4602(A-G)(15/74,20.27%),G4074A普遍存在于變異樣本中。

表3 HPV16 L2基因變異和氨基酸改變

表4 病例組與對照組中HPV16 E4的基因變異

表5 病例組與對照組中 HPV16 L2 基因組的基因變化

2.2 HPV16 E4和L2核苷酸序列系統(tǒng)進化樹使用N-J法,Bootstrap method(1000 replication)和Kimura 2-parameter model構(gòu)建HPV16 E4、L2基因系統(tǒng)進化樹,只顯示大于50%的Bootstrap值,其中Bootstrap值>70%提示可靠性很好,系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。通過HPV16 E4、L2的系統(tǒng)進化樹可以發(fā)現(xiàn)有76個樣本為歐洲變體,4個樣本為亞洲變體。沒有發(fā)現(xiàn)非洲變體、美洲變體和亞美變體。亞洲變體X18、X20、Z91和CN-148中的變異都與 G4181A變異相關(guān)。

圖1 HPV16病毒E4和L2基因進化分析及病毒株統(tǒng)計

2.3 病例組與對照組中HPV16 E4、L2的基因變異

2.3.1病例組和對照組中HPV16 E4基因組的基因變異 如表4所示,通過對病例組(宮頸癌組)與對照組(非宮頸癌組)中E4基因變異進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)對照組有1種錯義變異,病例組有3種錯義變異,統(tǒng)計結(jié)果顯示,這些錯義變異在對照組與病例組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3.2病例組與對照組基因組HPV16 L2的遺傳變異 如表5顯示的對照組和病例組中L2基因的錯義變異分布。對照組有17種錯義變異,病例組有14種錯義變異,其中錯義變異T4177C(P=0.012),A4288C(P=0.04)和A4654C(P=0.026)在病例組變異頻率明顯高于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),氨基酸變化分別為絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?S269P)、異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?I306L)和異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?I428L)。差異有統(tǒng)計學意義的錯義變異位點測序結(jié)果,見圖2。

圖2 HPV16 L2基因錯義變異具有顯著差異位點的測序結(jié)果

3 討論

HPV基因變異的研究大多聚焦在病毒E6和E7基因上,而E6和E7的變異會對宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展產(chǎn)生影響。HPV16 E4基因變異和缺失會影響病毒粒子在細胞間的傳播,L2基因的變異和缺失會導致病毒基因組整合到細胞核染色體過程的改變[8-13]。

通過HPV16 E4、L2的系統(tǒng)進化樹顯示,有76個樣本為歐洲變異株,4個樣本為亞洲變異株。這與已有報道[15]的新疆維吾爾自治區(qū)主要流行株為歐洲株,少數(shù)為亞洲株的情況類似,然而4例亞洲變異株均與L2基因錯義變異G4181A有關(guān),這一發(fā)現(xiàn)尚未有相關(guān)文獻報道。在HPV16 E4上常見的錯義變異位點發(fā)生頻率并不高,且HPV16 E4基因位于E2基因的中心位置,該區(qū)域編碼E2蛋白質(zhì)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域[6-7]。E4基因最常見的同義變異C2546T(97.22%)和G2585A(34.72%)在HPV16 E2基因的表達中為錯義變異,且位于E2基因鉸鏈區(qū)間接導致E2蛋白質(zhì)的氨基酸改變,最終導致E6、E7表達的變化,表2顯示的 E4基因變異G2504A、T2520C、C2546T、G2585A、T2660C和T2703G與已有的關(guān)于E4的報道結(jié)果一致[16],而錯義變異A2541C、G2621C、A2636C和同義變異T2672G尚未見文獻報道。

在HPV16 L2基因上常見的錯義變異位點分別為T4177C、A4362C/T和A4654C,其氨基酸變化分別為S249P、L330F和I428L,且同義變異G4074A普遍存在于樣本中。研究表明L2基因的錯義變異T4177C、A4288C和A4654C在病例組中高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。L2蛋白質(zhì)對病毒基因組進入細胞核有促進作用,可以表明該變異可能會促進病毒基因組的感染和整合,這仍需要深入研究給予證明。由于HPV16 E4和L2在病毒感染和傳播方面的作用,E4基因的改變會間接影響E2基因的變化,最終導致E6和E7表達的改變,因此,可以通過E4基因的變異間接了解病毒的復制及傳播能力。此外,還可以結(jié)合細胞實驗研究HPV16 L2基因 T4177C、A4288C和A4654C的變異對病毒基因組侵入細胞與整合到細胞基因組的作用。

綜上所述,新疆維吾爾自治區(qū)主要流行病毒株為歐洲株,少數(shù)為亞洲株;HPV16 L2基因中T4177C、A4288C、A4654C在宮頸癌中的變異頻率高于非宮頸癌,且G4181A與亞洲株相關(guān)。