謝錦程肖夢(mèng)媛鄧少東*陳建英*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,廣東 湛江 524001;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院,廣東 東莞 523710;3.廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院科研平臺(tái),廣東 東莞 523808)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種嚴(yán)重的臨床疾病,其組織病理特征是持續(xù)性的血管收縮、血管重構(gòu)、血管周?chē)装Y反應(yīng)和纖維素樣壞死,繼而引發(fā)血管管腔狹窄和閉塞,導(dǎo)致肺血管阻力進(jìn)行性增高,最終引起右心衰竭。流行病學(xué)顯示,特發(fā)性和遺傳性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病率為每百萬(wàn)居民5 例,患病率為每百萬(wàn)居民25 例,并且呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[1]。肺動(dòng)脈高壓患者的1 年、3年、5 年和7 年的生存率分別為85%、68%、57%和49%,中位生存期約為7 年[2]。盡管近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制研究取得了重要進(jìn)展,但肺動(dòng)脈高壓仍然無(wú)法治愈,患者的2 年和3 年的死亡率仍高達(dá)21%[3-5],這主要與其發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性有關(guān)。同時(shí)受臨床標(biāo)本的來(lái)源及倫理學(xué)的影響,圍繞肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展機(jī)制的臨床研究極具挑戰(zhàn)性。而建立動(dòng)物模型以及細(xì)胞模型可以全面了解肺動(dòng)脈高壓的病因和病理過(guò)程,便于進(jìn)行新型藥物和干預(yù)手段的篩選和研究。因此,選擇合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪翘剿鞣蝿?dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制及其藥物治療研究的基礎(chǔ)。本文旨在總結(jié)近年來(lái)肺動(dòng)脈高壓實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕７椒?比較各種模型的優(yōu)缺點(diǎn),為肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的探索和臨床研究提供參考。

1 動(dòng)物模型

1.1 野百合堿誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型

野百合堿(monocrotaline,MCT)是一種具有致突變和致癌功效的吡鉻里西啶生物堿,可從豆類(lèi)植物和野豬糞便中提取獲得。研究表明,野百合堿在體內(nèi)被肝代謝產(chǎn)生具有肺毒性的野百合堿吡咯(MCTP),進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[6]。在構(gòu)建野百合堿模型時(shí),最常選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠,通過(guò)單次腹腔或者皮下注射MCT(通常劑量為60~80 mg/kg)來(lái)誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓[7-8]。由于腹腔內(nèi)腹膜面積大、吸收快,使用腹腔注射野百合堿可能會(huì)使大鼠死亡率升高,因此建模時(shí)多采用皮下注射野百合堿。在注射野百合堿后的5~6 周內(nèi),約有一半大鼠會(huì)死亡,為了提高模型大鼠的成活率,Zhuang 等[9]對(duì)經(jīng)典野百合堿模型進(jìn)行了改進(jìn),采用腹腔注射兩次MCT(劑量為20 mg/kg)的建模方案,兩次注射之間間隔7 d,該建模方案可減輕模型大鼠心臟組織的受損,降低其血管周?chē)难装Y反應(yīng)水平以及心肌細(xì)胞纖維化的程度,從而顯著提高模型大鼠的存活率[10]。與大鼠相比,單次注射野百合堿并不能在小鼠體內(nèi)引發(fā)肺動(dòng)脈高壓。即使直接注射足夠劑量的MCTP 也難以重現(xiàn)野百合堿在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的肺血管肌化以及右心室收縮壓明顯升高的癥狀,這可能與小鼠代謝野百合堿的方式有關(guān)[11]。而建立小鼠肺動(dòng)脈高壓模型的方法,常采用每周皮下注射MCT(劑量為600 mg/kg),持續(xù)4~8 周[12]。該模型建模周期長(zhǎng)且耗費(fèi)多,因此大鼠是建立野百合堿誘導(dǎo)模型的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

大鼠注射野百合堿后,通常不會(huì)立即出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓的臨床癥狀,而是在3~4 周后出現(xiàn)呼吸困難、哮鳴音、口鼻腔出血等癥狀。解剖觀察顯示,大鼠的右心室明顯肥大和擴(kuò)張,右心室游離壁顯著增厚[13-16]。野百合堿引起的病理性改變包括內(nèi)皮功能障礙和平滑肌細(xì)胞的增殖,進(jìn)而導(dǎo)致血管重構(gòu)、血管周?chē)装Y以及心肌纖維化[17-19]。研究顯示,野百合堿會(huì)損害肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,引起內(nèi)皮功能障礙,繼而增加血管收縮劑包括內(nèi)皮縮血管肽1、血管緊張素Ⅱ、血栓素A2 的表達(dá)水平。同時(shí)NO 和前列環(huán)素等血管擴(kuò)張素的合成減少,隨后TGF-smad 和BMPR-2 信號(hào)通路被激活,導(dǎo)致血管收縮和血管重塑增加[7,20-22]。關(guān)于野百合堿模型的研究顯示,炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞)和細(xì)胞因子在肺血管重塑早期階段起關(guān)鍵作用[23-24]。在大鼠注射野百合堿的第1 周,僅有腫瘤壞死因子-α、白介素-1β 升高,表明此時(shí)處于急性炎癥期。隨后,在慢性炎癥期,促炎因子如腫瘤壞死性因子-α、白介素-1β、白介素-6、白介素-12 和抗炎因子精氨酸酶1、白介素-10、腫瘤壞死因子-β水平升高。隨著肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展,PI3K/Akt 信號(hào)通路表達(dá)上調(diào),并與促炎蛋白相關(guān)。此外,NF-κB 信號(hào)通路也被激活,這也在一定程度上揭示了野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的炎癥特征[25]。

野百合堿模型具有價(jià)格低廉、技術(shù)要求低的特點(diǎn),可幫助我們?nèi)媪私夥窝苤厮艿倪^(guò)程以及其病理生理的機(jī)制。根據(jù)最近研究顯示,中藥化合物(木犀草素、柚皮苷、黃芩素)、磷酸二酯酶5 抑制劑(西地那非)、Rho 激酶抑劑(Y-27632、法舒地爾)、鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑(達(dá)格列凈)、內(nèi)皮素受體拮抗劑(波生坦、哌拉西坦)、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(氟西汀)、靶向小分子抑制劑(Seralutinib),均能改善野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓癥狀[26-34]。同時(shí),野百合堿還具有廣泛毒性,常引起肝損傷、腎功能不全、肺部纖維化等癥狀[35-37]。綜上所述,野百合堿模型常用作肺動(dòng)脈高壓藥物篩選研究的首選動(dòng)物模型。

1.2 經(jīng)典缺氧模型

采用慢性缺氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型,常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠和小鼠。造模時(shí),將動(dòng)物置于10% O2低氧艙中,持續(xù)3~4 周,即可建立缺氧性肺動(dòng)脈高壓模型[38-39]。研究顯示,將Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6 小鼠同時(shí)暴露于低壓缺氧中1~3周后,兩種動(dòng)物都表現(xiàn)出肺動(dòng)脈高壓的相關(guān)癥狀,但C57BL/6 小鼠的肺血管重塑程度和肺動(dòng)脈的壓力均低于Sprague-Dawley 大鼠[40]。另外,將3 月齡的雄性大鼠和12~14 月齡的雄性大鼠暴露于慢性缺氧環(huán)境(置于海拔5486 m),持續(xù)時(shí)間為1~42 d。結(jié)果顯示,在缺氧期間,3 月齡大鼠表現(xiàn)出血管肌化的特征,而12~14 月齡大鼠的血管形態(tài)幾乎未發(fā)生變化[41]。提示慢性缺氧引起肺血管結(jié)構(gòu)改變的過(guò)程與物種或動(dòng)物的發(fā)育階段顯著相關(guān)[42]。

慢性缺氧引起的結(jié)構(gòu)改變包括肺泡壁非肌化血管中平滑肌樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的聚集和分化、單核細(xì)胞/祖細(xì)胞的募集以及內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[42-44]。此外,肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在缺氧條件下會(huì)顯著肥大,并參與內(nèi)膜增厚的發(fā)展[45]。動(dòng)物在急性和慢性的缺氧環(huán)境中會(huì)增加肺部的炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子的表達(dá),并導(dǎo)致白細(xì)胞在肺和肺血管內(nèi)及周?chē)?。白介?1、白介素-6 和腫瘤壞死因子-α 等炎性因子的上調(diào)介導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓中血管重塑[46-49]。一旦動(dòng)物離開(kāi)缺氧環(huán)境并恢復(fù)至常壓氧條件,上述變化中的大部分可以逆轉(zhuǎn)。因此,缺氧模型僅適用于研究非嚴(yán)重程度的肺動(dòng)脈高壓類(lèi)型。為了進(jìn)一步改進(jìn)模型,Coste 等[50]將慢性缺氧與野百合堿相結(jié)合,即將大鼠腹腔注射MCT(劑量為60 mg/kg)后置于380 mmHg 的低壓艙中3 周。研究結(jié)果顯示,大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重動(dòng)脈病變,包括血管的炎癥、血管重塑和血栓性、嚴(yán)重的內(nèi)膜病變和早期的叢狀病變,這些組織學(xué)特征與肺動(dòng)脈高壓患者肺部的組織學(xué)特征相似。

1.3 Sugen 5416/缺氧模型

Sugen 5416 是一種3-吲哚-2-酮化合物,其主要作用是拮抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶1/2(VEGFR1、VEGFR2)、抑制血管生成,可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓。通過(guò)給大鼠單次皮下注射Sugen 5416(劑量為20 mg/kg),隨后置于常壓常氧條件下飼養(yǎng)5 周,即可觀察到肺動(dòng)脈高壓癥狀[51]。當(dāng)將Sugen 5416 與慢性缺氧暴露聯(lián)合應(yīng)用,即單次注射Sugen 5416 后繼續(xù)進(jìn)行慢性缺氧暴露3 周,可誘導(dǎo)出現(xiàn)更為嚴(yán)重的肺動(dòng)脈高壓癥狀[52]。小鼠需要持續(xù)暴露于10% O2的環(huán)境下,并每周腹腔注射1次Sugen 5416(劑量為20 mg/kg),給藥持續(xù)3 周,才可建立Sugen 5416/缺氧模型[53]。Sugen 5416/缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓主要的組織學(xué)特征為肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肺血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)度肥大/增殖。Sugen 5416 可直接抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖,從而形成閉塞性叢狀病變[54]。與單純慢性缺氧模型不同,Sugen 5416/缺氧模型的病變是不可逆轉(zhuǎn)的[55]。

在Sugen 5416/缺氧模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步改進(jìn)得到了Sugen 5416/缺氧/常氧模型。該模型動(dòng)物在單次注射Sugen 5416 后經(jīng)過(guò)低壓缺氧3 周,然后恢復(fù)到常壓氧環(huán)境下飼養(yǎng)10 周[56-57]。Sugen 5416/缺氧/常氧模型組動(dòng)物的右心室游離壁/左心室+隔膜重量比在第1 周即顯著升高,小動(dòng)脈開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的阻塞,隨后經(jīng)過(guò)10 周的復(fù)氧,形成了嚴(yán)重復(fù)雜閉塞性叢狀病變形成[56]。該模型誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓與人類(lèi)肺動(dòng)脈高壓的特征十分相似。

Sugen 5416 具有特異性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的能力,并通過(guò)在持續(xù)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體發(fā)揮作用。Sugen 5416 可抑制VEGFR、TGF-β1/Smad2/Smad3、MAPK、BMPR2、HIF-1α、Rho 激酶,同時(shí)激活右心室巨噬細(xì)胞募集以及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子NF-κB的表達(dá)。這導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的無(wú)序增殖,并引起肺內(nèi)血管周?chē)装Y細(xì)胞的聚集,這些因素共同促成嚴(yán)重的血管阻塞性和叢狀病變的發(fā)生[58-63]。然而,這些癥狀與物種和性別存在密切關(guān)聯(lián)。研究顯示,雌性大鼠的雌激素和孕激素能夠減少Sugen 5416 引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而降低發(fā)生肺動(dòng)脈高壓的風(fēng)險(xiǎn)[64]。另外,在建立Sugen 5416/缺氧/常氧小鼠模型時(shí)采用了類(lèi)似Sugen 5416/缺氧/常氧大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的方案。小鼠在模型中表現(xiàn)出肺動(dòng)脈壓升高和肺小動(dòng)脈內(nèi)側(cè)壁增厚等肺動(dòng)脈高壓的癥狀,但沒(méi)有明顯的肺血管閉塞性病變,也缺乏與大鼠模型和晚期肺動(dòng)脈高壓患者相似的右心室衰竭和血管重塑[65]。相比之下,Sugen 5416/缺氧/常氧大鼠模型更具有與人類(lèi)肺動(dòng)脈高壓相似的嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓癥狀。因此該模型被廣泛應(yīng)用于研究肺動(dòng)脈高壓,并被認(rèn)為是最常用的嚙齒動(dòng)物模型之一。

近年來(lái),與Sugen 5416 相關(guān)的雙擊模型不斷出現(xiàn)。其中,無(wú)胸腺(T 細(xì)胞缺陷)的大鼠只需單劑量Sugen 5416 即可誘發(fā)嚴(yán)重的肺動(dòng)脈高壓,并且其炎癥程度更為嚴(yán)重[66]。另一種模型是使用Sugen 5416 聯(lián)合左肺切除術(shù),在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)血管閉塞性肺動(dòng)脈高壓。該模型表現(xiàn)出的癥狀與細(xì)胞增殖和促凋亡信號(hào)通路的激活相關(guān)[67-68]。此外,單次皮下注射Sugen 5416(劑量為20 mg/kg)聯(lián)合腹腔持續(xù)注射嗎啡(劑量為10 mg/kg)35 d,也能誘發(fā)大鼠出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓。嗎啡的使用會(huì)加重Sugen 5416 引起的肺動(dòng)脈高壓癥狀,包括近端血管平滑肌的肥大、內(nèi)膜病變以及右心室肥大[69]。

1.4 血吸蟲(chóng)模型

與肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的寄生蟲(chóng)病中,最常見(jiàn)為血吸蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)病可由曼氏血吸蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng)引起,并可導(dǎo)致血吸蟲(chóng)性肺動(dòng)脈高壓(chistosomiasisinduced pulmonary arterial hypertension,SchPAH)[70]。相對(duì)于雄性小鼠,雌性小鼠對(duì)血吸蟲(chóng)的感染更為敏感,因此常使用雌性C57/BL6 成年小鼠作為模型動(dòng)物。建立SchPAH 模型的方法是使用含有曼氏血吸蟲(chóng)75~100 個(gè)尾蚴(用于亞急性研究)或30 個(gè)尾蚴(用于慢性研究)的混懸液經(jīng)皮感染。在亞急性研究中,小鼠的肺部幾乎沒(méi)有蟲(chóng)卵以及肺血管重塑的出現(xiàn)。但在慢性感染的研究中,建模12周后小鼠出現(xiàn)明顯的肺血管重塑,并伴有血管周?chē)装Y以及叢狀病變。然而,亞急性感染和慢性感染研究中,右心室收縮壓或右心室游離壁/左心室+隔膜比率并未升高[71]。

Graham 等[72]對(duì)血吸蟲(chóng)模型進(jìn)行了改進(jìn),首先,將小鼠的尾巴放入含有30~35 個(gè)尾蚴的燒瓶中,經(jīng)皮感染持續(xù)30 min。55 d 后,將懸浮在0.5 mL 無(wú)菌鹽水的5000 個(gè)活卵通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi),以此對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)攻擊。蟲(chóng)卵的靜脈攻擊模擬慢性感染中小鼠形成側(cè)支分流,并使蟲(chóng)卵通過(guò)側(cè)支分流沉積在肺部這一過(guò)程。Kumar 等[73]在此基礎(chǔ)上對(duì)模型進(jìn)一步改進(jìn),首先使用血吸蟲(chóng)卵(每克體重240 個(gè)蟲(chóng)卵)進(jìn)行腹膜內(nèi)致敏,以引發(fā)小鼠的免疫細(xì)胞應(yīng)答。隨后,經(jīng)過(guò)兩周的時(shí)間,經(jīng)小鼠尾靜脈注射血吸蟲(chóng)卵(每克體重175 個(gè)蟲(chóng)卵)進(jìn)行靜脈內(nèi)攻擊,致使卵團(tuán)栓塞至肺部,從而驅(qū)動(dòng)Ⅱ型免疫反應(yīng)。這種新方法制備的血吸蟲(chóng)模型能夠模擬人類(lèi)血吸蟲(chóng)性肺動(dòng)脈高壓的關(guān)鍵病理特征,包括Th2 炎癥、血管重塑和右心室收縮壓升高。此外,這種建模方法實(shí)驗(yàn)周期較短和死亡率較低[74]。

除了曼氏血吸蟲(chóng)外,日本血吸蟲(chóng)也被證實(shí)可引起實(shí)驗(yàn)性肺動(dòng)脈高壓。Kassa 等[75]使用與Kumar等[73]相同的方案建立日本血吸蟲(chóng)誘導(dǎo)模型。研究結(jié)果顯示,日本血吸蟲(chóng)感染引起了小鼠的血管重塑和血管炎癥。然而,與曼氏血吸蟲(chóng)模型相比,日本血吸蟲(chóng)感染引起的癥狀較為輕微。

1.5 肺切除術(shù)聯(lián)合野百合堿或者Sugen 5416 模型

大鼠實(shí)施左肺切除手術(shù)1 周后,通過(guò)單次皮下注射MCT 60 mg/kg 或Sugen 5416 25 mg/kg,可在4周內(nèi)引發(fā)嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓和進(jìn)行性右心衰竭[67,76]。該模型成功模擬了肺血流量增加導(dǎo)致的肺血管重塑,在模型組大鼠中觀察到叢狀血管損傷、內(nèi)膜增厚、遠(yuǎn)端小動(dòng)脈血管栓塞、血管炎癥以及肺動(dòng)脈和右心室壓力顯著增高等癥狀[77]。將左肺切除術(shù)與野百合堿或Sugen 5416 相結(jié)合可建立比單獨(dú)使用野百合堿、缺氧或其他方法更為可靠的嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓模型。然而,該模型要求技術(shù)人員熟知大鼠的解剖結(jié)構(gòu),并具備熟練的外科技能。術(shù)中需要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,而術(shù)后恢復(fù)同樣是模型制備成功的關(guān)鍵步驟。由于該模型需要特殊的手術(shù)技巧以及嚴(yán)格的環(huán)境要求,其使用受到一定限制。

1.6 其他動(dòng)物

由于價(jià)格低廉和技術(shù)簡(jiǎn)單,并且易于進(jìn)行大規(guī)模的獨(dú)立實(shí)驗(yàn),使得嚙齒類(lèi)動(dòng)物成為許多實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最多的肺動(dòng)脈高壓模型。除此之外,還有其他的動(dòng)物用于制備肺動(dòng)脈高壓模型,Zeng 等[78]使用西藏小型豬單次腹腔注射MCT(劑量為12 mg/kg)成功制備肺動(dòng)脈高壓模型。Cao 等[79]通過(guò)在家兔胸部做正中切口行開(kāi)胸術(shù),將左頸動(dòng)脈與肺動(dòng)脈主干吻合以產(chǎn)生慢性左向右分流,3 個(gè)月后成功建立了高流量肺動(dòng)脈高壓模型。然而,上述這些動(dòng)物模型應(yīng)用并不常見(jiàn),可能與動(dòng)物的來(lái)源以及模型的制備難度有關(guān)。

上述肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型均有各自的特點(diǎn),現(xiàn)歸納各模型的制備過(guò)程以及涉及到的病理特征等如下(見(jiàn)表1、表2)。

表1 肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕婕暗牟±磉^(guò)程以及信號(hào)分子通路Table 1 Pathological process and signaling molecular pathways of PAH animal model

表2 肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型制備Table 2 Preparation of PAH animal models

2 細(xì)胞模型

建立合適且可靠的肺動(dòng)脈高壓體外模型對(duì)于研究疾病的病理機(jī)制以及探索分子機(jī)制具有重要意義,同時(shí)也有助于使用簡(jiǎn)單且可重復(fù)的技術(shù)來(lái)發(fā)現(xiàn)以及測(cè)試新的治療方法。體外細(xì)胞模型具有易于獲得、可重復(fù)利用、可再現(xiàn)心臟和血管的細(xì)胞和細(xì)胞外生態(tài)環(huán)境的特點(diǎn),并能顯示出細(xì)胞正常的生理特征。目前,用于構(gòu)建肺動(dòng)脈高壓體外模型的細(xì)胞主要包括肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。

2.1 物理?yè)p傷

肺動(dòng)脈高壓的標(biāo)志性特征包括內(nèi)皮功能障礙、內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖、凋亡和遷移。通過(guò)將肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞或者肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞置于低氧室(通常是2%~10% O2)培養(yǎng)24 h,可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙以及平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖、凋亡和遷移。Hua 等[80]將肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞置于10% O2低氧箱培養(yǎng)24 h,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,NO 水平降低,細(xì)胞失去了其典型的鵝卵石形態(tài)和特征基因,從而確認(rèn)內(nèi)皮損傷模型建模成功[81-82]。Wang 等[83]將肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞置于低氧箱(5% O2、90% N2)中培養(yǎng)48 h,觀察發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞增殖增加以及凋亡抑制,可判斷細(xì)胞模型建造成功。而Hu 等[84]研究顯示,缺氧損傷會(huì)激活A(yù)KT/mTORC1 通路,從而誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖和遷移。

物理缺氧損傷細(xì)胞模型因其操作簡(jiǎn)便、損傷效果明顯且可避免造模劑帶來(lái)的額外影響等優(yōu)點(diǎn),目前被廣泛應(yīng)用于制備研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞功能損傷相關(guān)模型。缺氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷機(jī)制與人類(lèi)肺動(dòng)脈高壓所表現(xiàn)的病理?yè)p傷相似。

2.2 化學(xué)損傷

野百合堿吡咯是野百合堿的活性代謝物,Liu等[85]使用MCTP(劑量為50 μg/mL)與肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)12~48 h,模擬野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。研究顯示,MCTP 可降低NO 的水平、減少內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及增加細(xì)胞凋亡[7]。引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因子還包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、白介素-1β 以及腫瘤壞死因子-α 等,這些因子可刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,而內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是炎癥應(yīng)激與內(nèi)皮功能障礙之間復(fù)雜相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[86-87]。

血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)能夠促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖和遷移。因此,Wu等[1]在研究胰高血糖素樣肽-1 受體激動(dòng)劑線粒預(yù)防肺動(dòng)脈高壓的分子機(jī)制過(guò)程中,使用PDGF-BB(20 ng/mL)與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h,模擬肺動(dòng)脈高壓中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程,并利用該模型揭示肺動(dòng)脈高壓患者的潛在治療靶點(diǎn)。

常見(jiàn)用于構(gòu)建體外模型的其他因子包括腫瘤壞死因子-α 以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1。Cheng 等[88]對(duì)Claudin-1 是否參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行了研究。他們通過(guò)將肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞與腫瘤壞死因子-α(劑量為10 ng/mL)共同培養(yǎng)24 h,模擬肺動(dòng)脈高壓中炎性因子引起平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖和遷移增強(qiáng)的病理過(guò)程,并揭示了這些過(guò)程可能與ERK1/2 和NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)。而Feng 等[89]則使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h,誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移增加,并揭示該病理過(guò)程與PI3K/Akt 和ERK 信號(hào)通路的相關(guān)性。

綜上所述,目前常用于制備內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞損傷模型的損傷因素均被證實(shí)與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系,可較好地模擬與肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的病理過(guò)程。這些模型在細(xì)胞損傷機(jī)制方面具有相似性,例如抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮的生成,誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的炎癥損傷等,但又具有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求可以選擇適宜的細(xì)胞模型,以獲得期望中的結(jié)果。細(xì)胞模型易于培養(yǎng)、產(chǎn)量可觀,并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可重復(fù)性,可為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。然而,要注意上述的模型僅僅是以血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象,不能全面地反映肺動(dòng)脈高壓的病變過(guò)程,因此,體外細(xì)胞模型的研究結(jié)果仍需得到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的支持。

現(xiàn)將各個(gè)細(xì)胞模型的具體制備方式以及模型涉及的病理機(jī)制歸納總結(jié)如下(見(jiàn)表3)。

表3 肺動(dòng)脈高壓細(xì)胞模型的制備以及模型涉及的病理機(jī)制Table 3 Preparation of PAH cell models and related pathological mechanisms

3 總結(jié)

為了深入研究肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制,探索有效的治療方法,研究人員開(kāi)發(fā)了多種動(dòng)物模型和細(xì)胞模型,并不斷地進(jìn)行改進(jìn)。其中,缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型和野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型被廣泛應(yīng)用。但這些模型僅展現(xiàn)了疾病的早期階段,導(dǎo)致使用這些模型進(jìn)行相關(guān)藥物篩選研究時(shí),僅針對(duì)改善血管的收縮過(guò)程,而忽略了肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)生的血管進(jìn)行性重塑。為了克服這一局限性,肺切除模型、Sugen 5416/缺氧等復(fù)合模型被相繼建立,這些復(fù)合模型展現(xiàn)出了肺動(dòng)脈高壓的中期階段,即血管叢狀病變的癥狀。與動(dòng)物模型相比,細(xì)胞模型在研究分子機(jī)制方面具有明顯的優(yōu)勢(shì),有利于預(yù)測(cè)和驗(yàn)證基因功能,并能微觀地展現(xiàn)細(xì)胞間的代謝情況,同時(shí)節(jié)省構(gòu)建模型的時(shí)間。細(xì)胞模型的不足之處在于缺乏全面性。而動(dòng)物模型能夠直觀地展示肺動(dòng)脈高壓的病理過(guò)程,并更貼近人類(lèi)肺動(dòng)脈高壓的病理特征。

如今隨著分子生物學(xué)、基因技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多與肺動(dòng)脈高壓病癥相符合的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅粯?gòu)建,并且隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的不斷進(jìn)步,未來(lái)將會(huì)出現(xiàn)更加貼近于臨床以及更具穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?從而推動(dòng)人類(lèi)對(duì)肺動(dòng)脈高壓的研究。