魏丹丹汪麗婷龍 潔陳艷焦王 宇楊永清徐玉東*

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡研究所,上海 200030)

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥為主要病理特征的復雜、異質(zhì)性疾病,臨床表現(xiàn)為發(fā)作性咳嗽、氣促、胸悶,以及伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難。重度哮喘(severe asthma,SA)在確診哮喘和控制合并癥的基礎(chǔ)上,需要使用大劑量吸入性皮質(zhì)類固醇激素(corticosteroids,CS),并聯(lián)合控制藥物(如長效β2 受體激動劑、白三烯調(diào)節(jié)劑或茶堿),且/或過去1 年中有≥50%的時間需使用全身性CS 控制,或者采用以上治療癥狀仍不可控。與輕中度哮喘患者相比,SA 患者誘導痰中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎癥細胞數(shù)量升高更為明顯,氣道重塑病理變化更加顯著[1]。SA 雖然只占全部哮喘人數(shù)的5%~10%,卻是哮喘致殘、致死的主要原因[2]。SA的發(fā)病機制和治療靶點成為目前哮喘研究的熱點之一。

建立一種穩(wěn)定、可復制、便捷,并且能夠重現(xiàn)人類SA 臨床表型和主要病理特征的實驗動物模型,對于研究SA 的發(fā)病機制、藥物治療和預防具有重要意義。本文以“重癥哮喘/重度哮喘/難治性哮喘/激素抵抗型哮喘/激素不敏感型哮喘”為關(guān)鍵詞,檢索中國知網(wǎng)、萬方、PubMed 等文獻數(shù)據(jù)庫收錄的近十年來國內(nèi)外已發(fā)表動物實驗類研究,將從動物選擇、模型制備方法、病理表型等方面對最近十年來SA 模型的構(gòu)建方法與特點進行總結(jié)和分析,為基于SA 動物模型開展的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

1 重度哮喘模型常用實驗動物

目前SA 模型常用實驗動物既有小鼠、大鼠[3]、豚鼠[4]、兔等,也有研究使用大型動物馬進行建模。對近十年的SA 動物模型文獻中動物種屬進行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)顯示小鼠使用率高達90%,說明小鼠是SA研究最常用的實驗動物。小鼠容易誘發(fā)氣道炎癥、氣道高反應性(airway hyperreactivity,AHR)、氣道黏液高分泌等病理變化,因此更適合用于構(gòu)建哮喘模型。其中,尤以BALB/c 品系小鼠最常使用,更容易誘發(fā)出明顯的氣道炎癥和AHR,其造模成功率較高[5],其次為C57BL/6(包括C57BL/6J 和C57BL/6 N)、A/J 品系,其中A/J 小鼠易感哮喘,而且對致敏劑的反應也很強。

由于小鼠的生長發(fā)育較快,在4~6 周時身體各個器官已逐漸成熟,6~8 周即可達到性成熟,所以一般實驗研究選擇正值青壯年的6~8 周小鼠。根據(jù)實驗目的不同也可選擇不同周齡的小鼠,有研究者利用10~14 周齡小鼠構(gòu)建SA 模型,探索SA 的慢性高炎癥負荷對恐懼行為和大腦神經(jīng)免疫通路的影響[6]。此外,有研究使用屋塵螨(house dust mite,HDM)誘導BALB/c 小鼠構(gòu)建過敏性哮喘模型,發(fā)現(xiàn)雌性小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的數(shù)量以及血清HDM 特異性IgE 水平均顯著高于雄性小鼠,但在C57BL/6NJ 小鼠BALF中,雄性小鼠嗜酸性粒細胞的積累高于雌性小鼠;不僅如此,不同性別、品系的小鼠哮喘模型肺細胞因子表達也存在差異,比如雌性BALB/c 小鼠相較于雄鼠更趨向于Th17 細胞免疫反應,IL-17A 表達水平更高,而C57BL/6NJ 雌性小鼠哮喘模型的肺中Th1 細胞因子變化更為明顯[7]。

2 重度哮喘模型的制備方法

2.1 過敏原的選擇

用于制備SA 動物模型的過敏原主要可分為以下幾類:(1)環(huán)境過敏原:包括HDM、蟑螂提取物(cockroach, CRA)、二氧化氮(NO2)等;(2)病原體過敏原:包括轉(zhuǎn)錄腺病毒[8]、流感病毒H3N2[9]、衣原體、 流 感 嗜 血 桿 菌[10]、 呼 吸 道 合 胞 病 毒(respiratory syncytial virus,RSV)等;(3)化合物過敏原:包括卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、三硝基苯(trinitro phenyl, TNP)[11]、 對 甲 苯 二 異 氰 酸 酯(toluene diisocyanate,TDI)[12]等。對近十年來SA模型文獻進行統(tǒng)計,結(jié)果顯示,約51%的研究選用OVA 作為造模的過敏原、約42%的研究選用HDM作為造模的過敏原。目前,最常用的過敏原是OVA和HDM,其中,OVA 是動物哮喘模型應用最廣泛的經(jīng)典過敏原。HDM 是哮喘患者中最易接觸到的環(huán)境過敏原之一,臨床哮喘患者對其過敏率高達85%,使用HDM 誘導SA 模型可以更好地模擬人類哮喘的發(fā)生過程。

2.1.1 單一過敏原造模

指只使用一種過敏原制備SA 動物模型的造模方法。有研究者認為白介素IL-13(interleukin,IL-13)主要介導哮喘炎癥反應,使用含有小鼠IL-13 基因的腺病毒顆粒作為單一過敏原,發(fā)現(xiàn)能夠誘導出具有氣道炎癥、AHR 和粘液分泌、中性粒細胞增多、類固醇激素抵抗(steroids-resistant)等特征的動物模型[8]。此外,化合物TDI 常用于制造泡沫塑料及橡膠、絕緣漆等,是職業(yè)哮喘發(fā)病常見過敏原。有研究者發(fā)現(xiàn)獲得職業(yè)哮喘的患者通常對CS 治療反應差,因此將TDI 作為單一過敏原進行小鼠致敏發(fā)現(xiàn)能夠顯著誘發(fā)產(chǎn)生Th2 和Th17 反應以及激素抵抗[12]。

2.1.2 復合過敏原造模

指使用兩種及兩種以上過敏原制備SA 動物模型的造模方法。復合過敏原多以OVA 和/或HDM聯(lián)合其他過敏原,如OVA+NO2[13]、HDM+流感病毒H3N2[9]、OVA+衣原體、流感嗜血桿菌[10]、OVA+TNP[11]、OVA+HDM+CRA[14]等。有研究者通過OVA 聯(lián)合衣原體、流感嗜血桿菌誘導小鼠發(fā)現(xiàn),感染病菌能夠抑制嗜酸性粒細胞,但不能抑制AHR,BALF 中性粒細胞有明顯升高,使用CS 治療后氣道炎癥和AHR 未改善,提示使用病菌復合過敏原可以誘導類固醇激素抵抗性哮喘(steroids-resistant asthma)模型[10]。除病菌以外,常用的OVA 和HDM也可以聯(lián)合使用作為復合過敏原。有研究者使用OVA+CRA+HDM 多重過敏原對小鼠腹腔致敏及滴鼻激發(fā),與使用單一過敏原相比,復合過敏原更易誘導小鼠產(chǎn)生激素抵抗[14]。

2.1.3 單一過敏原和復合過敏原的比較

使用單一過敏原造模的優(yōu)點在于方法簡單、造模時間短、成本低,但如IL-13 腺病毒、TDI 作為動物造模的過敏原并不常用;使用復合過敏原的優(yōu)點在于造模成功率高,更易產(chǎn)生SA,而且復合過敏原能夠更好的模擬臨床復雜的環(huán)境-免疫的交互作用,但復合過敏原造模流程相對復雜、造模時間長、成本高。此外,對過敏原類型的選擇也和實驗研究目的密切相關(guān),比如TDI 誘導的SA 模型,除了誘發(fā)Th2 細胞炎癥反應以外,還能夠產(chǎn)生顯著的Th17 炎癥反應,用于探索Th17 細胞在SA 發(fā)病中的作用與機制[12];OVA+HDM 等可以構(gòu)建高Th2 型嗜酸粒細胞的SA 模型[14];HDM+LPS 被用于構(gòu)建低Th2 型和高中性粒細胞的SA 模型[15]。

2.2 常見佐劑及其選擇

2.2.1 常見佐劑

佐劑是一類能夠改變免疫應答類型、發(fā)揮輔助作用的非特異性物質(zhì)。目前,臨床上使用最多的佐劑為鋁佐劑,包括氫氧化鋁(Al(OH)3)和磷酸鋁等。研究表明,鋁佐劑可以誘導機體產(chǎn)生強烈的體液免疫,還能夠促進樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)的募集和活化、釋放細胞因子及其他介質(zhì)誘發(fā)炎癥反應[16],因此在SA 造模中常配合使用鋁佐劑加強過敏原的致敏效果。

完全弗式佐劑(complete Freund’ s adjuvant,CFA)屬于油乳類佐劑,可誘導體液免疫反應,增強機體細胞免疫應答能力。在SA 模型中CFA 常和HDM 配合使用誘導增強免疫反應。有研究應用HDM/CFA(1 μg/μL,100 μL)皮下注射致敏小鼠,14 d 后使用HDM(5 μg/μL,20 μL)激發(fā),模型小鼠的肺部中性粒細胞顯著增多并表現(xiàn)出激素抵抗等特征[17]。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)屬于陰離子脂質(zhì)佐劑,是革蘭氏陰性菌獨特的病原相關(guān)分子模式,LPS 可持續(xù)釋放到環(huán)境中并且顯著污染室內(nèi)灰塵,是哮喘嚴重程度的增強因素[18]。有研究者采用LPS 作為佐劑聯(lián)合OVA 建立SA 模型,發(fā)現(xiàn)該模型氣道炎癥以中性粒細胞浸潤為主[3]。有學者給予小鼠模型不同劑量LPS(1 μg 或10 μg),發(fā)現(xiàn)OVA聯(lián)合高劑量的LPS 更易建立高中性粒細胞的SA 哮喘模型,該模型對CS 的治療無效[19]。

環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)屬于核酸類佐劑,存在于多種導致SA 的感染細菌中,cdi-GMP 已被證明是一種有效的粘膜佐劑,可誘導Th1/Th17 反應并伴有低 Th2 反應[20]。有研究者使用HDM 和c-di-GMP 致敏小鼠,隨后用HDM 和低劑量的c-di-GMP 激發(fā),可以成功誘導出小鼠的AHR,且明顯高于單獨使用HDM 誘導的小鼠模型,此外該模型也表現(xiàn)出中性粒細胞顯著增多[21]。

2.2.2 佐劑的選擇

佐劑的使用可以提高免疫應答作用,但同時佐劑的使用離不開過敏原的屬性,常見SA 造模多使用OVA+Al(OH)3、HDM+CFA 或HDM+LPS 等方式。鋁佐劑和OVA 通常使用腹腔/皮下注射致敏的方式,在體內(nèi)誘導CD4+T 細胞向Th2 細胞分化,可增強OVA 的免疫原性。LPS 同樣為環(huán)境中的過敏原,多配合HDM 進行滴鼻或氣管滴注的方式致敏,CFA 作為油乳類佐劑,常用腹腔/皮下注射的方式致敏,在滴鼻和腹腔兩種方式的加持下,提高造模成功率。

2.3 致敏與激發(fā)方法

SA 模型在致敏和激發(fā)的持續(xù)時間、時間間隔、給藥途徑、給藥劑量等雖存在一定差異,但也有以下5 個共同點:(1)動物多次致敏,兩次致敏間隔通常為7~14 d;(2)過敏原激發(fā)多持續(xù)4~7 d,能夠引起較強烈的AHR、氣道炎癥等特征;(3)給藥方式通常為滴鼻、氣管給藥、霧化吸入、腹腔注射、皮下注射等。其中,腹腔注射多在致敏階段使用,氣管給藥和滴鼻多在激發(fā)階段使用;(4)過敏原劑量:致敏階段使用低劑量,激發(fā)階段使用高劑量;(5)多使用Al(OH)3、LPS 或CFA 作為佐劑,能夠獲得較為穩(wěn)定、可重復的SA 動物模型。(具體的方法和內(nèi)容詳見表1)

表1 重度哮喘模型的構(gòu)建方法Table 1 Methods of establishing severe asthma models

3 重度哮喘動物模型的病理表型分析

3.1 氣道炎癥

SA 炎癥反應可根據(jù)氣道Th2 數(shù)量分為高Th2型和低Th2 型。高Th2 型SA 以嗜酸性粒細胞浸潤為主,氣道細胞炎癥因子升高以Th2 分泌的細胞因子為主。IL-4 可誘導幼稚T 細胞向Th2 細胞分化、IL-5 促進骨髓中嗜酸性粒細胞的成熟并釋放IL-13,使嗜酸粒細胞向氣道遷移,通過作用于氣道平滑肌細胞引起氣道反應性[31]。有研究者使用復合過敏原制備SA 模型,與使用OVA 或HDM 等單一過敏原誘導的過敏性哮喘模型比較,OVA+HDM+CRA 多重過敏原誘導SA 模型小鼠的白細胞總數(shù)明顯增多,其中嗜酸性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量顯著升高,肺部Th2 型細胞因子IL-4、IL-5 的表達水平是普通哮喘組的3 倍,IL-13 和Th1 型細胞因子IFN-γ、IL-12 表達水平也顯著升高[14]。目前,針對高Th2 型SA 分泌高水平IgE、IL-5、IL-13 等炎癥介質(zhì),已開發(fā)出相應的靶向藥物用于臨床治療,而低Th2 型SA仍缺乏有效的生物標志物。

低Th2 型(或稱為Th2/Th17 型、中性粒細胞型)SA 模型以肺中性粒細胞浸潤為主要特征,通常表現(xiàn)為較重的氣道炎癥反應和氣道重塑病理變化,且對激素治療反應不敏感,氣道細胞因子表達以Th1 細胞分泌的IFN-γ 和IL-12 以及Th17 細胞分泌的IL-17A 為主,其中IL-17A 被證明可以降低人氣道上皮對CS 的敏感性[32]。采用HDM 和LPS 聯(lián)合誘導低Th2 型SA 小鼠模型,其肺組織炎癥細胞總數(shù)及巨噬細胞計數(shù)經(jīng)地塞米松(dexamethasone,Dex)治療后顯著下降,而肺中淋巴細胞和中性粒細胞浸潤及AHR 不能被有效抑制,在Dex 治療后反而促進Th1 細胞因子IFN-γ、IL-12 以及Th17 細胞因子IL-17A 等的表達增加[15]。用高劑量LPS 聯(lián)合三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)刺激過敏原裝載后的DCs,并且將這些細胞通過鼻腔滴注的方式致敏小鼠,在過敏原激發(fā)后該模型表現(xiàn)出SA 的特征,氣道中性粒細胞和Th17 細胞數(shù)量明顯增多,IL-17A 分泌水平顯著升高,與氣道滴注低劑量LPS刺激的過敏原轉(zhuǎn)載DCs 相比,該模型組的氣道重塑病理變化顯著增強。進一步研究發(fā)現(xiàn),在中性粒細胞炎癥基礎(chǔ)上,IL-17A 對氣道結(jié)構(gòu)細胞(如成纖維細胞等)的作用加重了該模型的氣道重塑水平[33]。也有研究表明低Th2 型SA 小鼠模型對于抗IL-17F的治療有效,而對抗IL-17A 的治療無效,提示IL-17F 在SA 炎癥病理反應中發(fā)揮重要作用[12]。

3.2 氣道高反應性

AHR 是哮喘的基本特征,能夠直接或間接通過運動、冷空氣、過度換氣誘發(fā),引起氣道平滑肌收縮,從而導致氣道變窄和氣流受限。哮喘的AHR 主要有兩種表現(xiàn)形式:其一表現(xiàn)為短暫的、可誘發(fā)的,通常發(fā)生在過敏原暴露后,在吸入CS 治療或環(huán)境控制后可迅速緩解,這種短暫的AHR 對間接刺激更為明顯,研究認為其與氣道炎癥病理密切相關(guān);其二表現(xiàn)為持久性,多見于SA,在吸入CS 或環(huán)境控制后仍難以緩解,多繼發(fā)于慢性氣道炎癥所導致的結(jié)構(gòu)性氣道變化[34]。

在哮喘患者中,氣道敏感性、反應性和最大反應都明顯增強。但是,與輕中度哮喘相比,SA 患者的氣道敏感性更高。在相同的1 s 秒內(nèi)用力呼氣量(FEV1)的變化率下,引起SA 的氣道最大反應的刺激物濃度低于輕中度哮喘患者[35]。同樣,在SA 動物模型中,有學者發(fā)現(xiàn)患有牧場哮喘(pasture asthma, PA)的馬匹具有重度AHR,與對照馬匹相比,患有PA 的馬匹吸入乙酰甲膽堿(methacholine,Mch)后,肺阻力的平均百分比變化明顯更大,且誘發(fā)PA 馬匹氣道收縮反應的過敏原濃度更低,表明PA 馬匹氣道敏感性更強。同時低濃度Mch(＜1 mg/mL)引起PA 的馬匹肺阻力增加40%,而對照組在較高劑量(8 ~ 16 mg/mL)下肺阻力仍無明顯變化[36]。

除了牧草馬哮喘,有研究者通過OVA 特異性Th1 細胞過繼轉(zhuǎn)輸,誘發(fā)Th1 細胞介導的SA 小鼠模型,與普通哮喘模型組相比,發(fā)現(xiàn)SA 組小鼠肺阻力升高更加明顯,AHR 更顯著增強[37]。不僅如此,有研究者使用HDM 和流感病毒H3N2 誘導SA 小鼠模型,分別在第4、8、10、15 天檢測肺阻力,與僅使用HDM 誘導的普通哮喘組相比,流感病毒H3N2 誘導的SA 小鼠表現(xiàn)出較早、較高的氣道阻力值,AHR 持續(xù)時間延長,且對低濃度的Mch 敏感性更高[9]。

3.3 氣道重塑

由于哮喘氣道炎癥造成氣道組織結(jié)構(gòu)反復損傷刺激,最終引起的氣道壁結(jié)構(gòu)變化被稱為氣道重塑。其主要病理特征包括氣道平滑肌細胞增殖肥大、上皮完整性喪失、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、杯狀細胞化生、粘液分泌過多、上皮下纖維化、網(wǎng)狀基底膜增厚和血管生成等,均可導致不可逆轉(zhuǎn)的肺功能喪失[38]。SA 患者與輕中度哮喘患者比較,氣道重塑更為明顯,主要表現(xiàn)為支氣管壁增厚,支氣管內(nèi)徑變窄,支氣管壁面積百分比增大,導致有效通氣面積減小氣道阻力顯著增大,構(gòu)成阻塞性通氣障礙[39]。

利用OVA+CRA+HDM 多重過敏原誘導小鼠SA 模型,發(fā)現(xiàn)小鼠氣道上皮杯狀細胞內(nèi)黏液分泌降低,而細胞外的黏液栓塞明顯增強,同時平滑肌層厚度和肺組織纖維化程度高于輕中度哮喘模型[14]。在OVA 誘導的哮喘小鼠模型過敏原激發(fā)階段(第5~55 天),使小鼠反復暴露于低劑量的流感嗜血桿菌(1×107CFU,每周1 次,共8 次),能夠使小鼠氣道Th2 細胞主導的嗜酸粒細胞炎癥表型,轉(zhuǎn)變?yōu)門h17 細胞主導的中性粒細胞炎癥表型,同時導致哮喘模型氣道黏液分泌增加和氣道重塑加重,主要表現(xiàn)為上皮下和血管周圍空間的膠原蛋白沉積和肌肉層增厚,α-平滑肌肌動蛋白和幾種主要膠原蛋白增加[40]。此外,Th17 相關(guān)細胞因子IL-17A 和IL-22在中性粒細胞型SA 中發(fā)揮了重要作用,并參與氣道重塑。IL-17A 在SA 哮喘患者痰液中增加,誘導上皮細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞表達“促纖維化”細胞因子,并在體外研究中激發(fā)人氣道平滑肌細胞遷移,IL-22 可促進肌成纖維細胞分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及體外平滑肌的增殖、遷移,在慢性SA 小鼠模型中,氣道重塑以上皮下纖維化、粘液過度生成、平滑肌細胞增生和肥大、高表達IL-17A 和IL-22 為主要特征[41]。由此看來,SA 哮喘小鼠模型氣道細胞纖維化高、細胞過度增殖遷移、粘液分泌加重,氣道重塑與中性粒細胞型炎癥密切相關(guān)。

由于小鼠的氣道壁是一種較薄的組織結(jié)構(gòu),因此小鼠哮喘模型中氣道重塑的研究較少涉及氣道平滑肌的變化,主要聚焦于氣道上皮下纖維化。而大鼠哮喘模型在過敏原致敏和反復激發(fā)后,通常能夠表現(xiàn)出氣道平滑肌增生肥厚等組織病理學變化,這些氣道重塑變化與大鼠模型的AHR 程度密切相關(guān)[42]。但是,有研究指出大鼠類固醇抵抗組與皮質(zhì)類固醇激素敏感哮喘組相比,兩者在杯狀細胞增生、上皮下膠原厚度和氣道平滑肌重塑方面無顯著差異[3]。因此,SA 動物模型中氣道重塑的研究存在一定生理性局限,其在SA 疾病中的病理表型差異性以及診斷價值,仍有待闡明。

3.4 激素抵抗

臨床上,SA 患者盡管接受了高劑量的激素治療,但仍會出現(xiàn)難以控制的哮喘癥狀,被稱為激素抵抗性哮喘。有證據(jù)表明糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)異常、核組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2,HDAC2)活性降低等可導致激素抵抗的發(fā)生和發(fā)展[43]。此外,非編碼RNA、細胞自噬等因素在激素抵抗中的作用也是近年研究的熱點。

通過OVA 和衣原體病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒H1N1、 RSV 合并感染BALB/c 小鼠誘導SSIAAD ( severe steroid-insensitive allergic airway disease)新型小鼠模型,小鼠肺部miRNA-21 表達水平增加,而miR-21 靶磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)的表達減少,并且與AKT 磷酸化水平增加和HDAC2 水平降低有關(guān),通過抑制miR-21 或PI3K,小鼠對CS 治療的敏感性恢復[44]。反復接觸過敏原也可導致小鼠對CS 不敏感,與單次LPS 激發(fā)相比,A/J 小鼠經(jīng)3 d 的LPS(0.1 mg/mL,每只40 μL,每天兩次)鼻內(nèi)激發(fā),HDAC2 和核因子E2 相關(guān)因子2(Nrf2)水平顯著降低,AKT 磷酸化水平增加,丙酸氟替卡松對其氣道炎癥的抑制作用明顯減弱[45]?？傊?激素抵抗是SA 的重要病理特征,制備新型SA 模型能夠更深入地研究其發(fā)病機制,并開發(fā)新的治療藥物。

3.5 其他

除氣道炎癥、AHR、氣道重塑和激素抵抗等病理表型外,SA 動物模型也表現(xiàn)出不同的分子表型,如NOD 樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、外泌體、miRNA、唾液結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素9(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-9,Siglec-9)等特征性分子,這些分子可能成為SA 的特征性診斷標記物或治療靶點。

NLRP3 炎性小體是一種存在于細胞漿中的多蛋白復合物,由凋亡相關(guān)斑點樣蛋片(ACS)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)以及NOD 樣受體蛋白組成,它是一種重要的炎癥介質(zhì),參與多種炎癥反應核免疫調(diào)節(jié)過程[46]。使用衣原體、流感嗜血桿菌以及OVA 誘導SA 小鼠模型,表現(xiàn)為氣道中性粒細胞、NLRP3、IL-1β 表達增高,靶向NLRP3 的治療可以減少IL-1β 的產(chǎn)生,降低SA 模型中性粒細胞炎癥和AHR[10]。臨床證據(jù)也表明,SA 患者肺組織、誘導痰中NLRP3 和IL-1β 的表達增多,這可能與中性粒細胞比例增加以及哮喘控制不佳有關(guān)[47]。此外,有研究顯示參與 SA 發(fā)病機制的所有類型的細胞都會產(chǎn)生和分泌外泌體,外泌體含有蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、細胞因子和生長因子以及共刺激分子,因此可以調(diào)節(jié) SA 中的免疫炎癥反應[48]。miRNA 是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,它在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細胞功能,參與調(diào)節(jié)哮喘等肺疾病,其中miR-9 可調(diào)節(jié) GR信號和AHR,miR-21 能夠抑制 Th1 相關(guān)細胞因子的表達。哮喘小鼠敲除miR-21 表現(xiàn)為嗜酸粒細胞炎癥減少,Th1 型細胞因子增加[49]。因此,miR-9 和miR-21 可以作為SA 模型的輔助檢測指標。此外,Siglec-9 是特異性表達于中性粒細胞的抑制性唾液酸聚糖受體,當Siglec-9 與特異性配體或抗體結(jié)合,可誘導中性粒細胞凋亡或自噬,有助于促進中性粒細胞炎癥消退,是治療SA 中性粒細胞增多的潛在靶標[50]。

4 總結(jié)與展望

目前,SA 動物模型的制備在動物品系、過敏原種類、致敏和造模方法等方面存在諸多差異,通過總結(jié)近十年的SA 模型造模方案,發(fā)現(xiàn)動物選擇多以BALB/c 小鼠為主。致敏原可分為環(huán)境過敏原、病原體過敏原、化合物過敏原三大類,根據(jù)過敏原使用形式的不同,還可分為單一過敏原和復合過敏原,多配合佐劑來增強模型動物的免疫應答反應。動物接受過敏原致敏次數(shù)通常不少于2 次,并通過多次反復的過敏原激發(fā)進行誘導,過敏原的給藥方式多選用皮下或腹腔注射、氣管滴入或霧化吸入等。

在SA 動物模型病理表型方面,以高Th2 型或低Th2 型區(qū)分表型,伴有氣道炎癥、氣道重塑、AHR加重,細胞因子顯著增高、激素抵抗等特征。SA 動物模型可表現(xiàn)出較早、較高的氣道阻力值,氣道敏感性更高,且AHR 持續(xù)時間延長,氣道重塑病理變化加重。

此外,SA 動物模型的研究仍存在許多問題。(1)臨床SA 患者對異體蛋白過敏引發(fā)哮喘的較少,而動物造模時選用OVA 腹腔或皮下注射致敏具有明顯的局限性,使用病毒感染、環(huán)境中提取過敏原更符合臨床;(2)在研究激素抵抗時多選用Dex 腹腔注射,而臨床較少使用Dex 治療,多使用吸入性氫化可的松或甲潑尼龍;(3)目前SA 動物模型的表型較為簡單,還不能充分模擬SA 患者的復雜臨床表型,選用合適的過敏原(多重聯(lián)合過敏原等)、佐劑以及致敏和激發(fā)方案,同時利用基因編輯等方法可能有助于構(gòu)建具有特定臨床表型的SA 模型;(4)在SA 動物模型中通過傳統(tǒng)的氣道炎癥、AHR、氣道重塑、激素抵抗等指標進行評估以外,可以結(jié)合NLRP3 炎性小體、外泌體和特定miRNA 等進行SA病理表型分析。

綜上所述,今后還需針對SA 臨床表型進一步優(yōu)化動物模型的構(gòu)建方法,建立能夠更好地模擬人類SA 病理變化的實驗動物模型,進而加深對SA 發(fā)病機制的研究,發(fā)現(xiàn)新的干預靶點,并最終開發(fā)出新的SA 預防和治療藥物。