余金玉,韓 靜,張 營,侯 亮,余 穩(wěn)

(長江航運總醫(yī)院,武漢 430000)

左心室肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)是高血壓性心臟病的一個重要特征,主要涉及心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞增殖引起的纖維化[1]。LVH 是多種心血管不良事件的誘發(fā)因素,例如心律失常、心力衰竭、心肌梗塞,甚至猝死[2-3]。逆轉高血壓LVH,降低心血管并發(fā)癥的發(fā)生率和患者死亡率是高血壓治療的重點[4]?；ㄆ焖伤?taxifolin,TAX)又名二氫槲皮素,是一種植物黃酮類化合物,可用于預防和治療心血管疾病[5],具有抗高血壓作用[6]。最近的研究顯示,TAX 可呈濃度依賴性地抑制血管緊張素II(Ang II)誘導的心肌細胞肥大,并可減輕壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚及心肌纖維化[7-8],是治療心肌肥厚和纖維化的潛在候選藥物。然而,關于TAX 對心肌肥厚的調控機制知之甚少。

內質網(wǎng)應激( endoplasmic reticulum stress,ERS)可促進高血壓期間的心肌細胞凋亡,與心肌肥厚的發(fā)病機制有關[9-10]。據(jù)報道,ERS 抑制可減輕高血壓患者的心臟損傷和壓力超負荷誘導的心臟肥大[11-12]。因此,ERS 可能是改善病理性心肌肥厚的重要干預靶點。蛋白激酶R 樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK) -轉錄激活因子4(activating transcription factor 4, ATF4)通路是ERS 的主要轉導通路,其激活可促進心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞活化[13];而抑制PERK-ATF4 通路可減輕心肌肥厚[14]。在腫瘤中,TAX 被報道可通過調控ERS 抑制非小細胞肺癌細胞增殖并促進細胞凋亡[15]。然而,TAX 對心肌肥厚的保護作用是否與ERS 有關尚未見報道。因此,本研究旨在確定PERK-ATF4 通路介導的ERS是否參與了TAX 在高血壓心肌肥厚中的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性15 周齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)(n=24,體重260~300 g),SPF 級雄性15 周齡正常血壓Wistar-Kyoto(WKY)大鼠(n=8,體重280~320 g),由北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2019-0009]提供,在武漢大學人民醫(yī)院動物實驗中心[SYXK(鄂)2020-0027]飼養(yǎng)。保持在恒溫(23~24℃)恒濕(50%~60%)的環(huán)境中,光照時間為12 h/12 h 光暗循環(huán),可自由獲取水和食物。本研究經武漢大學人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(IACUC-202103005),并符合實驗動物使用的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

TAX(純度≥85%,美國Sigma-Aldrich 公司,批號78666);PERK 激活劑CCT020312(CCT,純度98.97%,美國MedChemExpress 公司, 批號HY-119240);小麥胚芽凝集素(WGA)溶液(美國Sigma-Aldrich 公司,批號L4895);蘇木精伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色試劑盒、Masson 三色染色試劑盒(北京Solarbio 公司,批號G1120、G1340);兔源一抗葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulatory protein 78,GRP78)(批號#3183)、p-PERK(批號#3179)、PERK(批號#3192)、ATF4(批號#11815)、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP) (批號#3082)、β-肌動蛋白(β-actin)(批號#4970)均購自美國Cell Signaling Technology 公司。BP-2010A 智能無創(chuàng)血壓計(北京Softron 科技有限責任公司);Vevo 2100 超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics 公司);Eclipse C1 Plus 共聚焦顯微鏡(日本Nikon 公司);SmartSpec Plus 分光光度計、ChemiDocTMXRS 凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad 公司);ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及干預

適應性飼養(yǎng)1 周后,將24 只SHR 隨機分為3組(n=8):SHR 組(SHR 對照組)、TAX 組(20 mg/kg TAX)[6]、TAX+CCT 組(20 mg/kg TAX+2 mg/kg CCT)[16]。8 只同齡WKY 大鼠作為WKY 組(正常對照組)。TAX 組灌胃給予20 mg/kg TAX,TAX+CCT 組在給予等量TAX 灌胃的同時腹腔注射2 mg/kg CCT,SHR 和WKY 組每天給予相同體積的生理鹽水灌胃和腹腔注射。每天1 次,共給藥8 周。

1.3.2 血壓測量

分別于治療前和治療后2、4、8 周用BP-2010A智能無創(chuàng)血壓計采用尾套法測量收縮壓(systolic blood pressure, SBP) 和舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)。在測量前將每只大鼠置于加熱管(38℃)中10 min 以提高其體溫。每組大鼠平行測定,每只大鼠測量3 次,取平均值。

1.3.3 超聲心動圖

治療8 周后,通過腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,使用小動物超聲成像系統(tǒng)檢測大鼠舒張期室間隔厚度(diastolic interventricular septum,IVSd)、收縮期室間隔厚度(systolic interventricular septum, IVSs)、左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)判斷心肌肥厚程度和心臟功能。

1.3.4 心臟指數(shù)、左心室指數(shù)

心臟功能檢測結束后,稱量大鼠體重,然后取出心臟,用冰冷的生理鹽水沖洗。濾紙吸干表面殘留液體后,稱取心臟總重量,隨后解剖分離左心室并稱重,計算心臟指數(shù)和左心室指數(shù)。

心臟指數(shù)=心臟總重量(mg)/體重(g)

左心室指數(shù)=左心室重量(mg)/體重(g)

1.3.5 HE 染色、WGA 染色和Masson 染色評估心肌組織病理學變化

從左心室心尖切下部分心肌組織,立即用冰冷的磷酸鹽緩沖液清洗,用4%多聚甲醛固定過夜,然后包埋在石蠟中。隨后,制備左心室的橫向切片(約5 μm 厚)并放置在載玻片上。接下來,用蘇木精和伊紅以及Masson 三色試劑對切片進行染色,顯微鏡下觀察染色結果,并在Masson 三色試劑染色的切片中測量纖維化面積(藍色膠原沉積),計算膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction, CVF)。CVF=(膠原面積/心肌總面積)×100%。

為了確定心肌細胞橫截面積,將心肌組織切片脫蠟、再水化,并用EDTA 抗原修復溶液進行抗原修復處理。洗滌后,將切片與用FITC 標記的WGA 溶液(1 ∶200)在37℃避光孵育30 min,然后與DAPI在室溫下放置10 min。最后,用抗褪色封固劑封固載玻片,使用熒光顯微鏡觀察染色的細胞,每張切片隨機選擇5 個非重復視野,拍攝圖像。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析心肌細胞橫截面積。

1.3.6 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

檢測心肌組織中心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、 B 型 利 鈉 肽(B-type natriuretic peptide,BNP)、I 型膠原蛋白α1 鏈(collagen I α1 chain,COL1A1)和Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈(collagen Ⅲα1 chain,COL3A1)mRNA 表達

使用TRIzol 試劑從冷凍的左心室心肌組織中提取總RNA。通過SmartSpec Plus 分光光度計使用A260/A280 比率對RNA 純度進行測定。使用Transcriptor First Strand cDNA 合成試劑盒將總RNA(每份樣品2 μg)逆轉錄成cDNA。使用LightCycler 480 SYBR-Green I Master mix 進行qRT-PCR。在95℃初始變性5 min 后,總共進行了42 個引物延伸循環(huán),每個循環(huán)包括95℃ 10 s 變性、60℃ 20 s 退火、72℃ 20 s 延伸。使用2-ΔΔCt方法進行基因相對表達分析。將結果標準化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的mRNA 表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3.7 Western blot 檢測心肌組織PERK-ATF4 通路相關蛋白表達

在RIPA 裂解緩沖液中提取大鼠左心室心肌組織總蛋白,并通過在4℃下以12 000 r/min 離心10 min 去除碎片獲得上清液。使用二辛可寧酸測定法測定樣品中的蛋白質濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取的蛋白質。然后,將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h。然后按照Marker 標記的分子量將膜水平切割,并在4℃下與相應的一抗(GRP78(1 ∶1000)、p-PERK(1 ∶1000)、PERK(1 ∶1000)、ATF4(1 ∶500)、CHOP(1 ∶1000)、β-actin(1∶4000))孵育過夜。將膜用TBST 洗滌后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1 ∶2000)在室溫下孵育2 h。ECL 試劑顯色并使用ChemiDoc? XRS 凝膠成像分析儀掃描印跡。使用Image J 軟件測定蛋白質條帶的灰度值,并使用β-actin 作為內部對照,計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(±s)表示。使用GraphPad Prism 8.0 軟件,通過單因素方差分析和SNK-q檢驗來評估多組之間的統(tǒng)計顯著性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓變化比較

治療前,各組SHR 大鼠SBP、DBP 顯著高于WKY 組(P＜0.05),而SHR 大鼠組間SBP、DBP 差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。治療2、4、8 周后,與SHR 組相比,TAX 組大鼠SBP、DBP 顯著降低(均P＜0.05);與TAX 組相比,TAX+CCT 組在治療4、8 周后SBP、DBP 顯著升高(均P＜0.05)(表2、表3)。

表2 各組大鼠SBP 比較(±s,n=8)Table 2 Comparison of SBP of rats in each group

表2 各組大鼠SBP 比較(±s,n=8)Table 2 Comparison of SBP of rats in each group

注:與WKY 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05;與TAX 組相比,&P＜0.05。Note.Compared with WKY group,*P＜0.05.Compared with SHR group,#P＜0.05.Compared with TAX group,&P＜0.05.

組別Groups收縮壓(mmHg) SBP治療前Before treatment治療2 周Treatment for 2 weeks治療4 周Treatment for 4 weeks治療8 周Treatment for 8 weeks WKY 組WKY group 121.50±15.78 124.16±14.35 125.72±13.89 122.43±14.60 SHR 組SHR group 187.63±20.42* 192.05±25.84* 203.14±27.60* 209.25±23.74*TAX 組TAX group 189.14±23.56* 160.43±21.35*# 154.53±20.17# 143.01±18.96#TAX+CCT 組TAX+CCT group 185.25±21.70* 186.59±22.42* 190.26±21.58*& 194.60±25.15*&

表3 各組大鼠DBP 比較(±s,n=8)Table 3 Comparison of DBP of rats in each group

表3 各組大鼠DBP 比較(±s,n=8)Table 3 Comparison of DBP of rats in each group

注:與WKY 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05;與TAX 組相比,&P＜0.05。Note.Compared with WKY group,*P＜0.05.Compared with SHR group,#P＜0.05.Compared with TAX group,&P＜0.05.

組別Groups舒張壓(mmHg)DBP治療前Before treatment治療2 周Treatment for 2 weeks治療4 周Treatment for 4 weeks治療8 周Treatment for 8 weeks WKY 組WKY group 87.42±10.36 85.59±11.07 90.14±13.25 84.76±12.49 SHR 組SHR group 129.50±15.25* 133.26±16.32* 140.68±17.12* 137.80±15.62*TAX 組TAX group 126.38±14.40* 112.15±15.08*# 106.32±14.54# 98.23±13.27#TAX+CCT 組TAX+CCT group 127.61±16.19* 129.04±13.65* 135.19±18.05*& 130.45±17.10*&

2.2 各組大鼠心臟功能比較

與WKY 組相比,SHR 組大鼠IVSd、IVSs 顯著增加,LVEF 顯著降低(均P＜0.05);與SHR 組相比,TAX 組大鼠IVSd、IVSs 顯著降低,LVEF 顯著升高(均P＜0.05);與TAX 組相比,TAX+CCT 組大鼠IVSd、IVSs 顯著增加,LVEF 顯著降低(均P＜0.05)(圖1,表4)。

圖1 各組大鼠超聲心動圖代表性圖像Figure 1 Representative echocardiographic images of rats in each group

表4 各組大鼠IVSd、IVSs 和LVEF 比較(±s,n=8)Table 4 Comparison of IVSd, IVSs and LVEF of rats in each group

表4 各組大鼠IVSd、IVSs 和LVEF 比較(±s,n=8)Table 4 Comparison of IVSd, IVSs and LVEF of rats in each group

注:與WKY 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05;與TAX 組相比,&P＜0.05。Note.Compared with WKY group,* P ＜0.05.Compared with SHR group,#P＜0.05.Compared with TAX group,&P＜0.05.

組別Groups舒張期室間隔厚度(mm)IVSd收縮期室間隔厚度(mm)IVSs左心室射血分數(shù)(%)LVEF WKY 組WKY group 1.48±0.15 1.96±0.20 76.58±8.13 SHR 組SHR group 1.90±0.17* 2.51±0.23* 54.39±6.40*TAX 組TAX group 1.57±0.16# 2.16±0.19# 68.42±7.25#TAX+CCT 組TAX+CCT group 1.84±0.19*& 2.45±0.22*& 55.90±6.31*&

2.3 各組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)比較

與WKY 組相比,SHR 組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)顯著升高(均P＜0.05);與SHR 組相比,TAX組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)顯著降低(均P＜0.05);與TAX 組相比,TAX+CCT 組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)顯著升高(均P＜0.05)(表5)。

表5 各組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)比較(±s,n=8)Table 5 Comparison of cardiac index and left ventricular index of rats in each group

表5 各組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)比較(±s,n=8)Table 5 Comparison of cardiac index and left ventricular index of rats in each group

注:與WKY 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05;與TAX 組相比,&P＜0.05。Note.Compared with WKY group,* P ＜0.05.Compared with SHR group,#P＜0.05.Compared with TAX group,&P＜0.05.

組別Groups心臟指數(shù)(mg/g)Cardiac index左心室指數(shù)(mg/g)Left ventricular index WKY 組WKY group 3.26±0.39 2.38±0.25 SHR 組SHR group 4.15±0.44* 3.04±0.32*TAX 組TAX group 3.50±0.41# 2.52±0.29#TAX+CCT 組TAX+CCT group 4.07±0.42*& 2.93±0.30*&

2.4 各組大鼠心肌細胞橫截面積、CVF 比較

心肌組織學分析結果顯示,WKY 組心肌細胞結構正常,與WKY 組相比,SHR 組心肌細胞腫脹變性、排列稀疏,心肌細胞橫截面積、CVF 顯著升高(均P＜0.05);與SHR 組相比,TAX 組心肌細胞腫脹程度下調,心肌細胞橫截面積、CVF 顯著降低(均P＜0.05);與TAX 組相比,TAX+CCT 組心肌細胞橫截面積、CVF 顯著升高(均P＜0.05)(圖2,表6)。

圖2 心肌HE 染色、WGA 染色和Masson 染色的代表性組織學圖像Figure 2 Representative histological images of myocardial HE, WGA and Masson staining

表6 各組大鼠心肌細胞橫截面積、CVF 比較(±s,n=8)Table 6 Comparison of cardiomyocyte cross-sectional area and CVF of rats in each group

表6 各組大鼠心肌細胞橫截面積、CVF 比較(±s,n=8)Table 6 Comparison of cardiomyocyte cross-sectional area and CVF of rats in each group

注:與WKY 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05;與TAX 組相比,&P＜0.05。Note.Compared with WKY group,*P＜0.05.Compared with SHR group,#P＜0.05.Compared with TAX group,&P＜0.05.

組別Groups心肌細胞橫截面積(μm2)Myocardial cell cross-sectional area膠原容積分數(shù)(%)CVF WKY 組 WKY group 436.85±52.96 3.12±0.40 SHR 組 SHR group 1152.70±94.25* 12.79±1.53*TAX 組 TAX group 788.42±61.34*# 6.80±0.72*#TAX+CCT 組 TAX+CCT group 1094.15±85.67*& 11.45±1.38*&

2.5 各組大鼠心肌組織ANP、BNP、COL1A1 和COL3A1 mRNA 表達比較

與WKY 組相比,SHR 組ANP、BNP、COL1A1 和COL3A1 mRNA 表達顯著升高(均P＜0.05);與SHR組相 比,TAX 組ANP、BNP、COL1A1 和COL3A1 mRNA 表達顯著降低(均P＜0.05);與TAX 組相比,TAX+CCT 組ANP、BNP、COL1A1 和COL3A1 mRNA表達顯著升高(均P＜0.05)(表7)。

表7 各組大鼠心肌組織ANP、BNP、COL1A1 和COL3A1 mRNA 表達比較(±s,n=8)Table 7 Comparison of the expressions of ANP, BNP, COL1A1 and COL3A1 mRNA in myocardial tissue of rats in each group

表7 各組大鼠心肌組織ANP、BNP、COL1A1 和COL3A1 mRNA 表達比較(±s,n=8)Table 7 Comparison of the expressions of ANP, BNP, COL1A1 and COL3A1 mRNA in myocardial tissue of rats in each group

注:與WKY 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05;與TAX 組相比,&P＜0.05。Note.Compared with WKY group,*P＜0.05.Compared with SHR group,#P＜0.05.Compared with TAX group,&P＜0.05.

組別Groups心房鈉尿肽ANP B 型利鈉肽BNP I 型膠原蛋白α1 鏈COL1A1Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈COL3A1 WKY 組WKY group 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 SHR 組SHR group 2.86±0.32* 4.75±0.51* 3.60±0.39* 2.54±0.30*TAX 組TAX group 1.45±0.20*# 2.16±0.28*# 1.52±0.21*# 1.39±0.18*#TAX+CCT 組TAX+CCT group 2.67±0.29*& 4.58±0.46*& 3.43±0.35*& 2.27±0.25*&

2.6 各組大鼠心肌組織PERK-ATF4 通路相關蛋白表達比較

與WKY 組相比,SHR 組GRP78、ATF4、CHOP蛋白水平和p-PERK/PERK 比值顯著升高(均P＜0.05);與SHR 組相比,TAX 組GRP78、ATF4、CHOP蛋白水平和p-PERK/PERK 比值顯著降低(均P＜0.05);與TAX 組相比,TAX+CCT 組GRP78、ATF4、CHOP 蛋白水平和p-PERK/PERK 比值顯著升高(均P＜0.05)(圖3,表8)。

圖3 各組大鼠心肌組織PERK-ATF4 通路相關蛋白表達Figure 3 Expression of PERK-ATF4 pathway-related proteins in myocardial tissue of rats in each group

表8 各組大鼠心肌組織GRP78、PERK、p-PERK、ATF4 和CHOP 蛋白水平比較(±s,n=8)Table 8 Comparison of GRP78, PERK, p-PERK, ATF4 and CHOP protein levels in myocardial tissue of rats in each group

表8 各組大鼠心肌組織GRP78、PERK、p-PERK、ATF4 和CHOP 蛋白水平比較(±s,n=8)Table 8 Comparison of GRP78, PERK, p-PERK, ATF4 and CHOP protein levels in myocardial tissue of rats in each group

注:與WKY 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05;與TAX 組相比,&P＜0.05。Note.Compared with WKY group,*P＜0.05.Compared with SHR group,#P＜0.05.Compared with TAX group,&P＜0.05.

組別Groups GRP78 p-PERK/PERK ATF4 CHOP WKY 組WKY group 0.18±0.03 0.12±0.02 0.23±0.04 0.13±0.02 SHR 組SHR group 0.57±0.06* 0.41±0.05* 0.67±0.07* 0.38±0.04*TAX 組TAX group 0.34±0.04*# 0.24±0.03*# 0.40±0.06*# 0.21±0.03*#TAX+CCT 組TAX+CCT group 0.52±0.05*& 0.37±0.04*& 0.61±0.07*& 0.34±0.05*&

3 討論

高血壓是全球心血管疾病和過早死亡的主要危險因素。慢性高血壓引起長期左心室壓力超負荷,導致病理性心肌肥厚,最終導致心力衰竭[17]。目前,沒有有效的藥物可逆轉從病理性心肌肥厚到心力衰竭的進展。一種被廣泛接受的治療策略是在心力衰竭早期進行積極干預,抑制病理性心肌肥厚。

TAX 是一種常見的黃酮類化合物,具有清除自由基、抗氧化和抗炎作用,用于治療心腦血管疾病。據(jù)報道,TAX 可抑制心肌肥厚并減輕壓力超負荷后的心室纖維化[7-8]。與以往的研究結果一致,本研究結果顯示,TAX 在SHR 中具有抗高血壓作用,還可以改善左心室功能障礙,減輕心肌肥厚。ANP 和BNP 是心肌肥厚的常見生物標志物[18]。心臟纖維化在心肌肥厚的發(fā)病機制中起著重要作用,心臟成纖維細胞過度沉積細胞外基質蛋白,會加速心力衰竭進展[19]。膠原蛋白(Collagen I 和Collagen Ⅲ)的積累是導致心肌纖維化的主要原因。在本研究中,TAX 降低了SHR 心肌組織中ANP和BNPmRNA 水平,減輕了心臟和左心室重量;通過HE 和WGA 染色測定,TAX 降低了SHR 中增大的心肌細胞橫截面積。此外,TAX 降低了SHR 心肌組織COL1A1 和COL3A1 mRNA 表達以及CVF,表明TAX 可抑制心肌纖維化。提示,TAX 改善了與高血壓相關的心臟功能和心肌肥厚。但其潛在機制需要進一步研究。

研究顯示,ERS 誘導的心肌細胞凋亡在心肌肥厚向心力衰竭的轉變中起重要作用,減輕ERS 可減輕心肌肥厚[11-12]。在本研究中,SHR 心肌組織中GRP78、p-PERK 和ATF4、CHOP 蛋白表達水平升高,表明SHR 所致的心肌肥厚中存在ERS。ERS 主要通過GRP78 的上調啟動。GRP78 是一種與PERK 結合的分子伴侶,與GRP78 的解離是PERK信號通路激活的開始[20]。PERK 是一種I 型跨膜ER 蛋白,屬于真核生物翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)家族,是ERS反應的主要轉導因子,在正常生理情況下,PERK 與其分子伴侶-GRP78 結合形成穩(wěn)定的復合物,表現(xiàn)為活性抑制;而當ERS 錯誤折疊或未折疊蛋白增多時則促使GRP78 與PERK 解離,PERK 形成寡聚體,自體發(fā)生磷酸化被激活,活化的PERK 可直接促進其下游真核翻譯起始因子2α(eIF2α)磷酸化,從而降低細胞應激,通過抑制蛋白質合成使細胞存活[21]。PERK 可以阻斷大部分蛋白質的翻譯,但并非抑制了所有蛋白質的合成,相反的可提高細胞位于5’端非編碼區(qū)上的開放式閱讀框架的翻譯效率,上調ATF4 的表達[22]。過度或持續(xù)的ERS 則促使GRP78 與PERK 解離,PERK 形成寡聚體,發(fā)生自磷酸化被激活,可以跳過eIF2α 磷酸化,激活下游轉錄因子ATF4,進而增加CHOP 的轉錄和蛋白表達,誘導細胞死亡[23-24]。給予TAX 干預后,SHR 左心室心肌組織中ERS 生物標志物GRP78 和p-PERK、ATF4 水平,以及ERS 誘導細胞凋亡的關鍵下游因子CHOP 的表達均降低,這意味著PERK-ATF4 通路介導的ERS 可能參與了TAX 對SHR 的保護功能。

與本研究結果一致,Shu 等[25]發(fā)現(xiàn)TAX 可通過減少GRP78、p-PERK 和p-eIF2α 表達,抑制ERS 誘導的細胞凋亡, 減輕心肌缺血再灌注損傷。CCT020312 是PERK 信號的選擇性激活劑[16]。在本研究中,使用CCT020312 激活PERK 來探索TAX的作用是否依賴于對PERK 信號的抑制,結果顯示,TAX 對心臟功能和心肌肥厚的保護作用被CCT020312 部分逆轉;CCT020312 還逆轉了TAX 對ERS 的抑制作用。表明TAX 對ERS 的影響可能是由于抑制了PERK 信號。提示,TAX 可能通過抑制PERK-ATF4 通路介導的ERS,改善高血壓心肌肥厚。

綜上所述,ERS 參與了TAX 對高血壓心肌肥厚的保護作用,TAX 的作用機制可能是由PERK-ATF4信號通路介導的。本研究闡明了TAX 可通過抑制PERK-ATF4 信號通路來保護SHR 中的心肌肥厚,為TAX 對高血壓性心肌肥厚的治療作用提供了潛在的機制。但本研究尚存在一定的局限性,如未分析不同濃度TAX 的保護作用與心肌肥厚改善程度的關系。因此,尚需進一步實驗探究TAX 對心肌肥厚的保護作用是否因濃度不同而不同。